多糖的制造方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供使用多糖合成酶制造多糖的方法，其为有效地生产多糖的方法。
【专利说明】多糖的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多糖的制造方法。
【背景技术】
[0002]作为多糖，已知有植物来源的多糖(淀粉和纤维素等)、微生物来源的多糖(黄原胶等)、高等生物来源的多糖(透明质酸、肝素和软骨素等)等各种种类的多糖。这些多糖在从药品?食品到一般エ业用途的各种用途中加以利用。
[0003]例如，透明质酸在牛的眼球、鸡冠、动物的缓冲组织、胎盘、癌细胞和皮肤等生物体组织中大量含有，为葡萄糖醛酸与N-こ酰基葡糖胺通过P 1，3键和P 1，4键交互键合而成的直链状的多糖，是分子量为IO5~IO6Da的高分子量葡糖胺聚糖。透明质酸的粘度高、具有高保湿效果，具有针对物理摩擦的润滑效果和针对细菌等的侵入的保护效果优异的性质。
[0004]透明质酸由于具有这些性质，因而作为化妆品添加剤、药品添加剂(关节炎治疗剂、创伤被覆剂、眼科手术用手术辅助剂和外科手术后的粘连阻止剂等)广泛使用。
[0005]作为透明质酸的生产方法，已知多为:
[0006](I)由上述生物体组织提取的方法(提取法)(专利文献I和2);
[0007](2)在葡萄糖等糖的存在下培养具有生成透明质酸的能力的微生物来生产透明质酸并进行回收的方法(微生物培养方法)(专利文献3和4)。
[0008]但是，由(I)的提取法得到的透明质酸中含有硫酸软骨素或硫酸化糖胺聚糖等杂质，存在为了除去它们需要复杂的精制过程的问题。
[0009]另外，在利用(2)的微生物培养方法生产透明质酸的过程中，由于随着透明质酸的生产，培养溶液的粘度会上升，因而难以进行通气搅拌。进ー步地，通气搅拌的困难使得透明质酸的生产停止。因而，微生物培养方法具有透明质酸的生产效率非常低的问题。此外，由于培养液的粘度高，因而存在所使用的微生物的除去需要复杂的精制过程的问题。进一歩地，由于微生物所具有的透明质酸分解酶会使生产出的透明质酸分解，因而还具有透明质酸的分子量不会増大、分子量的不均匀性增高等问题。
[0010]对于透明质酸以外的多糖，也同样地存在利用提取法会大量混入杂质的问题，利用微生物培养方法会具有生产效率低、分子量不会増大、分子量的不均匀性增高等问题。
[0011]因此，作为不通过由生物体组织的提取或微生物培养来进行的第3种多糖的生产方法，研究了使用多糖合成酶的方法(酶合成法)。例如，已知有使用透明质酸合成酶的方法(非专利文献I)。但是，酶合成法中需要大量的酶，具有生产效率低、生产量少等问题，因而还停留在研究水平，未进行エ业化研究。
[0012]现有技术文献`
[0013]专利文献
[0014]专利文献1:美国专利第4，141，973号说明书
[0015]专利文献2:美国专利第4，303, 676号说明书
[0016]专利文献3:日本特开昭58-056692号公报[0017]专利文献4:国际公开第86/8604355号
[0018]非专利文献
[0019]非专利文献I:The Journal of Biochemistry, 1998, Vol.273, N0.14，P8454-8458
【发明内容】
[0020]发明所要解决的课题
[0021]本发明的目的在于提供一种使用多糖合成酶制造多糖的方法，其能够有效地生产多糖。
[0022]解决课题的手段
[0023]本发明人为了达成上述目的进行了研究，结果完成了本发明。
[0024]即，本发明的多糖的制造方法为使多糖合成酶⑶作用于下述核糖核苷2磷酸-单糖㈧来制造多糖的方法，其中，在使⑶作用于㈧的时间中的10%~100%的时间内，反应溶液中的核糖核苷2磷酸的浓度小于多糖合成酶(B)的下述抑制浓度IC5tl的100倍。
[0025]抑制浓度IC5tl:在使多糖合成酶⑶作用于核糖核苷2磷酸-单糖㈧时的(B)的浓度中，使用核糖核苷2磷酸-单糖(A)作为底物、使用核糖核苷2磷酸作为抑制剂而求得的(B)的酶活性减半时的核糖核苷2磷酸的浓度。
[0026]核糖核苷2磷酸-单糖 ㈧:选自由丙糖(a-Ι)、丁糖(a_2)、戊糖(a_3)、己糖(a-4)、庚糖(a-5)和下述单糖(a_6)组成的组中的至少一种单糖(a)所具有的至少I个轻基的质子被下述化学式(I)~(5)的任意之一的官能团取代而成的糖核苷酸。
[0027]
【权利要求】
1.一种多糖的制造方法，其为使多糖合成酶(B)作用于下述核糖核苷2磷酸-単糖(A)来制造多糖的方法，其中，在使⑶作用于(A)的时间中的10%~100%的时间内，反应溶液中的核糖核苷2磷酸的浓度小于多糖合成酶(B)的下述抑制浓度IC5tl的100倍， 抑制浓度IC5tl:在使多糖合成酶(B)作用于核糖核苷2磷酸-单糖(A)时的(B)的浓度中，使用核糖核苷2磷酸-単糖(A)作为底物、使用核糖核苷2磷酸作为抑制剂而求得的(B)的酶活性减半时的核糖核苷2磷酸的浓度； 核糖核苷2磷酸-単糖(A):选自由丙糖(a-1)、丁糖(a-2)、戊糖(a_3)、己糖(a_4)、庚糖(a-5)和下述单糖(a-6)组成的组中的至少ー种单糖(a)所具有的至少I个羟基的质子被下述化学式(I)~(5)的任意之一的官能团取代而成的糖核苷酸；
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，在核糖核苷2磷酸转换酶(D)的存在下使(B)发生作用，该核糖核苷2磷酸转换酶(D)具有将核糖核苷2磷酸转化为下述化合物(C)的活性，化合物(C):选自由嘌呤碱或嘧啶碱(C-1)、核糖核苷(C-2)、核糖核苷I磷酸(C-3)、核糖核苷3磷酸(C-4)、多核糖核苷酸(C-5)、脱氧核糖核苷2磷酸(C-6)和核糖核苷2磷酸-单糖(C-7)组成的组中的至少ー种化合物。
3.如权利要求2所述的多糖的制造方法，其中，使用下述酶活性Vmax1和下述酶活性Vmax2由下述数学式(I)计算出的酶活性比(Y1)为0.1以上， 酶活性比(Y1)=VmaxyVmax2 (I) 酶活性Vmax1:核糖核苷2磷酸转换酶(D)相对于核糖核苷2磷酸的酶活性； 酶活性Vmax2:核糖核苷2磷酸转换酶(D)相对于核糖核苷2磷酸-单糖(A)的酶活性。
4.如权利要求2或3所述的多糖的制造方法，其中，使用下述酶活性Vmax1和下述酶活性Vmax3由下述数学式⑵计算出的酶活性比(Y2)为0.1以上， 酶活性比(Y2)=VmaxyVmax3 (2) 酶活性Vmax1:核糖核苷2磷酸转换酶(D)相对于核糖核苷2磷酸的酶活性； 酶活性Vma^:多糖合成酶(B)相对于核糖核苷2磷酸-单糖(A)的酶活性。
5.如权利要求2~4的任一项所述的多糖的制造方法，其中，核糖核苷2磷酸转换酶(D)为尿苷3磷酸合成酶(D4-1)，化合物(C)为尿苷3磷酸，核糖核苷2磷酸-单糖(A)为尿苷2磷酸-单糖，下述米氏常数Km小于下述抑制浓度IC5tl的100倍； 米氏常数Km:以尿苷2磷酸为底物、以(D4-1)为酶、在含磷酸基化合物(F)的存在下合成尿苷3磷酸的反应中的米氏常数；` 抑制浓度IC5tl:在使多糖合成酶⑶作用于尿苷2磷酸-单糖时的⑶的浓度中，使用尿苷2磷酸-単糖作为底物、使用尿苷2磷酸作为抑制剂而求得的(B)的酶活性减半时的尿苷2磷酸的浓度。
6.如权利要求2~5的任一项所述的多糖的制造方法，其中，多糖为透明质酸，核糖核苷2磷酸-单糖(A)为尿苷2磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷2磷酸-N-こ酰基葡糖胺，多糖合成酶(B)为透明质酸合成酶(B-1)，化合物(C)为尿苷3磷酸，核糖核苷2磷酸转换酶(D)为尿苷3磷酸合成酶(D4-1)。
7.如权利要求6所述的多糖的制造方法，其中，反应溶液中进ー步含有:含磷酸基化合物(F)、1-磷-葡萄糖醛酸、和尿苷3磷酸-单糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(G)。
8.如权利要求7所述的多糖的制造方法，其中，该制造方法中同时进行下述エ序(I)~(3): エ序(I):使透明质酸合成酶(B-1)作用于尿苷2磷酸-葡萄糖醛酸与尿苷2磷酸-N-こ酰基葡糖胺，得到透明质酸和尿苷2磷酸的エ序； エ序(2):使尿苷3磷酸合成酶(D4-1)作用于尿苷2磷酸与含磷酸基化合物(F)，得到尿苷3磷酸的エ序；和 エ序⑶:使尿苷3磷酸-単糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(G)作用于尿苷3磷酸与1-磷-葡萄糖醛酸，得到尿苷2磷酸-葡萄糖醛酸的エ序。
9.如权利要求8所述的多糖的制造方法，其中，下述米氏常数Km小于下述抑制浓度IC50 的 100 倍， 米氏常数Km:以尿苷2磷酸为底物、以(D4-1)为酶、在含磷酸基化合物(F)的存在下合成尿苷3磷酸的反应中的米氏常数；抑制浓度IC5tl:在使(B-1)作用于尿苷2磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷2磷酸-N-乙酰基葡糖胺时的(B-1)的浓度中，使用尿苷2磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷2磷酸-N-乙酰基葡糖胺作为底物、使用尿苷2磷酸作为抑制剂而求得的(B-1)的酶活性减半时的尿苷2磷酸的浓度。
【文档编号】C12P19/26GK103597088SQ201280027989
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年6月9日
【发明者】柳原芳充, 松尾健太郎, 草野美纪 申请人:三洋化成工业株式会社