专利名称：一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。
背景技术：
原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补原则，将标记的DNA或RNA探针与经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列，在适宜条件下结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段，将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue (1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进，Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前，该技术在基因定位、多倍体起源、非整倍体鉴定以及系统进化和亲缘关系等方面均得到广泛应用。 现有的原位杂交探针包括DNA探针、寡聚核苷酸探针、RNA探针,这些探针需要信号级联放大反应才能观察结果，而且要有一定的Tm值才能保证实验的正确性和准确性。而且为了增强信号，目前多采取长的核酸序列做为探针的靶向序列或采用信号扩大系统。miRNA是短的非编码的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潜在调节子。RT-PCR、Northern印迹法以及生物芯片可以检测miRNA的表达量,但是并不能检测在单个细胞中miRNA的表达也不能在原位研究moRNA的表达，达到研究miRNA在癌细胞增殖或凋亡的机制的目的。为了验证miRNA表达的特异性以及它在癌细胞或癌组织中的定位，需要进行原位杂交。针对miRNA，因为miRNA的片段长度在18 — 22nt范围内，比较小，Tm值比较小不能满足原位杂交的需要，以上方法均不能很好的解决这些问题。目前，为了解决Tm值偏小，丹麦的一家公司生产检测miRNA的探针，他们的探针是将碱基五碳环上2’氧4’碳亚甲基连接，然后人工合成，该方法有效提高了 Tm值，但是其售价昂贵。
发明内容
为克服上述技术缺陷，并降低经济成本，本发明的目的是提供一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。为实现上述目的，采用如下的技术方案本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针，所述杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。修饰的探针是其大部分碱基进行2-F修饰，即在第2位碳原子上修饰一个氟原子，提高Tm值；用长18-22nt的序列和microRNA互补作为探针将修饰后的RNA合
并到到探针中。其中，修饰位点如下式
权利要求
1.ー种miRNA的原位杂交探针，其特征在于，所述杂交探针中的碱基的五碳环第2位碳原子修饰了 ー个氟原子。
2.根据权利要求I所述的原位杂交探针，其特征在于，所述杂交探针的序列为5’一3’AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子。
3.根据权利要求I所述的原位杂交探针，其特征在于，所述杂交探针的序列为5’一3’TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了一个氟原子。
4.根据权利要求1-3之一所述的原位杂交探针，其特征在于，所述杂交探针的5’和3’端修饰地高辛。
5.ー种含有权利要求1-3之一所述的原位杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的原位杂交检测试剂盒，其特征在于，还包括对照探针、预杂交液、封闭液和标记物。
7.根据权利要求6所述的原位杂交检测试剂盒，其特征在于，所述对照探针的序列为 5’ 一 3’ AGTCTATGGTATTCAGTACTCA ;20ml 所述预杂交液中含 20XSSC 4ml、硫酸葡聚糖.4g、去离子甲酸胺 IOml> Poly A (10mg/ml) O. 5ml、鱼精 ssDNA (10mg/ml) O. 5ml、tRNA (lOmg/ml) O. 5ml、IM ニ硫代苏糖醇(DTT) 2ml、50*Denhardt’ s 0. 2ml ;所述封闭液为PBS 中加入.0.l%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA ;所述标记物为碱性磷酸酶荧光底物。
8.如权利要求2所述的原位杂交探针在制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求3所述的原位杂交探针在制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。优选序列如SEQ ID NO:1，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。另一优选序列如SEQ ID NO:2，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。探针的5’和3’端修饰地高辛。本发明还提供了一种含有上述杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。本发明的探针可以分别应用于制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中和制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。本发明的试剂盒价格比较便宜，具有较好的特异性。
文档编号C12N15/11GK102732619SQ201210185570
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者关新元, 李江超, 李焱 申请人:中山大学肿瘤防治中心