专利名称：一种环氧化物水解酶基因(eh-b)原核表达及手性环氧氯丙烷的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的一种新型B型环氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达，利用生物手性拆分制备手性环氧苯乙烯的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
手性化合物是重要的手性配体，广泛用于各类不对称反应中，特别是在药物合成领域的应用更为广泛。手性环氧氯丙烷是一种重要的有机合成关键中间体，用以制备多种高光学纯度药物中间体和天然产物，如芳氧丙醇胺类药物、环戊酮的衍生物、抗真菌药(S)-霉康灵、阿伐他汀、L-肉碱等。目前，外消旋的环氧氯丙烷价廉易得，而手性环氧氯丙烷的价格昂贵，后者的报价基本在前者6倍以上，因此通过拆分外消旋环氧氯丙烷制备其手性单体具有很大的工业化应用前景。其拆分剐产物3-氯-1，2-丙二也是一种重要的手性合成原料。拆分外消旋环氧氯丙烷的方法可分为化学法和生物法两类化学法通常使用昂贵的S Ien-Co催化剂，可获得ee达到99%的(S)-环氧氯丙烷收率可达30%，其缺点是成本高而且环境污染严重。
环氧化物水解酶(^Epoxide hydrolase, EC, 3.3.2·-)又称环氧化物水合酶或环氧水化酶，是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1，2- 二醇的水解酶类。 在化学法和生物法制备手性纯环氧化物的方法中，酶动力学拆分法由于其高的对映体选择一直受成为广大研究者的重视。该酶广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物及微生物体内。环氧化物水解酶是一种不依赖辅因子的酶，其来源广泛，底物谱宽广，对映体选择性高，具有很高的工业化应用前景，对其研究已成为当前研究的热点。
环氧化物水解酶微生物来源广泛，但具有良好手性拆分作用的环氧化物水解酶较少，Botes等以1，2-环氧辛烷为底物从187个菌株中筛选出25个不同属的酵母具有环氧化合物水解酶活性的菌株，Yeates等以硝基环氧苯乙烯为底物从409个菌株中筛选出45 个不同属的酵母具有水解底物活性，但只有3个担子菌属菌株酵母的环氧化合物水解酶选择性较高，即毛孢子菌属(Trichosporon)、红冬孢子属(Rhodosporidium)和红酵母属 (Rhodotorula)。Furstoss 和 Archelas 等从众多菌株中筛选一株 Aspergillus niger LCP 521进行环氧化合物的不对称水解，合成了 6，7_双羟基香叶醇。目前对于环氧化物水解酶的研究，主要集中于对原始菌株培养条件的优化以增加产酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技术和蛋白质工程技术来提高环氧化物水解酶的立体选择性。
本发明来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株具有环氧化物水解酶酶活性，提供一种新型B型环氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达。基因工程环氧化物水解酶纯度高、不含其他蛋白酶，立体选择性更强；大肠杆菌表达系统具有高效胞内表达重组蛋白，成本低廉、生产率高、操作简单等优势；且由于一般底物为有机溶剂，酶分子受底物浓度抑制作用，胞内表达宿主菌包膜形成天然保护屏障，更有利于在高底物浓度下进行生物催化，适应工业化生产要求；本发明利用重组环氧化物水解酶制备手性环氧苯乙烯的研究未见报道。发明内容
本发明的目的是提供一种源于Aspergillus usamii EOOl的新型B类环氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达，利用重组环氧化物水解酶制备手性环氧苯乙烯的方法，为该环氧化物水解酶的产业化生产奠定基础。根据酶的亚细胞定位及底物的特异性将EH分为可溶性环氧化物水解酶(sEH)、微粒体环氧化物水解酶(mEH)， 保幼激素环氧化物水解酶(JhEH)，胆固醇环氧化物水懈酶(ChEH)，羟环氧烯酸水解酶 (hepoxi I inhydrolase),白三烯A4水解酶(LAH)以及朽1檬烯水解酶(LEH)七个亚家族。 生物信息学分析表明，来源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一种新型环氧化物水解酶属于微粒体环氧化物水解酶(mEH)类，属于曲霉EH中一类新型环氧化物水解酶。由于与研究较多 A. Niger LCP521EH同源性仅为56 %，将该酶命名为Aus EH-B，其相应的基因命名为Aus EH-B。Aus EH-B具有较高的催化活性和手性选择性，在手性环氧化物生产中有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。
A. usamii EOOl菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
本发明的技术方案一种源自A. usamii EOOl的新型的B类环氧化物水解酶(Aus EH-B)，其基因(Aus EH-B)成熟肽cDNA核苷酸序列为SEQ ID Ν01ο
所述的由成熟肽cDNA序列所推导的Aus EH-B氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
所述的重组Aus EH-B的活性测定方法
在1. 5mLEP管中各加入O. 85mL磷酸钾缓冲液(pH7. O)稀释适当重组酶菌液，在 30°C下预温5min，然后各加入150 μ L200mM环氧氯丙烷立即记时反应20min后。取ImL转化液加适量无水硫酸钠，振荡后离心(12000r/min，5min)，取上清液进行手性气相分析。酶活单位定义30°C下，每分钟催化IymoL外消旋环氧氯丙烷所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)，环氧化物水解酶酶活力以每毫克干菌体所含有的酶活力单位表示(U/mg)。
所述的Aus EH-B成熟肽cDNA序列的克隆和表达的方法如下
(I)从已克隆的A. usamii EOOl基因cDNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下
AuEHB-F 5/ -GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含 EcoR I 酶切位点；
AuEHB-R 5/ -GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3;，含 Not I 酶切位点；
提取A. usamii EOOl 的总 RNA,按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的说明书进行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链;以 M13Primer M4 和 AuEHB-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ;94°C，30s，51°C，30s， 72°C，80s, 30个循环；72°C，lOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AuEHB-F和AuEHB-R为引物进行第二轮PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 个循环；72°C, lOmin);将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA LadderMarker做对照,将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AusEH-B，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列。
(2)将测序结果正确的pUCm-T-AusEH-B与pET-28-a-c (+)质粒均用EcoR I和 Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pET-28a-AusEH-B，并对重组质粒进行序列测定。
(3)E. coli Rosetta(DE3)/EH-B的构建、表达、产物纯化及活性测定将 pET-28-a-AusEH-B转化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上筛选转化子。重组质粒EcoR I和Not I酶切验证。挑去阳性转化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB 培养基中，37°C振荡培养过夜，以I %的接种量转接到30mL相同培养基中，37°C振荡培养至对数生长中期(0D600为O. 6 O. 8)，加人IPTG至终浓度为O. 5mmol/L，诱导过夜。同时以未诱导工程菌及含空质粒的菌株为阴性对照。诱导结束后，收集菌体并冷冻干燥，利用手性气相色谱测定环氧化物水解酶活性。
本发明的有益效果本发明的目的是提供一种源于Aspergillus usamii EOOl的新型B类环氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达，利用重组环氧化物水解酶制备手性环氧苯乙烯的方法。生物信息学分析表明该环氧化物水解酶属于此类酶的B 类，所以命名为Aus EH-B，其相应的基因命名为Aus EH-B。产环氧化物水解酶重组菌的成功构建 ，经气相结果检测显示了较高的酶活性质以及对映体选择性。因此，在环氧氯丙烷的手性拆分动力学研究中起到重要作用。本发明为该酶的产业化生产奠定了理 论基础，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值，也为其他菌株新型环氧化物水解酶的研究奠定了理论基础。
图1 :重组质粒pET-28a-AusEH_B的构建示意图
图 2 :重组 E. coli Rosetta(DE3)/Aus EH-B 的 SDS-PAGE 电泳图具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1 A. usamii E001EH-B成熟肽cDNA序列的克隆
提取A. usamii EOOl 的总 RNA,按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的说明书进行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链;以 M13Primer M4 和 AuEHB-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ;94°C，30s，51°C，30s， 72°C，80s, 30个循环；72°C，lOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AuEHB-F和AuEHB-R为引物进行第二轮PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 个循环；72°C, lOmin);将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA LadderMarker做对照,将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AusEH-B，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列。
实施例2 Aus EH-B成熟肽基因在中E. coli Rosetta(DE3)的表达
将测序结果正确的pUCm-T-AusEH-B与pET-28-a-c (+)质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pET-28a-AusEH-B，并对重组质粒进行序列测定。
E. coli Rosetta(DE3)/EH-B的构建、表达、产物纯化及活性测定将 pET-28-a-AusEH-B转化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上筛选转化子。重组质粒EcoR I和NotI酶切验证。挑去阳性转化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB 培养基中，37°C振荡培养过夜，以I %的接种量转接到30mL相同培养基中，37°C振荡培养至对数生长中期(0D600为O. 6 O. 8)，加人IPTG至终浓度为O. 5mmol/L,诱导过夜。同时以未诱导工程菌及含空质粒的菌株为阴性对照。诱导结束后，收集菌体并冷冻干燥。经 SDS-PAGE电泳显示重组Aus EH-B的分子量为43kDa ;测定环氧化物水解酶活性达750U/mg， 手性气相柱分析rffi对(R)-环氧氯丙烷具有良好的立体选择性，生产(S)-环氧氯丙烷对映体过量 值达99 %，产率为19.8%。
权利要求
1.一种来源于Aspergillus usamii EOOl的新型B类环氧化物水解酶,其cDNA序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNO 1和SEQ IDNO :2。
2.A. usamii EOOl新型环氧化物水解酶B基因序列克隆及表达的方法 (1)从已克隆的A.usamii EOOl基因cDNA序列,然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下AuEHB-F 5/ -GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含 EcoR I 酶切位点；AuEHB-R 5/ ~GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC~3/，含 Not I 酶切位点；提取 A. usamii EOOl 的总 RNA,按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的说明书进行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和 AuEHB-F为引物进行第一轮PCR(94°C, 2min ；94°C, 30s, 51°C, 30s, 72°C,80s，30个循环；72°C，IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AuEHB-F和AuEHB-R为引物进行第二轮PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 个循环；72°C, IOmin);将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA LadderMarker做对照,将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AusEH-B，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列； (2)将测序结果正确的pUCm-T-AusEH-B与pEH-28-a-c(+)质粒均用EcoR I和NotI进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pEH-28-a-AusEH-B,并对重组质粒进彳了序列测定； (3)E.coli Rosetta(DE3)/EH-B的构建、表达、产物纯化及活性测定将pEH-28-a-AusEH-B转化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上筛选转化子；重组质粒EcoR I和Not I酶切验证；挑去阳性转化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，以I %的接种量转接到30mL相同培养基中，37°C振荡培养至对数生长中期(0D600为O. 6 O. 8)，加人IPTG至终浓度为O. 5mmol/L，诱导过夜；同时以未诱导工程菌及含空质粒的菌株为阴性对照；诱导结束后，收集菌体并冷冻干燥，测定手性气相色谱环氧化物水解酶活性。
全文摘要
本发明提出一种源于Aspergillus usamii E001的新型B类环氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表达方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，相应的氨基酸序列为SEQID NO2，相应的基因命名为Aus EH-B。手性气相柱分析rEH对(R)-环氧氯丙烷具有良好的立体选择性，生产(S)-环氧氯丙烷对映体过量值达99％。为该环氧化物水解酶的产业化生产奠定基础，对EH酶动力学拆分法研究为生物催化技术产业化制备手性环氧氯丙烷提供基础。
文档编号C12N15/55GK102994470SQ20121056263
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者李剑芳, 胡蝶, 王春娟, 朱天地, 邬敏辰 申请人:江南大学