具有来自IFNα2的SAR元件的表达系统的制作方法【专利摘要】来自人干扰素α2基因SAR3区域的短的人基因组核苷酸序列可容许在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，并容许产生用于产生重组蛋白的稳定克隆或稳定细胞池。虽然可以产生稳定克隆，但是产生稳定的池的能力会减少产生稳定克隆的负担。【专利说明】具有来自IFNa2的SAR元件的表达系统[0001]相关专利申请的交叉引用[0002]本申请要求2011年4月13日提交的美国临时专利申请USSN61/474，879的权益，所述申请的全部内容以引用的方式纳入本文。【
技术领域：
】[0003]本发明涉及用于增强蛋白表达的多核苷酸以及涉及包含所述多核苷酸的表达系统。【
背景技术：
】[0004]哺乳动物细胞中高水平和稳定的重组蛋白(r_蛋白)生产对于具有成本效益的生物治疗剂制造是重要的。S/MAR(支架/基质附着区)是富含AT(70%)的序列，其被认为在染色质功能中起到许多重要作用。除了其结构功能外，S/MAR在基因表达的时间和空间组织上起重要作用(Alvarez2000;Liul997)。因此，在表达载体中包括S/MAR序列可以帮助提高表达水平并防止转基因的沉默(Ph1-Vanl990;Jenke2004;Zahn-Zabal2001;Kim2004)。已经证明MAR元件可在整合到宿主基因组后或作为附加型载体的一部分起作用(Halweg2005;Girod2005)o[0005]基因组元件例如UCOE(来自Millipore)或MAR(来自Selexis)是可以利用的，并且已经证实当在用于产生稳定细胞系的表达载体中以顺式或反式提供所述元件时可增强表达水平和稳定性。在人基因组中存在可被纳入到表达载体用于增强克隆细胞系的生产力和稳定性的许多S/MAR(Giix)d2007)。但是，这些序列并没有全部都显示出有益的效果(Sass2005)并且这些序列经常非常大(1.5_4kb)，因此将其纳入到表达载体中是不实际的。需要鉴定短的(〈lkb)且仍然有效的S/MAR序列，但是实现这一目的的唯一方式是试错法。【
发明内容】[0006]现已发现来自人干扰素a2基因的SAR3区域的短的人基因组核苷酸序列可容许在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，并容许产生用于产生重组蛋白的稳定克隆或稳定细胞池。虽然可以产生稳定克隆，但是产生稳定细胞池的能力减轻了产生稳定克隆的负担。[0007]因此,在本发明的一方面中,提供了分离的多核苷酸，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。[0008]在本发明的另一方面中，提供了用于在宿主细胞中产生重组蛋白的表达系统，其包括:编码目的蛋白的基因；用于操纵所述表达系统的核苷酸序列；和，以顺式方式纳入所述表达系统中用于增强所述基因表达的表达增强子，所述表达增强子包含来自人干扰素a2上游支架附着区3(SAR3)的核苷酸序列，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。[0009]在本发明的另一方面中，提供了包含本发明的表达系统的宿主细胞。[0010]在本发明的另一方面中，提供了一种产生重组蛋白的方法，其包括:用本发明的表达系统转染宿主细胞；在适于表达所述基因的条件下培养所述宿主细胞以产生所述目的蛋白；和，回收所述目的蛋白。[0011]在本发明的另一方面中，提供了本发明的多核苷酸以顺式方式在用于产生重组蛋白的表达系统中作为表达增强子的用途。[0012]所述分离的多核苷酸包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。优选地，所述分离的多核苷酸包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少550、600、650、700或750个连续的核苷酸。所述分离的多核苷酸可以以顺式方式纳入所述表达系统中用于以所述表达系统转染的宿主细胞中增强重组蛋白表达。有利地，甚至可以在没有药物选择的情况下实现所述表达增强。[0013]所述表达系统包含用于编码目的蛋白的基因。一些具体的目的蛋白包括例如单克隆抗体(例如曲妥单抗)、红细胞生成素、干扰素、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、生长激素、胰岛素样生长因子结合蛋白、调节蛋白(例如cumate操纵子、四环素阻抑蛋白、类固醇激素受体、跨膜受体)等。目的蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白质的基因的核苷酸序列在本领域中通常是已知的。[0014]所述表达系统可以包含任何适合的载体，例如质粒载体、附加型载体(例如oriP/EBV载体)、病毒载体(例如Bacman)和粘粒载体。除其他因素外，在所述表达系统中使用的载体的类型取决于意欲使用的宿主细胞，这可由本领域技术人员容易地确定。所述载体包含多种用于操纵所述表达系统的核苷酸序列。这样的核苷酸序列包括例如启动子、复制起点(例如细菌复制起点(pMBlori)、EB(Epstein-Barr)病毒复制起点(oriP))、前导序列(例如腺病毒三联前导序列(TPL))、剪接供体(SD)、可能包括其他增强子的内含子(例如腺病毒主要晚期启动子增强子(EnhMLP))、剪接受体(SA)、选择标记(例如抗生素抗性基因)、具有限制性内切酶共有位点(优选多个限制性内切酶共有位点，例如EcoRV、ClaUSfol)的克隆位点(优选多克隆位点)以及多腺苷酸化信号(例如兔(6-珠蛋白多腺苷酸化信号(PA))等。所述表达系统优选地包含质粒载体。[0015]启动子可用于控制所述表达系统中多个编码蛋白的多核苷酸的表达。可以使用强或弱启动子。一些启动子包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40启动子(SV40p)、延伸因子Ia-HTLV(EFla-HTLV)杂合启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。选择标记使得可选择阳性转染的细胞。常见的选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如对于真核细胞有嘌呤霉素和潮霉素B，对于原核细胞有氨苄青霉素和卡那霉素。[0016]本发明的表达系统可通过任何适合的方法转染到宿主细胞中。这样的方法在本领域中通常是已知的(Kim2010)。所述宿主细胞优选地为真核细胞，更优选哺乳动物细胞，例如人胚肾293(HEK293)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK21)细胞、PerC6细胞或C0S7细胞。尤其优选人胚肾293(HEK293)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。[0017]在适于使得编码所述目的蛋白的多核苷酸表达的条件下培养转染的宿主细胞。对于已知的宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如HEK和CHO细胞)，这种条件通常是熟知的。通常在培养基中完成细胞的培养，也可通过已知方法(Hauserl997)便利地实现从培养的细胞回收目的蛋白。[0018]有利地，本发明的分离的多核苷酸在以顺式的方式纳入表达系统中时，可以增强宿主细胞中的稳定表达，使得在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，其可以与附加型表达系统(例如oriP/EBNAl系统)结合用于在没有药物选择的情况下增强表达稳定性(即使用附加型表达系统(例如oriP/EBNAl系统)产生的池在不进行选择的情况下是不稳定的)，并且使得可产生用于产生重组蛋白的稳定的池而没有产生稳定克隆的负担。[0019]在以下详细描述的过程中，本发明的其他特征将被描述或将会变得明显。【专利附图】【附图说明】[0020]为更清楚地理解本发明，现在将参考附图通过举例的方式详细描述其实施方案，其中:[0021]图1A示出了从现有技术(Strissell998中图1a)摘录的人干扰素a2基因的限制性内切酶图谱，其显示了多个支架附着区的位置，包括上游支架附着区3(SAR3)。两个EcoRI位点用“E”表示并被圈出。在所述SAR3区中由Strissel鉴定的0.7kbSAR用“j，R=70”表示，也被圈出。[0022]图1B示出了从现有技术(Strissell998中图1c)摘录的限制性内切酶图谱，其显示了人干扰素a2基因的SAR3区，并且示出了本发明的SAR(SAR-BRI)在所述图谱上的位置。[0023]图1C示出了SARIFNa的3483bp上游区域的图谱，其显示了SAR-BRI相对于所述区域中限制性位点的位置。[0024]图2示出了本发明的SAR的限制性图谱，其显示了EcoRV和SfoI限制性位点的位置。[0025]图3A示出了含有SAR-BRI的pTT54_EP0质粒的载体图谱。[0026]图3B示出了不含SAR-BRI的pTT55_EP0质粒的载体图谱。[0027]图3C示出了用pTT54-EP0和pTT55_EP0转染并表达EPO的CH0-DG44池的蛋白质印迹，转染后20天(左)和转染后60天(右)。[0028]图3D示出了在没有进行选择的情况下维持50天的pTT54-EP0克隆(+S/MAR元件)的蛋白质印迹(右泳道)对比新解冻的PTT54-EP0克隆(+S/MAR元件)的对照(Ctrl)批次的蛋白质印迹(左泳道)。[0029]图3E示出了用pTT54-EP0(上图)和pTT55_EP0(下图)转染的细胞的细胞培养物上清的斑点印迹，其中使用抗EPO的抗体检测上清中EPO的存在情况。[0030]图4A示出了含有SAR-BRI的pTT54_TZMHc质粒的载体图谱。[0031]图4B示出了不含SAR-BRI的pTT55_TZMHc质粒的载体图谱。[0032]图4C示出了不含SAR-BRI的pTT52_TZMLc质粒的载体图谱。[0033]图4D示出了比较用pTT54-TZMHc+p!T52-TZMLc和pTT55-TZMHc+p!T52-TZMLc转染并表达赫赛汀(Here印tin?)的CH0-DG44池的蛋白质印迹，转染后6天(左)和转染后25天(右)。[0034]图5A示出了含有SAR-BRI的pTT44_EG2Fc质粒的载体图谱。[0035]图5B示出了CH0-DG44-EG2Fc(克隆1A7)细胞在没有进行选择的情况下在41天中的维持时间表。[0036]图5C的曲线图示出了如图5B中进行维持，然后在第4天(第I批)转移到新培养瓶中并再培养8天的CHO细胞的细胞密度和活力。[0037]图的曲线图示出了如图5B中进行维持，然后在第36天(第2批)转移到新培养瓶中并再培养8天的CHO细胞的细胞密度和活力。[0038]图5E示出了用于确定4天和8天后第I批和第2批培养物中EG2Fc滴度的经考马斯染色的SDS-PAGE。【具体实施方式】[0039]实施例1:SAR-BRI的合成[0040]本发明的SAR(SAR-BRI)的实例示于SEQIDNO:1中，其为对应于人干扰素a2上游支架附着区3(SAR3)序列(gi11791229|gb|U82705.l|HSU82705)的碱基对数目1000-1750的751个核苷酸的序列。富含AT(73.4%)的SEQIDNO:1(38.9%A、34.5%T、12.2%C、14.4%G)被鉴定为潜在的表达隔离子(insulator)，并且协议由Geneart使用通常的已知方法合成它。所述序列具有为破坏内源的EcoRI和EcoRV限制性位点而生成的两个碱基突变(分别为C1639—G和G1695—T)。为了克隆目的，如图2所示，所述序列在5’和3’端两侧分别还侧接有EcoRV和SfoI限制性位点。[0041]以前，鉴定了来自IFN-a2的SAR3区域的0.7kb“强”SAR元件(Strissell998)。如图1A所示，该0.7kbSAR(j，R=70)位于两个EcoRI位点(圈出的E)之间。相反地，如图1B所示，本发明的SAR(SAR-BRI)位于第二个EcoRI位点的上游，恰好终止于第一个EcoRI位点之后。SAR3中SAR-BRI的位置进一步在图1C中示出，其包括3483bp的SARIFNa序列的碱基对1000-1750。从图1可以清楚地看出，本发明的SAR(SAR-BRI)不对应于由Strissel鉴定的0.7kbSAR(j，R=70)。[0042]另外，Strissell998中公开的SAR的强度是基于所述DNA片段在片状沉淀物(细胞核)级分和上清之间的再分配(repartion),如Strissel参考文献中所示:[0043]“在片状沉淀物级分中每个待分配的单独DNA片段的相对强度(R)被估计为所述沉淀中条带强度除以沉淀加上清的强度总和(R=IP/IP+IS)。根据以前公开的SAR和非-SARDNA片段确定R值，所述SAR和非-SARDNA片段都同时杂交到相同的DNA印迹(Southernblots)以设立结合亲和力标准(参见Strisseletal.1996中表1)。为强SARDNA片段设立的R值表示70%(R>70)富集到所述片状沉淀物级分中，例如B15*SAR(用…检测…”。[0044]因此，Strissel没有提供所述0.7kbSAR本身的功能性体内活性，意味着Strissell998中鉴定的SAR的体内强度是未知的。[0045]实施例2:红细胞生成素(EPO)表达质粒[0046]将实施例1中合成的SAR-BRI序列插入到pTT55_EP0载体(图3B)中位于嘌呤霉素抗性表达盒和原核复制起点(PMBl)之间的EcoRV限制性位点处，得到pTT54-EP0质粒(图3B)。pTT55-EP0质粒编码在CMV5启动子控制下的密码子优化的人红细胞生成素cDNA(Geneart)(Durocher2002;Massiel998)0[0047]将pTT55-EP0和pTT54_EP0质粒转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，并且在嘌呤霉素选择下培养所述细胞以形成稳定的CH0-DG44EP0池。为产生表达EPO的CH0-DG44池，以PEImax(Polysciences)使用Iug/ml的超螺旋质粒DNA以1:5(w:w)的DNA:PEI比例转染在CHOCD-DG44培养基(Invitrogen)中培养的细胞。然后在转染后24小时(hpt)以10Ug/ml的浓度添加嘌呤霉素。在60天中定期地用含有嘌呤霉素的新鲜培养基替换所述培养基。[0048]在转染后20天和60天后，比较了用pTT54-EP0和pTT55_EP0载体产生的池之间的EPO表达(图3C)。为达到这一目的，将细胞以0.2XIO6个细胞/ml的密度转移到新瓶的新鲜培养基中，维持所述培养物5-6天。然后使用抗EPO的抗体通过蛋白质印迹分析所述培养基的样品(图3C)。由于其广泛且非均匀的糖基化，EPO在SDS-PAGE上以多条带形式迁移(弥散)。[0049]从图3C可以明显看出，用含有本发明的SAR-BRI的pTT54_EP0转染的CHO细胞能够在较长时间内以高水平表达重组蛋白。虽然PTT54-EP0质粒和pTT55-EP0质粒都能够在转染后20天提供良好的表达(左印迹图)，但是仅具有所述SAR-BRI的PTT54-EP0在转染后60天提供显著的重组蛋白表达(右印迹图)。这证明了使用本发明的SAR使得可产生用于产生重组蛋白的稳定池而无需产生稳定的克隆。[0050]另外，将在没有进行选择的情况下维持50天的EPO克隆(+S/MAR元件)与作为对照(Ctrl)的一批新解冻的EPO克隆(+S/MAR元件)进行平行比较。蛋白质印迹(图3D)显示了两者具有相似的生产力(140mg/L)，这表明所述克隆非常稳定。[0051]此外，将来自用pTT54-EP0和pTT55_EP0载体获得的池的细胞以低细胞密度铺板在半固体培养基(Caron2009)中，不进行选择。一旦所述克隆达到4_10个细胞，就随机挑选它们并将其转移到96孔板。在培养一周后，将每个孔的上清的等分试样点在硝酸纤维素膜上，并使用抗EPO的抗体检测EPO的存在情况。从图3E可以清楚地看出，用含有所述SAR-BRI的PTT54-EP0转染的细胞时，阳性克隆数量较高(上边的斑点印迹图)。并且与没有所述SAR的克隆相比，大多数用所述SAR-BRI获得的克隆表达更多的EP0。在每个斑点印迹中，在网格位置H12中示出包含相同量EPO的沉积到所有膜上的EPO标准品。在不含所述SAR-BRI的pTT55中需要较长的曝光。[0052]这些结果证明了使用本发明的SAR使得可产生用于以高水平产生重组蛋白的稳定克隆。[0053]实施例3:赫赛汀表达质粒[0054]赫赛汀是单克隆抗体曲妥单抗(trastuzumab)的商标名。将密码子优化的赫赛汀重链cDNA(Geneart)克隆到p!T54或p!T55载体中以得到pTT54_TZMHc质粒(图4A)和pTT55-TZMHc质粒(图4B)。将赫赛汀轻链克隆到pTT52载体中以得到pTT52_TZMLc质粒(图4C)。除了用谷氨酰胺合酶基因(hGS)替换嘌呤霉素抗性基因之外，所述PTT52载体与PTT55载体相同。p!T54-TZMHc质粒含有SAR-BRI序列，而pTT55_TZMHc和pTT52_TZMLc不含SAR-BRI序列。[0055]为产生表达赫赛汀的稳定的CH0-DG44池，除了用两个载体以1:1(w:w)比例(pTT54-TZMHc+pTT52-TZMLc或pTT55-TZMHc+p!T52-TZMLc)进行共转染之外，按实施例2中针对EPO的描述转染细胞，按照针对EPO的描述进行选择。在转染后6天或25天使用抗hFc的抗体通过还原或非还原条件下的蛋白质印迹比较了所得到的池中的赫赛汀表达(图4D)。在SDS-PAGE上存在部分解开的抗体形式可能是由于培养过程中的二硫键还原，并已有记载(Trexler-Schmidt2010)。[0056]从图4D可以明显看出，用含有本发明SAR-BRI的pTT54_TZMHc转染的CHO细胞能够在较长时间内以高水平表达重组蛋白。虽然pTT54-TZMHc质粒和pTT55_TZMHc质粒都能够在转染后6天提供良好的表达(左印迹图)，但是仅具有所述SAR-BRI的pTT54-TZMHc在转染后25天提供显著的重组蛋白表达(右印迹图)。这进一步证明了使用本发明的SAR使得可以产生用于产生重组蛋白的稳定池，而无需产生稳定的克隆。因为用所述SAR-BRI序列产生的EPO池(实施例2，图3E)提供了更高频率的高表达EPO克隆，所以期望在存在所述SAR-BRI元件的情况下也会观察到更高频率的高表达赫赛汀克隆。[0057]实施例4:EG2cHCAb表达质粒[0058]将嵌合的重链抗体EG2(Zhang2009)克隆到pTT44载体中以得到pT44_EG2Fc质粒(图5A)。除了用来自牛生长激素的嘌呤霉素多腺苷酸化信号代替兔(6-珠蛋白之外，所述pT44载体与pTT54载体相同。[0059]为产生表达EG2Fc的CH0-DG44克隆，除了通过用PvuI酶进行的消化来线性化所述质粒之外，按照实施例2中针对EPO的描述转染细胞。转染后，在存在10ug/ml嘌呤霉素的情况下选择细胞，持续8天。然后，将嘌呤霉素抗性细胞以250个细胞/ml的密度铺板在半固体培养基中，而不进行嘌呤霉素选择，如先前所述(Caron2009)。通过在所述半固体培养基中包括荧光标记的抗IgG的抗体来监测EG2Fc的存在情况，并且通过荧光显微法鉴定表达高水平cHCAb的克隆并使用CellCelector?克隆米集器(clonepicker)将其转移到96孔板中(Caron2009)。[0060]如图5B所示，就高生产力选出一个克隆(1A7)，将其进一步扩大并制备原始细胞库(MasterCellBank,MCB)0从所述MCB解冻一个小瓶之后，在没有嘌呤霉素选择的悬浮液中大量培养该克隆后评估生产力。为达到这一目的，在解冻后第4天(第I批次)和第36天(第2批次)将细胞转移到新瓶中并培养8天。图5C和证明了第I批次(图5C)和第2批次(图OT)的新培养物在活力和总细胞密度方面仍然非常相似。[0061]通过SDS-PAGE和考马斯染色比较了4天和8天后在第I批次和第2批次培养物中的EG2Fc滴度(图5E)。将100mg/L纯化的EG2Fc对照(图5E中泳道2)平行地上样，用于比较目的。从图5E可以清楚地看出，在没有选择压力的情况下培养所述细胞4天后(泳道3和4)，重组蛋白表达是明显的，并且在8天后(泳道5和6)重组蛋白表达水平非常高。因为在没有进行选择的情况下，不管细胞取自早期(第4天)传代还是晚期(第36天)传代，生产力都非常类似，这证明了即使在没有药物选择压力的情况下，使用本发明的SAR也可在克隆中产生强的表达稳定性。[0062]实施例5:EB病毒(EBV)附加体中的SAR-BRI[0063]已经熟知，在没有选择压力的情况下，EBV附加体以1-4%/代的速率丢失(Lindner2007)。为增强EBV附加体的保留，迄今为止将S/MAR元件与oriP质粒结合的尝试均已失败(Giannakopoulos2009)。[0064]在培养72天后除去选择压力时，用含有oriP的pTT22_GFP载体转染的HEK293-EBNA1细胞池丢失了GFP表达。但是，在初步的未公开研究中，当除去选择压力时，在PTT22-GFP载体中包括一个或两个来自人(6-珠蛋白和/或(6-干扰素的S/MAR序列增强了附加体稳定性，因为在125天后可以观察到显著更高的GFP阳性细胞百分比(在没有选择的情况下53天)。同样，可预期当除去选择压力时，在附加型载体中包括SAR-BRI也会增强附加体稳定性。[0065]序列表:[0066]SEQIDNO:1-对应于gb#U82705.1的碱基对1000-1750的751个核苷酸[0067]AATCAGAGAAACAAAAATGTTAGAAAATTCTTGCAGGTGATTTTCAATATTGTTTTATTTTGTGCAAAAAATAATTAACCTTTTAGAAGGTCCCAGAGTATTAGAAGCCCAAACTCTGGAATATTCTCAATTTTAGTTGAGCTTTTCAGTTATTATAATATTGTATAGCTACTCATATAATTAGTAATACAAAAGATTCTGAGTCTTATTTGTAAATAAAGTTCAAAATAAGTCATATGTTATATGTTATAGGTAATCATGTTAGATATAAACCACTATTGAAAAAGATATAAAAACAAAATAACTTTATTTTTTGTTATCATATATATAGTCCATTATGTTCACATTTAGAATGATGTTAACAATTGTTTTGACATTTTTAAAATGAAAAACTCATATATCTAGTTCATGAAATTGTTAATAAACTAGAAAATATATGGACATAAAAATGACATTAGCCAAGATATGATAATGAGGCAATGGTGGCAGGGTACACAAGGCATAAAAGCCATTATTTCCCACCCAAAATGTTATGTCACATTTGTGCCTTACTCAGCTATAATTTATGTAAAAATCTGATTTGTGAATTAAGATAACTTTTTAAAAGATTGTACAAAGGTATATCTACATTTTTGAATTGAACTAGAGATGGGAATTATCATGTCGTATTAACCACTACATTAAAAACACTTAAGTATATCTAGGGCATAAAAATAAAAATCGATGTAATGGCACTTAAGATATGTATTAA[0068]参考文献:每篇参考文献的全部内容以引用的方式纳入本文。[0069]AlvarezJD，etal.(2000)TheMAR-bindingproteinSATBlorchestratestemporalandspatialexpressionofmultiplegenesduringT—celldevelopment.Genes&Development.14(5)，521-35.[0070]BodeJ,FetzerCPjNehlsenK，ScinteieM,HinrichsenB-HjBaikerA,Piechazcekc，Benhamc，LippsHJ.(2001)TheHitchhikingprinciple:Optimizingepisomalvectorsfortheuseingenetherapyandbiotechnology.GeneTherMolBiol.6，33-46.[0071]BrosiusJ.(2008)TheEffectofPutativeChromatin-OpeningElementontheMethotrexateAmplificationofCHOCells.AMajorQualifyingProjectReportSubmittedtotheWorcesterPolytechnicInstitutepublishedJanuary9,2008.[0072]CaronAWjNicolasC，GailletB，BaI,PinardM,GarnierA，MassieB,GilbertR.(2009)Fluorescentlabelinginsem1-solidmediumforselectionofmammaliancellssecretinghigh-levelsofrecombinantproteins.BMCBiotechnol.9,42.[0073]ChatellardP，lmhofM.(2005)MinimalDNASequenceActingasaChromatinInsulatoranditsUseinProteinExpression.1nternationalPatentPublicationW02005-040384publishedMay6,2005.[0074]DangQ，AutenJ,Plavec1.(2000)HumanBetaInterferonScaffoldAttachmentRegionInhibitsDeNovoMethylationandConfersLong-Term,CopyNumber-DependentExpressiontoaRetroviralVector.JournalofVirology.74(6),2671-2678.[0075]DanielIH(2006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