专利名称：一种pik3ca基因突变荧光定量pcr分型检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及ー种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，尤其涉及ー种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
PIK3CA(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha)是由 Volinia 等1994年利用原位杂交技术检测到的，是新近发现的一种体细胞突变的癌基因，其可能通过參与PIK3/AKT细胞信号转导途径调节细胞的生长和凋亡。研究证明PIK3CA与多种恶性肿瘤有关，如结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌等。目前关于癌基因PIK3CA与肿瘤的关系及其致瘤机制都成为人们研究肿瘤的ー个热点。人类肿瘤的发生是ー个多基因、多机制參与的过程，癌基因PIK3CA的发现为我们研究肿瘤的发生发展提供了新的方向。研究肿瘤不同阶段中PIK3CA突变的规律及其预后的关系，对于临床早期检测肿瘤及判断预后有重要的意义。癌基因PIK3CA是在关于PI3Ks家族与肿瘤的发生关系及其机制的研究中发现的。PIK3CA基因定位于3q26. 3，长34kb，包含20个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生ー组长124kD的蛋白。PIK3CA编码I类磷脂酰肌醇_3_激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases, PI3Ks)的 p 110 催化亚单位，即 PI3Kpll0a。Broderick 等研究发现 PIK3CA 是ー种癌基因，生理情况下，基因PIK3CA在正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巣等组织中均有表达，具有调控体细胞増殖、分化、存活等许多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易检测到，而其突变后基因及其蛋白均可过度表达，可被检测到。研究表明，PIK3CA基因的突变不仅可以引起PI3Ks的催化活性增强，并且可促进细胞癌变。根据PIK3CA基因在结直肠癌中高频突变，并激活PI3K/AKT信号传导通路这ー研究成果，阻断该信号通路对AKT的磷酸化有望成为治疗结直肠癌的一条有效途径。发现PIK3CA基因突变在结肠癌癌变过程中的作用，进ー步认识癌基因PIK3CA突变作用对于揭示大肠癌发生发展的分子机制具有重要意义，为结肠癌的早期发现、早期治疗及预后提供理论依据。癌基因PIK3CA编码的蛋白PI3Kpll0a在大肠癌变不同阶段的表达差异提示检测PI3Kpll0a反应癌基因PIK3CA的突变，可成为预测肿瘤分化，判断大肠癌预后的ー个重要指标，也为临床早期警示大肠癌变提供了依据。另外，PIK3CA在宫颈癌组织中表达明显高于正常组织，PIK3CA基因的表达产物PI3Kpll0a蛋白在正常宫颈和CIN I组、CIN II组和CINIII组与宫颈浸润癌组织间均有显著性差异。说明在宫颈癌形成过程中存在PIK3CA的表达异常，而PIK3CA与宫颈不典型增生演化到宫颈癌有关，有可能成为宫颈癌早期诊断的指标。赫赛汀(Herceptin)是ー种抗HER2单克隆抗体，可选择性作用于人类表皮生长因子受体2 (HER2)，从而干扰癌细胞的生物学进程，抑制癌细胞的增生，赫赛汀用于治疗转移性乳腺癌，以及手术后的HER2阳性乳腺癌患者。研究发现赫赛汀对PIK3CA基因突变人群的疗效欠佳。PIK3CA基因突变检测可为乳腺癌患者的合理使用赫赛汀用药提供參考依据。PIK3CA热点区高突变率的发现对临床上肿瘤的诊断，预测预后和治疗有重要作用。为此，本领域技术人员也开发了一些检测PIK3CA基因突变热点区的方法和试剂，以增加肿瘤在组织学上的诊断敏感性。其中，检测PIK3CA基因突变的方法有传统的PCR-SSCP直接测序法。直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在以下缺点I、检测周期长，从标本送检到得出结果最短要48 — 72个小时左右；2、操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想(详见F项)； 3、测序结果的判读较复杂、费时(当样本量大时，此点尤为突出，详见F项)；4、检测的敏感性不够高,Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《LungCancer》上报道，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10%以下吋，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；5、一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例；6、不安全，整个实验过程要用到多种有毒物质，如EB、丙烯酰胺等，对操作者和环境都有危害；7、费用较高(每个位点约需300元)。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，一方面，本发明所解决的技术问题在于提供ー种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒。本发明的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。优选地，所述突变位点位于PIK3CA基因的第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因第1047核苷酸。其中，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少ー组针对PIK3CA基因第9外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:2所示:Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，针对PIK3CA基因第20外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID N0:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:7所示:Exon20F :5，-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3’ (SEQ ID NO:7)。优选地，所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ IDN0:8和SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列中的至少ー种Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);
Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe :5，-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9)。其中，针对PIK3CA基因第9外显子542位点突变型荧光探针序列SEQ ID NO: 3(Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’ );针对 PIK3CA 基因第 9 外显子 545 位点突变型荧光探针序列 SEQ ID NO:4(Exon9_545Probe :5’-HEX-ATT TCA GAG AGAGGA T-BHQ1-3’)。而覆盖第9外显子542位点和545位点的野生型荧光探针序列SEQ ID N0:5(Exon9-WTProbe :5’-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’)。因此，在本发明的优选实施例中，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少ー种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第9外显子的第542核苷酸和第545核苷酸碱基置换突变的混合质粒基因组DNA，其中，第542核苷酸为G — A突变，第545核苷酸也是G —A突变。另タト，针对第20外显子1047位点突变型荧光探针序列SEQ ID NO: 8(Exon20-1047MT :5’-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’)；而针对第 20 外显子 1047位点野生型荧光探针序列 SEQ ID NO:9 (Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGGT-BHQ1-3’)。因此，本发明的优选实施例中，当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:3和SEQ IDNO:4 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第20外显子的第1047核苷酸质粒基因组DNA，其中，第1047核苷酸为A —G突变。另外，需要说明的是，上述探针序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID N0:8和SEQ ID NO:9是序列表中对应核苷酸序列在标记荧光报告基团和荧光淬灭基团后的具体实现方式。在本发明的优选实施方式中，荧光探针SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQID NO: 5的Y端标记的荧光报告基团依次为FAM，HEX和TAMRA ;3’端均标记有荧光淬灭基团BHQl ;荧光探针SEQID N0:8和荧光探针SEQ ID N0:9的5'端标记的荧光报告基团依次为FAM和HEX ;3’端均标记有荧光淬灭基团BHQl当然在本发明的其他实施中，标记不同的荧光报告基团是为了荧光定量PCR能够采集到不同波长的荧光已便区分，因此采用其他本领域技术已公开的荧光报告集団和荧光淬灭基团，在不影响检测效果的情况下，也应当理解为属于本发明的保护范围。另ー方面，本发明所解决的技术问题在于提供ー种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，包括如下步骤(I)根据PIK3CA基因突变位点的多态性，设计PCR反应引物和针对PIK3CA基因突变位点的荧光探针，所述PCR反应引物扩增出的靶多核苷酸片段中包含突变位点所处PIK3CA基因区段；(2)在PCR反应体系中加入包含PCR引物的PCR混合反应液，以及所述步骤(I)中设计的荧光探针；(3)向所述的步骤(2)得到的反应体系中加入样本，进行荧光定量PCR检测。优选地，所述突变位点位于PIK3CA基因的第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因第1047核苷酸。
其中，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少ー组针对PIK3CA基因第9外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:2所示:Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，针对PIK3CA基因第20外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID N0:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID N0:7所示:Exon20F :5，-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；
Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3' (SEQ ID NO:7)。所述荧光探针包括如SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:8 和SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列中的至少ー种Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe 5' -TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9)。其中，针对PIK3CA基因第9外显子542位点突变型荧光探针序列SEQ IDNO:3(Exon9-542Probe :5’ -FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’ );针对 PIK3CA 基因第 9 外显子 545 位点突变型荧光探针序列 SEQ ID NO:4(Exon9_545Probe :5’-HEX-ATT TCA GAG AGAGGA T-BHQ1-3’)。而覆盖第9外显子542位点和545位点的野生型荧光探针序列SEQ IDN0:5(Exon9-WTProbe 5' -TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3’)。因此，在本发明的优选实施例中，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5中的至少ー种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第9外显子的第542核苷酸和第545核苷酸碱基置换突变的混合质粒基因组DNA，其中，第542核苷酸为G — A突变，第545核苷酸也是G —A突变。另タト，针对第20外显子1047位点突变型荧光探针序列SEQ ID NO: 8(Exon20-1047MT :5’ -FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3，);而针对第 20 外显子 1047 位点野生型荧光探针序列 SEQ ID NO:9 (Exon20-1047WT 5/ -HEX-TGA TGC ACG TCA TGGT-BHQ1-3’)。因此，本发明的优选实施例中，当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:3和SEQ IDNO: 4 一种或者两种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第20外显子的第1047核苷酸质粒基因组DNA，其中，第1047核苷酸为A —G突变。另外，需要说明的是，上述探针序列SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQID N0:8和SEQ ID NO:9是序列表中对应核苷酸序列在标记荧光报告基团和荧光淬灭基团后的具体实现方式。在本发明的优选实施方式中，荧光探针SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQID NO: 5的Y端标记的荧光报告基团依次为FAM，HEX和TAMRA ;3’端均标记有荧光淬灭基团BHQl ;荧光探针SEQID N0:8和荧光探针SEQ ID N0:9的5'端标记的荧光报告基团依次为FAM和HEX ;3’端均标记有荧光淬灭基团BHQl当然在本发明的其他实施中，标记不同的荧光报告基团是为了荧光定量PCR能够采集到不同波长的荧光已便区分，因此采用其他本领域技术已公开的荧光报告集団和荧光淬灭基团，在不影响检测效果的情况下，也应当理解为属于本发明的保护范围。从原理上讲，PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒是采用荧光定量PCR方法对PIK3CA基因突变进行检测。针对PIK3CA基因突变位点分别特异设计野生型TaqMan探针和突变型TaqMan探针，当遇到野生型核苷酸序列时，野生型TaqMan探针能与之结合，在PCR扩增过程中发出相应荧光信号而被检测到；而当遇到突变型核苷酸序列时，突变型TaqMan探针可与之结合，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测PIK3CA基因特定位点突变状态的目的。在本发明中提供的5’端标有荧光发光基团，3’端有荧光淬灭基团BHQl的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会 将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。相比于现有检测方法，本发明采用荧光定量PCR技术检测PIK3CA基因的突变具有以下优势I、检测灵敏度高，最低检测限为5个基因拷贝或更低，可在混有野生型基因组DNA情况下，检测出1%的突变基因，特异性好，本发明针对野生型和突变型位点分别设计了两条特异性荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低。2、线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小，目前的其他检测方法只能进行定性检测，而FQ-PCR可以实现真正的定量检测，在本发明的实施例中给出了定性检测的实施例，而通过引入对应标准品，根据标准品得到的标准曲线，即可实现对样品的准确定量。3、采用本发明的方法和试剂盒，对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果。而现有技术中的直接测序法一般需要新鲜冰冻组织，检测步骤包括送检标本一提取DNA —定性PCR扩增一验证PCR产物一纯化PCR产物一直接测序，相当繁琐，因此本发明的方法和试剂盒大大缩短了检测的时间，并降低了对标本DNA质量的要求，简化操作。4、检测时间短，从标本送检到得出结果可在60-90分钟内完成，大大优于测序方法所需要24-48小时。5、操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率。6、结果判读明确、直观；若需要亦可对结果进行定量分析。直接测序法结果的判读需将测序峰形图人工读出序列，再将所读出的序列结合基因库中的原始序列一起分析，从而得到结果，荧光定量PCR法结果的判读在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单，直观。7、检测的样本量大，通过高通量PCR仪，一次最多可检测384例，远远大于直接测序法一次试验最多可检测8-12例。8、安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
图I是荧光定量PCR检测PIK3CA基因第542位点(G — A突变)碱基置换突变的扩增曲线图；图2是荧光定量PCR检测PIK3CA基因第545位点(G — A突变)碱基置换突变的 扩增曲线图；图3是荧光定量PCR检测PIK3CA基因第1047位点(A — G突变)碱基置换突变的扩增曲线图。
图4是荧光定量PCR检测PIK3CA基因无1047位点的碱基突变野生型样本的扩增曲线图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例I :PIK3CA基因第9外显子第542 (G — A突变)和545位点(G — A突变)碱基置换突变的检测样本说明收集临床病理诊断为肠癌(腺癌)50例患者的肿瘤组织，所有患者术前均未接受过放化疗治疗，从病例标本的肿瘤组织提取基因组DNA供以下的实验应用。在此之前须首先进行测试标本的肿瘤组织含量评估，选取肿瘤细胞成分大于30%的病例用于本发明试剂盒的实施测试。设计能特异性检测PIK3CA基因第9号外显子第542 (G-A突变)和545位点(G-A突变)碱基置换突变的荧光探针各一条及公用引物一对，外加一条同时覆盖第9外显子542位点和545位点的野生型荧光探针序列。其中，PCR引物为Exon9F :5’-AGA ACA GCT CAA AGC AAT TTC TAC-3’ (SEQ ID NO:I)；Exon9R :5’-AAT CTC CAT TTT AGC ACT TAC CTG-3’ (SEQ ID NO:2)，突光探针为Exon9-542Probe :5，-FAM-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ1-3，(SEQ ID NO :3);Exon9-545Probe :5，-HEX-ATT TCA GAG AGA GGA T-BHQ1-3，(SEQ ID NO :4);Exon9-WTProbe :5，-TAMRA-TCA CTG AGC AGG AGA A-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :5);其中，SEQ ID NO: 3为检测突变型PIK3CA基因第9外显子542位点对应碱基的探针，SEQ ID NO:4为检测突变型PIK3CA基因第9外显子545位点对应碱基的探针，SEQID NO:5为覆盖第9外显子542位点和545位点的野生型荧光探针序列，荧光探针SEQ IDNO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5的5'端标记的荧光报告基团依次为FAM, HEX和TAMRA ；3’端均标记有荧光淬灭基团BHQ1。当然在本发明的其他实施中，标记不同的荧光报告基团是为了荧光定量PCR能够采集到不同波长的荧光已便区分，因此采用其他本领域技术已公开的荧光报告集团和荧光淬灭基团，在不影响检测效果的情况下，也应当理解为属于本发明的保护范围。另外，在后续述及的其他实施例中，对于荧光探针的详细描述亦参照本实施例中方案。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探针各 O. 2 μ I (20 μ M )，样品模板 DNA 2. 5 μ I (100_300ng/ μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L·荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。PCR反应条件95°C变性30sec ;并按95V 5秒，62°C 33秒，扩增反应45次循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5中的至少一种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第9外显子的第542核苷酸和第545核苷酸碱基置换突变的混合质粒基因组DNA，其中，第542核苷酸为G — A突变，第545核苷酸也是 G —A突变。如图I和2所示，在50例样本中共检测出20例样本有542位点上突变(阳性样本号为9、12、13、33、38、55)，部分阳性样本见图I ;13例样本有545位点上突变(阳性样本号为2、36、40)，部分阳性样本见图2。另外，将上述实施例I中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出PIK3CA基因相应位点基因突变型的样本，确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的PIK3CA基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法对PIK3CA基因突变分型进行检测，能够完全正确地确定PIK3CA基因第542位点和545位点的基因突变情况。实施例2 PIK3CA基因20号外显子1047位点(A — G)碱基置换突变的检测设计能特异性检测PIK3CA基因第20号外显子第1047 CA — G)位点碱基置换突变的荧光探针一条及公用引物一对，外加检测该位点的野生型荧光探针序列。其中，PCR引物为Exon20F :5’-TAC ATT CGA AAG ACC CTA GCC T-3’ (SEQ ID N0:6)；Exon20R :5’-ATC CAT TTT TGT TGT CCA GCC-3’ (SEQ ID NO:7)突光探针为Exon20-1047MT :5，-FAM-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ 1-3，(SEQ ID NO :8);Exon20-1047WT :5’-HEX-TGA TGC ACG TCA TGG T-BHQ1-3’ (SEQ ID NO:9) 其中，SEQ ID N0:B3为检测突变型PIK3CA基因第20外显子1047位点对应碱基的探针，SEQ ID N0:B4为覆盖PIK3CA基因第20外显子1047位点的野生型荧光探针序列，荧光探针SEQ ID NO:8和SEQ ID N0:9的5'端标记的荧光报告基团依次为FAM和HEX ;3’端均标记有荧光淬灭基团BHQ1。当然在本发明的其他实施中，标记不同的荧光报告基团是为了荧光定量PCR能够采集到不同波长的荧光已便区分，因此采用其他本领域技术已公开的荧光报告集团和荧光淬灭基团，在不影响检测效果的情况下，也应当理解为属于本发明的保护范围。另外，在后续述及的其他实施例中，对于荧光探针的详细描述亦参照本实施例中方案。
然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15μ1，PCR正、反引物各O. 15 μ I (20 μ M )，探针各 O. 2 μ I (20 μ M )，模板 DNA O. 5 μ I (100_300ng/μ l)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 6. 3 μ L·荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。PCR反应条件95°C变性30sec ;并按95V 5秒，62°C 33秒，扩增反应45次循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4—种或者两种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第20外显子的第1047核苷酸质粒基因组DNA，其中，第1047核苷酸为A —G突变。如图3所示，在50例样本中共检测出10例样本有1047位点的基因突变， 图3为部分的阳性样本；图4为部分无1047位点的碱基突变野生型样本FQ-PCR扩增曲线图，图4中底部灰色曲线为野生型样本扩增曲线，S形黑色曲线为内参照物扩增曲线。另外，将上述实施例2中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出PIK3CA基因1047位点基因突变型的阳性样本，确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的PIK3CA基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法对PIK3CA基因突变分型进行检测，能够完全正确地确定PIK3CA基因第1047位点的基因突变情况。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。
2.根据权利要求I所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，所述突变位点位于PIK3CA基因的第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因第1047核苷酸。
3.根据权利要求I所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少一组 针对PIK3CA基因第9外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示； 针对PIK3CA基因第20外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求I所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括如 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8 和 SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在 于，所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5中的至少一种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第9外显子的第542核苷酸和第545核苷酸碱基置换突变的混合质粒基因组DNA，其中，第542核苷酸为G — A突变，第545核苷酸也是G — A突变。
6.根据权利要求4所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在PIK3CA基因第20外显子的第1047核苷酸质粒基因组DNA，其中，第1047核苷酸为A —G突变。
7.一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)根据PIK3CA基因突变位点的多态性，设计PCR反应引物和针对PIK3CA基因突变位点的荧光探针，所述PCR反应引物扩增出的靶多核苷酸片段中包含突变位点所处PIK3CA基因区段； (2)在PCR反应体系中加入包含PCR引物的PCR混合反应液，以及所述步骤(I)中设计的荧光探针； (3)向所述的步骤(2)得到的反应体系中加入样本，进行荧光定量PCR检测。
8.根据权利要求6所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，所述突变位点位于PIK3CA基因的第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为PIK3CA基因第542和/或545核苷酸；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因第1047核苷酸。
9.根据权利要求6所述的PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少一组 针对PIK3CA基因第9外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示；针对PIK3CA基因第20外显子中突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:6所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:7所示。
10.根据权利要求6所述PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，所述荧光探针包括如 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8 和 SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测PIK3CA基因突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处PIK3CA基因区段的PCR引物。另外，本发明还公开了一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR分型检测方法，利用本发明的试剂盒对PIK3CA基因突变分型进行荧光定量PCR检测。采用本发明的技术手段，能够实现对组织中PIK3CA基因突变情况的检测，尤其能够实现对PIK3CA基因第542、545和1047核苷酸突变的快速、准确、高灵敏度检测。
文档编号C12Q1/68GK102851368SQ201210330990
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司