一种快速检测转基因水稻品系tt51-1的方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因水稻TT51-1的快速检测方法及所用引物。本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及转基因产品的检测方法，其原理是采用6条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在61℃对样品模板DNA进行扩增，短时间内扩增产物可达109-1010个拷贝。其结果鉴定可通过裸眼直接观察反应管内的颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高效、快速、简操作、高特异性等特点，为转基因水稻的快速检测提供了便捷手段。
【专利说明】—种快速检测转基因水稻品系TT51-1的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及转基因产品的检测方法，具体说是一种快速检测转基因水稻品系TT51-1的方法，通过裸眼观察反应管颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断样品中是否含有转基因水稻TT51-1的成分。
【背景技术】
[0002]自1994年第一例商业化转基因作物批准上市以来，转基因技术在全球农业领域的应用与发展就一直稳步增长。据统计，目前全球转基因作物种植面积已经持续16年连续增长，2011年全球转基因作物种植面积达到1.6亿公顷，是1996年的94倍，约占全球可用耕地面积的10%。1996年至2011年的15年间，占据世界60%人口的29个国家在种植转基因农作物，超过I亿人次种植了转基因作物，累计种植面积已超过12.5亿公顷。
[0003]TT51-1转基因水稻，即“华恢I号”品系，是由华中农大自主研发的第一批获得生产应用安全证书的转基因水稻，其核心知识产权均属于国内研发单位。2009年，转基因抗虫水稻TT51-1获得了农业部农业转基因生物安全管理办公室颁发的生产应用安全证书，批准其在湖北省进行生产和应用，这标志着我国转基因水稻产业化的开端。TT51-1所用受体品种为优良恢复系“明恢63”，抗虫基因CrylAb/Ac为中国农业科学院取得专利的融合基因，TT51-1转基因水稻的培育方法也已在我国获得了专利授权，目前“华恢I号”已向有关部门申请植物新品种权。
[0004]随着转基因作物种植面积的激增和全球转基因植物研发的加速，针对转基因生物及其产品成分的安全性问题也日益备受关注。转基因生物安全主要包括两方面内容:一方面是针对食用安全的，包括转基因作物及其产品成分中营养成分和抗营养因子的变化，特异表达蛋白的毒性和致敏性，以及目标基因漂移至肠道微生物或人体后引发的潜在风险等；另外一方面是关注由转基因作物种植过程中对生态环境安全的影响，包括对农业生态系统以及系统外生物多样性的影响，外源基因向非转基因植物和野生近缘种横向漂移及其可能带来的影响，抗生物胁迫基因对非靶标生物的影响等。
[0005]目前国际上对转基因生物产品检测及食品标识管理方面已形成部分共识性文件、评价原则及检测标准，但不同的国家和地区因国情和政策导向不同，导致对转基因产品标签的阈值范围、标识方式等管理制度上存在较大差异。例如，欧盟和中国强制实施转基因食品法规，对转基因生物实行严格的批准、标识和追踪要求；而像美国等国家采取宽松政策，实行自愿标识管理。
[0006]我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年I月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。2007年9月，为了进一步规范转基因植物安全性评价内容和方法，农业部农业转基因生物安全管理办公室发布了“转基因植物安全评价指南”，对转基因植物安全性评价内容作了进一步调整与扩充。[0007]转基因产品的检测要求方法要快速、准确、灵敏，并且还得考虑适应大样品量、目标基因种类众多等特点。因此，目前转基因作物检测的靶标物主要是外源蛋白质(基因表达产物)和外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法检测。一般从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的核酸检测方法主要有两种:核酸分子杂交技术(Sourthern blot)和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。其中PCR检测方法包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。
[0008]目前，国内外转基因检测主要使用定性PCR和实时定量PCR检测方法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过聚合酶使其在体外快速、特异地扩增目的片段。PCR检测方法能将微量、特定的DNA片段在几小时内迅速扩增至百万倍，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，因而具备快速、灵敏等优点。PCR检测方法虽然技术成熟稳定，但反应体系和操作过程比较繁杂，需要专业人员；PCR扩增仪价格昂贵，对检测环境要求高并且移动性差，不适用于现场快速检测；定性PCR扩增反应与电泳检测耗时较长，并且常用染料EB是强致癌物；定量PCR的仪器和耗材价格较高，并且需要连接电脑实时监控检测结果；以上因素均限制其作为现场快速检测的应用。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于公开一种快速检测转基因水稻品系TT51-1的方法及根据外源基因交界序列设计一套引物对其进行扩增，通过裸眼观察颜色变化或通过观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。
[0010]本发明的技术方案如下:`[0011]本发明基于转基因水稻TT51-1的边界序列信息，设计引物进行环状等温扩增从而提供检测转基因水稻TT51-1的方法。
[0012]用于检测转基因水稻TT51-1的特异性引物，其特征在于包括:
[0013]外引物正向序列:AATGACCGCTGTTATGCG；
[0014]外引物反向序列:TITTGGAACATATGAGTGGTAG；
[0015]内引物正向序列:CCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCATTGAITTGTAGAGAGAGAC；
[0016]内引物反向序列:CGAGTGCTGGGGCAGATAAGCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT；
[0017]环引物正向序列:CATGCCCGCTGAAATCACC；
[0018]环引物反向序列:GTAGTGGTGGGGCTACGAAC。
[0019]本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因水稻品系TT51-1的方法，其特征在于包括如下步骤:
[0020](I)采用权利要求1所述的6条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，61°C温育60min，而后在80°C持续2min，可使扩增产物达到IO9-1Oici个拷贝；
[0021]其中扩增反应的总体积为25yL，其各种成分分别为:10XBuffer 2.5 μ L, IOmMdNTPs 2μ L,50mM MgS042 μ L, 12.5 X BSA 2 μ L，625 μ M Calcein 2 μ L, 12.5mM MnCl2IyL,引物混合溶液lyL，8000U/ml Bst DNA聚合酶大片段I μ L，模板DNA 1-5 μ L，用灭菌去离子水补齐至25 μ L ;
[0022](2)扩增反应结束，取反应液3-25 μ L，采用不同方法判断扩增与否，包括:直接通过观察颜色变化判断有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。例如可以通过裸眼观察反应管颜色变化判断结果，橙色为阴性，绿色为阳性；或通过琼脂糖凝胶电泳判断结果，无梯度条带为阴性，有梯度条带为阳性。
[0023]本发明所述的引物混合溶液指的是将合成的引物干粉分别配制浓度为100 μ M的母液，然后取外引物F3、B3各I μ L，内引物FIP、BIP各8 μ L，环引物各LF、LB各I μ L，充分混合，制得引物混合溶液。
[0024]本发明所述的模板DNA指的是采用CTAB法提取纯化样品得到的基因组DNA。
[0025]为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
[0026]1、原理
[0027]本方法应用新型的核酸扩增方法，其原理是采用6条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在61°C反应60min，并且在80°C持续2min后终止，短时间内扩增产物可达到IO9-1Oltl个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。
[0028]2、引物设计
[0029]本研究依据转基因水稻TT51-1外源基因与内源基因结合处序列设计了 6条引物，分别是正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB。内引物长度通常超过40个碱基，外约为20个碱基。除了引物的长度、碱基组成外，还要考虑引物与靶序列的结`构因素，使引物能够更好的与模板目的基因序列结合并形成环状扩增结构。引物由上海生物工程公司合成。
[0030]表1引物序列表如下:
[0031]
【权利要求】
1.一种用于检测转基因水稻TT51-1的特异性引物，其特征在于，由外引物正向序列:5’ -AATGACCGCTGTTATGCG-3’ ；外引物反向序列:5’ -TTTTGGAACATATGAGTGGTAG-3’ ；内引物正向序列:5’ -CCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCATTGAITTGTAGAGAGAGAC-3’ ；内引物反向序列:5’ -CGAGTGCTGGGGCAGATAAGCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT-3’ ；环引物正向序列:5’ -CATGCCCGCTGAAATCACC-3’ ；环引物反向序列:5’ -GTAGTGGTGGGGCTACGAAC-3’ 组成。
2.一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因水稻TT51-1的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)采用权利要求1所述的6条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，当加入DNA模板后在61°C进行60min的恒温扩增，之后在80°C持续2min，可使扩增产物达到109-1010个拷贝； 其中扩增反应的总体积为25 μ L，其各种成分分别为:10 XBuffer 2.5 μ L，IOmMdNTPs2μ L,50mM MgS04 2 μ L, 12.5XBSA 2μ L,625yM Calcein 2 μ L, 12.5mMMnC12 lyL，弓 I 物混合溶液I μ L，8000U/ml Bst DNA聚合酶大片段I μ L，模板DNA1-5 μ L，用灭菌去离子水补齐至25yL ； (2)扩增反应结束后，取反应液3-25μ L，采用不同方法判断扩增与否，包括:直接通过裸眼观察颜色变化判断有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是将合成引物干粉分别配制成浓度为100 μ M的母液，然后取外引物F3、Β3各I μ L，内引物FIP、BIP各8 μ L，环引物LF、LB各I μ L，充分混合，制得引物混合溶液。
4.如权利要求2所述的检测方法，其中所述的模板DNA指的是采用CTAB法提取纯化样品得到的DNA，体积为1-5` μ L。
【文档编号】C12Q1/68GK103773836SQ201210408743
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月24日 优先权日:2012年10月24日
【发明者】陈锐, 王永, 兰青阔, 赵新, 朱珠, 郭永泽 申请人:天津市农业质量标准与检测技术研究所