专利名称：一种pcrDNA疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种pcrDNA疫苗(pcrDNA疫苗，即用含有完整基因表达元件盒的PCR产物作为疫苗)及其制备方法和应用。
背景技术：
1990年，Wolff等(Wolff et al，1990)在对小白鼠进行基因治疗试验时，偶然发现DNA疫苗。1992年，美国同时有四个实验室开发研究出DNA疫苗并在同年九月的疫苗学新进展大会上同时进行了报告。自此DNA疫苗引起人们的高度重视，被认为是继减毒、灭活疫苗和亚单位疫苗之后的第三次疫苗革命。DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与含有必要表达调控元件的真核表达载体质粒重组后，将重组质粒DNA直接注入动物机体，并通过宿主细胞的转录、翻译系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗在传染性疾病、寄生虫和肿瘤的防治中显示出巨大潜力，它既是载体又能在真核细胞中表达抗原，在体内抗原的表达与自然感染相似，体内表达的抗原蛋白具有天然构象，诱导的抗体应答特征与野生病毒相似，同时诱导机体产生细胞免疫及体液免疫反应。目前已经进行了多种病原体的DNA疫苗的研究，如流感、乙型肝炎、艾滋病等，这些试验结果表明，DNA疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。因此将为长期以来无法预防或预防不理想的传染病带来希望。它与传统疫苗的区别，主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的，表达产物具有天然的构象，可按照正常的途径被加工、修饰，再提呈给免疫系统，最终引起全面的免疫反应，整个过程与病毒的自然感染或接种减毒活疫苗相同，所以核酸疫苗最大的优点既具有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又有减毒活疫苗和重组疫苗诱导全面免疫应答能力的优点。
但现有制备DNA疫苗的方法也有一些不足。最重要的是现有方法制备的DNA疫苗载体上携带有其他外源基因，如用于克隆筛选的各种抗生素基因、用于质粒复制的复制起始序列、调节基因转录或表达的增强子、提高免疫效果的免疫调节基因、标记基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因和β半乳糖甘酶基因等。由于所携带的基因或DNA序列过多，将会出现许多弊病其一是其他抗原的表达，可能对机体造成危害或不确定性；其二是因为其他基因的表达，与目的基因的表达形成了资源竞争，导致免疫效果降低；其三也是最重要的是过多其他基因或非最必须DNA序列的存在构成了很大的生物安全问题，增加了外源DNA整合到宿主基因组中的几率，增加了诱发肿瘤等问题的机会，使DNA疫苗的使用存在的不确定性大为增大；另外在有过多其他基因或非最必须DNA序列的存在的情况下，单位质量内的DNA的拷贝数相应降低，这将降低DNA疫苗的免疫效率，也将提高疫苗的生产成本，同时载体上携带的其他外源基因可能影响目的抗原蛋白加工、修饰从而形成天然构象。现有的DNA疫苗是将目的基因克隆到质粒载体上，置于真核基因启动子的控制之下，以此质粒DNA注射动物或人，刺激免疫反应，达到预防和治疗疾病的目的。理论上传统的DNA疫苗只使用超螺旋或环状的质粒DNA作为载体，并不使用线性DNA或用PCR技术扩增出的线性DNA，因此现有的DNA疫苗可以称为质粒DNA疫苗(Plasmid DNA Vaccine，pDNA Vaccine)。
发明内容
为了解决上述现有DNA疫苗技术中存在的不足之处，本发明的首要目的就是提供一种全新的DNA疫苗——命名为pcrDNA疫苗，该DNA疫苗不包括除目的基因以外的其他外源基因，即用PCR技术扩增出来的只含有真核基因转录的启动子、包含起始和终止密码子的目的基因和终止基因转录的PolyA尾巴等构成的线性DNA片段。
本发明的另一目的就是提供上述pcrDNA疫苗的制备方法。
本发明的再一目的就是提供上述pcrDNA疫苗的应用。
本发明制备的DNA疫苗不包括非目的外源基因，使用更加安全而且高效。同时使用PCR技术扩增含真核启动子、目的基因和PolyA尾巴的pcrDNA疫苗，使DNA疫苗的制备变得更加简单、迅速，适合工业化生产。
本发明使开发DNA疫苗变得更加迅速，从目的基因扩增、并克隆入专用载体到获得pcrDNA疫苗只需要24小时，使预防和治疗大规模突发性传染病更加及时有效，也为其他疾病如肿瘤基因缺陷疾病的提供了另外一种高效快速并且具有更高生物安全性的有效技术或途径。
本发明直接用含有目的基因完整表达元件的PCR产物作为DNA疫苗，构建了一套专用也是通用的用于pcrDNA疫苗的载体，设计了一对用于该载体的PCR引物，到目前为止国内外还没有报道采用真核表达元件和目的基因的DNA片段作为疫苗。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种pcrDNA疫苗的制备方法，包括如下步骤(1)通用载体pcrDNAV或通用载体pcrDNAV-T的构建将扩增出的真核生物基因转录启动子(真核转录启动子)和扩增出的真核生物基因转录终止信号序列(真核转录终止子)分别克隆至克隆载体中，并保留克隆载体的多克隆位点，获得通用载体，该通用载体命名为pcrDNAV；或由pcrDNAV进一步制备通用载体pcrDNAV-T(通用载体T载体)，命名为pcrDNAV-T(通用载体T载体)，其中克隆载体尽量选择易于操作的载体，要有合适的酶切位点等，启动子尽量选择较强的启动子。
(2)通用载体pcrDNAV或pcrDNAV-T的通用引物的设计分别在通用载体pcrDNAV或pcrDNAV-T上的真核生物基因转录启动子的上游和真核生物基因转录终止信号序列的下游设计通用引物，通用引物扩增后pcr产物包含完整的基因表达元件盒，即包括完整的真核基因转录启动子、完整的目的基因、完整的真核基因转录终止信号。
(3)含有目的基因的重组pcrDNA疫苗通用载体的构建将目的基因按基因克隆的方法克隆入pcrDNAV或pcrDNAV-T载体的多克隆位点中，获得含有目的基因的重组质粒pcrDNAV-Target或pcrDNAV-T-Target(含有目的基因的pcrDNA疫苗通用载体)，此重组质粒是制备pcrDNA疫苗的PCR反应模板。
(4)pcrDNA疫苗的扩增以pcrDNAV-Target或pcrDNAV-T-Target为模板，通用引物为引物，采用PCR扩增出完整的含有目的基因的基因表达元件盒即含有完整基因表达盒的线性DNA片段，所述线性DNA片段即为pcrDNA疫苗(pcrDNA Vaccine)，所述pcrDNA疫苗为任何包含真核生物基因转录启动子、目的基因、真核生物基因转录终止信号序列等的线性DNA疫苗(包括PCR产物或酶切片段等)，及依据其原理制备的其他DNA疫苗。
为了更好地实现本发明，所述真核生物基因转录启动子包括巨细胞病毒CMV启动子或肌动蛋白基因启动子等真核基因较强的启动子；所述真核生物基因转录终止信号序列包括SV40(猴病毒40)PolyA尾巴或牛生长激素PolyA尾巴等；所述克隆载体包括pMD 18-T载体或pUC 18载体等。
所述通用载体pcrDNAV中真核生物基因转录启动子位于克隆载体的多克隆位点的上游，真核生物基因转录终止信号序列位于克隆载体的多克隆位点的下游。
所述通用引物上游引物5’-ACAGCTATGACCATGATTACG-3’；下游引物5’-AACGACGGCCAGTGCCAAG-3’。
所述目的基因包括细菌、病毒、寄生虫或肿瘤等的目的基因，所述病毒包括猪圆环2型病毒ORF1基因、猪圆环2型病毒ORF2基因、猪圆环2型病毒ORF1+2基因、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒GP3基因、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒GP5基因或猪瘟病毒E2基因等病毒。
一种pcrDNA疫苗就是通过上述pcrDNA疫苗的制备方法制备而成。
所述的pcrDNA疫苗的制备方法可以在疫苗生产中的应用，所述的pcrDNA疫苗在人或各种动物疫病预防、肿瘤预防和治疗、基因缺陷疾病的治疗、动物生产性能的调节等中的应用。本发明具有很广泛的适用性，可以用于所有DNA疫苗、基因治疗等领域。上述DNA疫苗在人和动物中的应用，用上述pcrDNA疫苗免疫人和动物，可以起到预防和治疗人和动物的疾病如传染病、寄生虫病、肿瘤、营养代谢病及基因缺陷性等疾病的目的。疫苗的免疫途径可以通过肌肉注射、腹腔注射、滴鼻、口服等进行。DNA疫苗能在人和动物体内产生体液免疫和细胞免疫，提供有效的保护。本发明所述的DNA疫苗具有广阔的应用前景，有望成为新一代更安全的疫苗。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1.本发明制备的pcrDNA疫苗使DNA疫苗不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，具有更好生物安全性；由于其核酸片段较小，相同质量疫苗具有较高基因的拷贝数，所以单位质量内具有更高的效价。
2.本发明制备的pcrDNA疫苗通用载体及pcrDNA疫苗通用引物适用范围广，可以应用于任何病原微生物、寄生虫、肿瘤等疾病的预防和治疗。
3.本发明制备pcrDNA疫苗迅速便捷，利用pcrDNA疫苗通用载体及pcrDNA疫苗通用引物，从目的基因的获得并亚克隆到pcrDNA疫苗通用载体pcrDNAV，到制备出pcrDNA疫苗只需要24小时，对于应对传染性疾病的爆发等突发事件具有明显的优势。
4.本发明采用PCR技术制备DNA疫苗，制备工艺简单，适合大规模工业化生产。
5.本发明使DNA疫苗研发成本大为降低，更加经济。
6.本发明制备的pcrDNA疫苗与现有的DNA疫苗相比，同样可以同时诱导机体产生细胞免疫及体液免疫反应，而且诱导的抗体产生更早，产生的细胞免疫水平更高，该类DNA疫苗刺激产生的抗体比用质粒制备的DNA疫苗产生抗体更快。
图1为本发明pcrDNA疫苗通用载体的构建示意图。
图2为本发明pcrDNA疫苗的制备过程示意图。
图3为本发明pcrDNA疫苗的通用载体示意图。
图4为本发明pcrDNAV-T载体(pcrDNA疫苗通用T载体)示意图。
图5为本发明pcrDNA疫苗制备和应用的示意图。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一 pcrDNA疫苗通用载体pcrDNAV的构建(如图1所示)以pMD 18-T载体为基础，在多克隆位点加入人的巨细胞病毒启动子(CMV)和猴病毒40(SV40)的PolyA尾巴，构建含有完整基因表达元件的pcrDNA疫苗的通用载体pcrDNAV(如图3所示)。
1.将CMV的启动子和SV40 PolyA克隆进入pMD 18-T载体构建pcrDNA疫苗通用载体pcrDNAV。
(1)扩增CMV和SV40 PolyA片段的引物设计根据GenBank中的pAdTrack-CMV基因序列分别设计针对CMV启动子和SV40 PolyA基因各一对引物，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
CMV上游引物P15’-CGGAATTCATTCTTTCCCACCCTTA-3’(含有EcoR I酶切位点)CMV下游引物P25’-TTGGTACCAGATCTCTAGCGGATC-3’(含有KpnI，BgI II酶切位点)SV40 PolyA上游引物P35’-TTGCATGCTGGAGTTCGTGACCG-3’(含有Sph I酶切位点)SV40 PolyA下游引物P45’-GGAAGCTTCGCGTTAAGATACATTG-3’(含有HindIII酶切位点)(2)pMD-CMV的构建。
CMV的质粒DNA作模板，用CMV上游引物P1和CMV下游引物P2扩增CMV的CMV启动子基因，反应条件为开始94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用试剂盒回收，然后用核酸限制性内切酶EcoR I和核酸限制性内切酶Kpn I双酶切启动子PCR产物，纯化后克隆入pMD18-T载体的EcoR I和Kpn I两酶切位点间，挑取Amp(氨苄青霉素)抗性的单菌落培养，提取其中的质粒后，用EcoR I和Kpn I双酶切鉴定重组质粒，然后测序证实，将获得的重组质粒命名为pCMV。
(3)pcrDNA疫苗通用载体pcrDNAV及pcrDNAV-T的建立提取含有SV40 PolyA的质粒DNA作模板，用SV40 PolyA上游引物P3和PolyA下游引物P4扩增PolyA序列，反应条件为开始94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用试剂盒回收，然后用核酸限制性内切酶SphI和核酸限制性内切酶HindIII双酶切启动子PCR产物，纯化后克隆入前面制备好的pMD-CMV载体的Sph I和HindIII两酶切位点间，挑取Amp(氨苄青霉素)抗性的单菌落培养，提取其中的质粒后，用Sph I和HindIII双酶切鉴定重组质粒，然后测序证实，将获得的pcrDNA疫苗的通用载体命名为pcrDNAV。
(4)在通用载体pcrDNAV的基础上，用EcoRV酶切后，在dTTP存在下，用Taq DNA聚合酶在72℃反应10分钟，制备出T克隆载体，命名为pcrDNAV-T(通用载体T载体)。
实施例二 从pcrDNAV载体中扩增pcrDNA疫苗通用引物的设计在构建好的pcrDNAV疫苗通用载体的CMV启动子上游和SV40 PolyA下游设计扩增疫苗通用引物上游引物5’-ACAGCTATGACCATGATTACG-3’
下游引物5’-AACGACGGCCAGTGCCAAG-3’实施例三 pcrDNA疫苗的构建的一般过程设计引物将所需目的基因PCR扩增或用酶切方法，按常规的基因克隆的方法(酶切方法或PCR扩增方法)克隆入pcrDNA载体中(把PCR产物直接连接到pcrDNA载体的高效PCR产物连接位点或将酶切产物连接进入pcrDNA载体的多克隆位点)，获得了重组质粒pcrDNA-Target。
实施例四 用猪圆环2型病毒(PCV2)的ORF2基因构建PCV2的pcrDNA疫苗猪圆环2型病毒(PCV2)开放阅读框架2(ORF2)基因编码病毒的核衣壳蛋白Nucleocapsid(Cap)是PCV2的主要免疫原基因，可以刺激机体产生中和抗体。
根据GenBank中PCV2的基因序列设计，针对PCV2 GD毒株(AY613854)ORF2基因，其引物序列如下上游引物A15’-TTAATGACGTATCCAAGGAG-3’下游引物A25’-TACAGGGGTTAAGTGGGG-3’扩增PCV2 GD毒株ORF2基因的反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用试剂盒回收并与pcrDNAV通用载体进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，对重组质粒用酶切和序列分析进行鉴定，将获得的重组质粒命名为pcrDNAV-ORF2。
实施例五 用猪圆环2型病毒(PCV2)的ORF1基因(编码病毒复制的相关蛋白Rep)构建PCV2的pcrDNA疫苗PCV2开放阅读框架1(ORF1)基因编码病毒的多聚酶基因，参与病毒的复制。
根据GenBank中PCV2的GD毒株ORF1基因序列设计，序列如下上游引物D15’-TAAGGTACCAATGCCCAGCAAGAAGAATG-3’；下游引物D25’-TAATCTAGAATTTCATATGGAAATTCAGG-3’。
上述扩增PCV2 GD毒株ORF2基因的反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用试剂盒回收与PCR疫苗通用载体pcrDNAV进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，重组质粒进行酶切和测序鉴定，将获得的重组质粒命名为pcrDNAV-ORF1。
实施例六 用猪圆环2型病毒(PCV2)的ORF1和ORF2的融合基因ORF1+2构建PCV2的pcrDNA疫苗根据GenBank中PCV2 GD株(AY613854)的序列分别设计针对PCV2ORF1、ORF2基因的PCR引物，其引物序列如下ORF1上游引物B15’-TAAGGTACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3’(含Kpn I酶切位点)ORF1下游引物B25’-ATAACTAGTTCATTCATATGGAAATTCAG-3’(含Spe I酶切位点)ORF2上游引物C15’-TAAACTAGTATGACGTATCCAAGGAG-3’(含SpeI酶切位点)ORF2下游引物C25’-CGCTCATTGATATGGAAATTCAC-3’所述扩增PCV2 GD毒株ORF1基因的反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
ORF2基因的反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，47℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
ORF2基因PCR产物用试剂盒回收与疫苗通用载体pcrDNAV的EcoRV处进行连接，经酶切、测序确定目的基因方向，与ORF1基因PCR产物做酶切连接，使ORF1基因位于ORF2的上游；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，重组质粒进行酶切、测序鉴定，获得的重组质粒命名为pcrDNAV-ORF1+2。
实施例七 用pcrDNA疫苗通用引物扩增出猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗提取重组质粒pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1和pcrDNAV-ORF1+2，然后用pcrDNA疫苗通用引物分别对这两种质粒进行扩增，即可得到猪圆环2型病毒ORF2基因的pcrDNA疫苗、猪圆环2型病毒ORF1基因的pcrDNA疫苗和猪圆环2型病毒ORF1+2基因的pcrDNA疫苗。
反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
实施例八 猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗对小鼠的免疫试验选取6～8周健康的雌性BALB/C小鼠54只分为9组，每组6只，分别为1.生理盐水组，2.壳聚糖对照组，3.脂质体对照组，4.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF2，5.脂质体包被的pcrDNAV-ORF2，6.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF1，7.脂质体包被的pcrDNAV-ORF1，8.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF1+2，9.脂质体包被的pcrDNAV-ORF1+2。每只小鼠免疫前用24小时注射0.2％的利多卡因于后腿股四头肌，每只100μL。试验试剂注射相同部位。
壳聚糖包被的pcrDNA疫苗的制备40mg壳聚糖，加入280μL乙酸，然后加三蒸水至2mL，37℃180～200r/min摇荡过夜至壳聚糖完全溶解，溶液呈透明状。加水至190mL，用NaOH调节PH为5.5，最后定容200mL，0.22μm滤膜过滤除菌得溶液a。将pcrDNA疫苗加入50mmol/L的NaSO4溶液中至100μg/mL得到溶液b。各取等体积的溶液a、b，分别预热至50～55℃，迅速振荡混合30s，形成乳白色悬液，即壳聚糖包被的pcrDNA疫苗。将制备好的pcrDNA疫苗悬浮液室温放置1小时后，4000r/min离心30min，去除部分上清，再加无菌水定容至pcrDNA含量1μg/μL。每次每只小鼠注射100μL。
脂质体包被的pcrDNA疫苗的制备取2μg/μL的pcrDNA疫苗0.3mL与脂质体LipofectamineTM2000 0.3mL混合后室温放置15min，即形成脂质体包被的pcrDNA疫苗。pcrDNA含量为1μg/μL，每次每只小鼠注射100μL。
壳聚糖对照组用与壳聚糖包被的pcrDNA疫苗免疫组等量的壳聚糖(不含pcrDNA疫苗)免疫小鼠。
脂质体对照组用与脂质体包被的pcrDNA疫苗免疫组等量的脂质体(不含pcrDNA疫苗)免疫小鼠。
所有小鼠每两星期免疫一次，共免疫三次。
实施例九 间接ELISA法检测猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫小鼠引发特异性体液免疫反应的抗体效价免疫前及初次免疫后2、4、6、8、10周由小鼠尾部采血，分离血清。用ELISA检测试剂盒检测结果表明，pMD-CMV-PolyA-ORF2 pcrDNA疫苗、pMD-CMV-PolyA-ORF1 pcrDNA疫苗及pMD-CMV-PolyA-ORF1+2 pcrDNA疫苗均能诱发小鼠特异性抗体产生，即诱导体液免疫发生。上述疫苗试验组与生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组相比具有显著性差异。4～9组分别是生理盐水组抗体OD值的149.6％，169.7％，142.4％，164.1％，149.6％，189.9％。壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水组没有显著差异。
实施例十 检测猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫小鼠引发细胞免疫反应1、淋巴细胞转化试验取小鼠脾脏分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107/mL。试验设试验组、试验对照组和空白对照组。具体加样方法于96孔细胞培养板，每份淋巴细胞标本分两组(刺激组和对照组)，每组5个重复孔。刺激组分别加入100μL分离好的淋巴细胞、50μL 40μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)和10％小牛血清的1640培养液；对照组分别加入100μL分离好的淋巴细胞、100μL10％小牛血清的1640培养液；空白对照组每孔加入200μL10％小牛血清的1640培养液。37℃5％CO2，温育24小时，加入10μL MTT(5μg/mL)，继续培养4小时。然后每孔加入100μL 10％SDS-0.04mol/L终止液终止反应，37℃4小时后黑紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪测定OD630值。计算刺激指数(SI)，SI＝(刺激组-空白对照组)/(试验照组-空白对照组)。
结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2 pcrDNA疫苗免疫鼠脾脏淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4～9组免疫刺激指数(SI)是生理盐水组的149.3，133.7％，125.7％，129.2％，127.1％，150.6％。壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水组没有显著差异。
2、自然杀伤细胞活性(NK)检测采用2h短程释放改良法。分离小鼠脾单核细胞，10％小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整至1×106/mL，作为检测NK细胞活性的效应细胞，以SP2/0瘤细胞作为靶细胞，培养管用无菌1.5mL Eppondof管。试验设NK自然杀伤组(Mixture)、靶细胞自然释放组(Spon)、最大释放组(Max)共3组，并各设3只复管。具体加样方法100μL效应细胞和100μL靶细胞，效靶细胞浓度比例为50∶1，作为NK自然杀伤组(Mixture)；100μL靶细胞和2％小牛血清的1640培养液为靶细胞自然释放组(Spon)；100μL靶细胞和100μL 10％TritonX-100为最大释放组。加样完毕，混匀，500r/min离心2min，37℃孵育2h，然后各管加冰冷生理盐水50μL终止效靶细胞间细胞毒作用。
将试验管以3000r/min离心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反应板中进行酶促反应，100uL/孔，置37℃预温20min，各孔加入LDH底物液100uL，放于37℃恒温箱中反应10min，取出，各孔加0.1mol/L柠檬酸30uL以终止酶促反应。在酶联免疫检测仪上读取OD630值。并按以下公式计算自然杀伤细胞的自然杀伤率(％)。此百分率值与自然杀伤细胞的杀伤活性呈正相关。
自然杀伤率＝(Mixture管A630值-Spon管A630值)/(Max管A630值-Spon管A630值)结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2等疫苗免疫均能够使小鼠脾脏中NK细胞的杀伤活性明显增强。4～9组等疫苗免疫组小鼠脾脏中NK细胞的杀伤活性达到37.2％，30.4％，31.6％，34.8％，39.1％，34.8％。
3、T细胞亚群的测定制备小鼠脾单个细胞悬液6×106/L100uL，经200目钢筛过滤后1500r/min离心5min，弃上清。用荧光洗液(0.15mol/L PBS pH7.4、2％葡萄糖、0.1％BSA、0.05％NaN3)洗两遍。用荧光洗液定容100uL，分别加入PE标记的抗CD4+、FITC标记的CD8a+、PE-Cy5标记的CD3+，混均后置4℃避光30min。取出，用荧光洗液洗2遍，加入300uL荧光洗液，用流式细胞仪分析T细胞亚群。
结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2 pcrDNA疫苗免疫均能够使小鼠脾细胞中的Th亚群和Tc亚群的百分含量分别高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4～9组疫苗免疫均能够使小鼠脾细胞中的Th亚群百分含量由生理盐水组的19.3％上升到了26％，27.7％，26.1％，27.1％，27.8％，28.5％；Tc亚群的百分含量由生理盐水组的6.1％上升到了7％，6.7％，6.5％，6.4％，6.5％，7.1％。
实施例十一 猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫猪将7日龄健康仔猪分成9组，每组3头，分别为1.生理盐水组，2.壳聚糖对照组，3.脂质体对照组，4.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF2组，5.脂质体包被的pcrDNAV-ORF2组，6.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF1组，7.脂质体包被的pcrDNAV-ORF1组，8.壳聚糖包被的pcrDNAV-ORF1+2组，9.脂质体包被的pcrDNAV-ORF1+2组。每头猪分别隔离饲养，共肌肉注射3次，每次间隔2周。每组于左右颈侧部肌肉各注射1mL经壳聚糖或脂质体包被的pcrDNA疫苗，免疫剂量为1000μL。
壳聚糖包被的pcrDNA疫苗的制备40mg壳聚糖，加入280μL乙酸，然后加三蒸水至2mL，37℃180～200r/min摇荡过夜至壳聚糖完全溶解，溶液呈透明状。加水至190mL，用NaOH调节PH为5.5，最后定容200mL，真空过滤(0.22μm滤膜)除菌得溶液a。将pcrDNA疫苗加入50mmol/L的Na2SO4溶液中至100μg/mL得到溶液b。各取等体积的溶液a、b，分别预热至50～55℃，迅速振荡混合30s，形成乳白色悬液，即壳聚糖包被的pcrDNA疫苗。将制备好的壳聚糖包被的pcrDNA疫苗悬浮液室温放置1小时后，4000r/min离心30min，去除上清，再加无菌水定容至pcrDNA含量1μg/μL。每次每头猪注射1000μL。
脂质体包被的pcrDNA疫苗按以下比例配制备卵磷脂30mg、胆固醇15mg和十八胺2mg，完全溶解于15ml乙醚中形成溶液1；2000ug溶于磷酸盐缓冲液(pH7.4)3ml中形成溶液2；将溶液1和溶液2混合，超声波乳化至不分层，旋转蒸发至乙醚完全去除。定容终体积为2ml，即脂质体包被的pcrDNA疫苗。4℃保存备用，pcrDNA含量为1μg/μL，每次每头猪注射1000μL。
壳聚糖对照组用与壳聚糖包被的pcrDNA疫苗免疫组等量的壳聚糖(不含pcrDNA疫苗)免疫猪。
脂质体对照组用与脂质体包被的pcrDNA疫苗免疫组等量的脂质体(不含pcrDNA疫苗)免疫猪。
实施例十二 猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫猪的攻毒取第3代PCV2(GD株)细胞毒经鼻腔和口腔途径感染3周龄无特定病原(SPF)猪，接种量为5mL。攻毒后24天，无菌取猪的淋巴结、脾脏、肾、扁桃体，匀浆，用灭菌PBS制成1∶3(W/V)的组织悬液，以6000r/min离心取上清，加青霉素、链霉素处理后，取含毒组织悬液接种于PK15细胞，用免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)测定TCID50后，分装，冻存于-80℃冰柜备用。
IPMA测定TCID50的试验方法参照文献(Ladekjaer-Mikkelsen et al，2002)。
最后1次免疫后4周，经鼻腔和口腔途径感染106-22TCID50/mL的PCV2组织毒，每头接种5mL。
实施例十三 猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫猪的抗体水平检测分别于免疫前、第1次免疫后14天、第2次免疫后14天、第3次免疫后14天和28天，以及攻毒后1，2，3，4，5周采集各组猪的前腔静脉血，分离血清，用ELISA检测试剂盒检测血清中的PCV2特异性抗体。第3次免疫后4周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2组织毒(GD株)。结果表明，各pcrDNA疫苗免疫组猪均产生了PCV2特异性ELISA抗体和中和杭体，中和抗体效价达到1∶20以上。28天后4～9组的猪特异性抗体OD值均比生理盐水组高一倍以上，2、3组与生理盐水组没有显著差异。
实施例十四 猪圆环2型病毒pcrDNA疫苗免疫猪的细胞免疫水平的检测1、淋巴细胞增殖试验取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中。分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107/mL。试验设试验刺激组、试验对照组和空白对照组。具体加样方法于96孔细胞培养板，每份淋巴细胞标本分两组(试验刺激组和试验对照组)，每组5个重复孔。试验刺激组分别加入100μL分离好的淋巴细胞、50μL 40μg/mL的ConA和10％小牛血清的1640培养液；试验对照组分别加入100μL分离好的淋巴细胞、100μL10％小牛血清的1640培养液；空白对照组每孔加入200μL10％小牛血清的1640培养液。37℃5％CO2，温育24小时，加入10μLMTT(5μg/mL)，继续培养4小时。然后每孔加入100μL10％SDS-0.04mol/L终止液终止反应，37℃4小时后黑紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪测定OD630值。计算刺激指数(SI)，SI＝(试验刺激组-空白对照组)/(试验对照组-空白对照组)。
结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2疫苗免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4～9组免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应SI均达到2以上，与生理盐水SI值1.62相比产生显著差异。2、3组与生理盐水组没有显著差异。
2、自然杀伤细胞活性(NK)检测采用2h短程释放改良法。取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中。分离淋巴细胞，10％小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整至1×106/mL，作为检测NK细胞活性的效应细胞，以SP2/0瘤细胞作为靶细胞，培养管用无菌1.5mLEppondof管。试验设NK自然杀伤组(Mixture)、靶细胞自然释放组(Spon)、最大释放组(Max)共3组，并各设3只复管。具体加样方法100μL效应细胞和100μL靶细胞，效靶细胞浓度比例为50∶1，作为NK自然杀伤组(Mixture)；100μL靶细胞和2％小牛血清的1640培养液为靶细胞自然释放组(Spon)；100μL靶细胞和100μL 10％TritonX-100为最大释放组。加样完毕，混匀，500r/min离心2min，37℃孵育2h，然后各管加冰冷生理盐水50μL终止效靶细胞间细胞毒作用。
将试验管以3000r/min离心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反应板中进行酶促反应，100uL/孔，置37℃预温20min，各孔加入LDH底物液100uL，放于37℃恒温箱中反应10min，取出，各孔加0.1mol/L柠檬酸30uL以终止酶促反应。在酶联免疫检测仪上读取OD630值。并按以下公式计算自然杀伤细胞的自然杀伤率(％)。此百分率值与自然杀伤细胞的杀伤活性呈正相关。
自然杀伤率＝(Mixture管A630值-Spon管A630值)/(Max管A630值-Spon管A630值)结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2 pcrDNA疫苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中NK细胞的杀伤活性明显增强，均达到35％左右，显著高于对照组。
3、T细胞亚群的测定取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中。分离淋巴细胞，制备脾单个细胞悬液6×106/L 100uL，经200目钢筛过滤后1500r/min离心5min，弃上清。用荧光洗液(0.15mol/L PBS pH7.4、2％葡萄糖、0.1％BSA、0.05％NaN3)洗两遍。用荧光洗液定容100uL，分别加入PE标记的抗CD4+、FITC标记的CD8a+、PE-Cy5标记的CD3+，混均后，置4℃避光30min。取出，用荧光洗液洗2遍，加入300uL荧光洗液，用流式细胞仪分析T细胞亚群。
结果表明，pcrDNAV-ORF2、pcrDNAV-ORF1及pcrDNAV-ORF1+2 pcrDNA疫苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中的Th亚群和Tc亚群的百分含量分别高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4～9组猪外周血淋巴细胞中的Th亚群的百分含量均由生理盐水组的20％上升到近30％，Tc亚群的百分含量也略有升高。
实施例十五 用猪瘟病毒E2主要抗原区的基因构建猪瘟病毒的pcrDNA疫苗根据猪瘟病毒株广东流行株序列，设计1对引物，并以包含E2全基因组的重组质粒pMD-E2为模板，扩增出含E2基因的主要抗原区，其引物序列如下上游引物D15’-TGCCGATACTTGGCATCATTG-3′下游引物D25′-TGCCCCCAACTTACAGTAGAA-3′扩增猪瘟病毒E2主要基因的反应条件为94℃预变性5min，然后以94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用试剂盒回收并与pcrDNAV通用载体进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，对重组质粒用酶切和序列分析进行鉴定，将获得的重组质粒命名为pcrDNAV-E2。
以pcrDNAV-E2为模板，用pcrDNA疫苗通用引物扩增出猪瘟病毒pcrDNA疫苗(反应条件与实施例七相同)。
用猪瘟病毒pcrDNA疫苗免疫猪并检测体液和细胞免疫。(免疫及检测方法见实施例十一，十二，十三，十四)结果表明，各pcrDNA疫苗免疫组猪均产生了PCV2特异性ELISA抗体和中和杭体，中和抗体效价达到1∶25以上。30天后猪瘟病毒pcrDNA疫苗免疫猪的特异性抗体OD值均比生理盐水组高一倍以上，差异显著。猪瘟病毒pcrDNA疫苗免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。实验组免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应SI均达到2.2，与生理盐水SI值1.59相比产生显著差异。壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水组没有显著差异。疫苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中NK细胞的杀伤活性明显增强，均达到43％左右，显著高于对照组。实验组猪外周血淋巴细胞中的Th亚群的百分含量均由生理盐水组的18％上升到近35％，Tc亚群的百分含量也略有升高。
实施例十六 分别用编码猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白的基因GP3、GP5构建猪繁殖与呼吸障碍综合征病pcrDNA疫苗根据美洲株ATCC VR-2332序列设计2对引物，其引物序列如下GP5引物E15’TTGATGTTGGGGAAATGCTTGAC3’E25’TTAAGAAGTCATCTAAGGAC3’GP3引物F15’TTAATGGCTAATAGCTGTAC3’F25’TTATCATCGCCGTGCGGCACTGAG3’按One Step RNA PCR试剂盒(AMV)说明进行RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病GP3、GP5基因，反应条件均为50℃30min，94℃2min，94℃1min，62℃1min，72℃2min，72℃10min，共35个循环。
PCR产物用试剂盒回收并与pcrDNAV通用载体进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，对重组质粒用酶切和序列分析进行鉴定，将获得的重组质粒命名为pcrDNAV-GP5、pcrDNAV-GP3。
分别以pcrDNAV-GP5、pcrDNAV-GP3为模板，用pcrDNA疫苗通用引物扩增出二种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒pcrDNA疫苗(反应条件与实施例七相同)。
分别用二种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒pcrDNA疫苗免疫猪并检测体液和细胞免疫(免疫及检测方法见实施例十一，十二，十三，十四)。
结果表明，各pcrDNA疫苗免疫组猪均产生了PCV2特异性ELISA抗体和中和杭体，中和抗体效价达到1∶25以上。30天后二种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒pcrDNA疫苗免疫猪的特异性抗体OD值均比生理盐水组高1.5倍以上，差异显著。二种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒pcrDNA疫苗免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。实验组免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应SI均达到2.2，与生理盐水SI值1.5相比产生显著差异。壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水组没有显著差异。疫苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中NK细胞的杀伤活性明显增强，均达到40％左右，显著高于对照组。实验组猪外周血淋巴细胞中的Th亚群的百分含量均由生理盐水组的18％上升到近36％，Tc亚群的百分含量也略有升高。
实施例十七 pcrDNA疫苗的应用本发明的DNA疫苗在人和动物中的应用，用上述pcrDNA疫苗免疫人和动物，可以起到预防和治疗人和动物的疾病如传染病、寄生虫病、肿瘤、营养代谢病及基因缺陷性等疾病的目的。疫苗的免疫途径可以通过肌肉注射、腹腔注射、滴鼻、口服等进行。DNA疫苗能在人和动物体内产生体液免疫和细胞免疫，提供有效的保护。本发明所述的DNA疫苗具有广阔的应用前景，有望成为新一代更安全的疫苗。
权利要求
1.一种pcrDNA疫苗的制备方法，包括如下步骤(1)通用载体pcrDNAV或通用载体pcrDNAV-T的构建将扩增出的真核生物基因转录启动子和扩增出的真核生物基因转录终止信号序列分别克隆至克隆载体中，并保留克隆载体的多克隆位点，获得通用载体，该通用载体命名为pcrDNAV；或由pcrDNAV进一步制备通用载体T载体，命名为pcrDNAV-T；(2)通用载体pcrDNAV或pcrDNAV-T的通用引物的设计分别在通用载体pcrDNAV或pcrDNAV-T上的真核生物基因转录启动子的上游和真核生物基因转录终止信号序列的下游设计通用引物，通用引物扩增后pcr产物包含完整的基因表达元件盒；(3)含有目的基因的重组pcrDNA疫苗通用载体的构建将目的基因按基因克隆的方法克隆入pcrDNAV或pcrDNAV-T载体的多克隆位点中，获得含有目的基因的重组质粒pcrDNAV-Target或pcrDNAV-T-Target；(4)pcrDNA疫苗的扩增以pcrDNAV-Target或pcrDNAV-T-Target为模板，通用引物为引物，采用PCR扩增出完整的含有目的基因的基因表达元件盒即含有完整基因表达盒的线性DNA片段，所述线性DNA片段即为pcrDNA疫苗。
2.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述真核生物基因转录启动子包括巨细胞病毒CMV启动子或肌动蛋白基因启动子。
3.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述真核生物基因转录终止信号序列包括SV40PolyA尾巴或牛生长激素PolyA尾巴。
4.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述克隆载体包括pMD 18-T载体或pUC18载体。
5.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述通用载体pcrDNAV中真核生物基因转录启动子位于克隆载体的多克隆位点的上游，真核生物基因转录终止信号序列位于克隆载体的多克隆位点的下游。
6.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述通用引物上游引物5’-ACAGCTATGACCATGATTACG-3’；下游引物5’-AACGACGGCCAGTGCCAAG-3’。
7.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括细菌、病毒、寄生虫或肿瘤的目的基因，所述病毒包括猪圆环2型病毒ORF1基因、猪圆环2型病毒ORF2基因、猪圆环2型病毒ORF1+2基因、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒GP3基因、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒GP5基因或猪瘟病毒E2基因。
8.根据权利要求1所述的pcrDNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述pcrDNA疫苗为包含真核生物基因转录启动子、目的基因、真核生物基因转录终止信号序列的线性pcrDNA疫苗。
9.一种pcrDNA疫苗通过权利要求1～8任一项所述的pcrDNA疫苗的制备方法制备而成。
10.权利要求9所述的pcrDNA疫苗在人或动物疫病预防、肿瘤预防和治疗、基因缺陷疾病的治疗、动物生产性能调节中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新型DNA疫苗——pcrDNA疫苗的制备原理和技术。pcrDNA疫苗是将携带有完整的基因表达元件的PCR产物直接作为DNA疫苗，该DNA疫苗不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，具有更好生物安全性；单位质量内具有更高的效价；该疫苗刺激产生的抗体较用质粒制备的DNA疫苗产生抗体更快；采用PCR技术制备DNA疫苗，工艺简单，便于大规模工业化生产。本发明还公开了上述pcrDNA疫苗在人和动物中的应用，pcrDNA疫苗免疫人和动物，可以起到预防和治疗人和动物的疾病如传染病、寄生虫病、肿瘤、营养代谢病及基因缺陷性疾病等及其他应用目的。
文档编号A61P43/00GK1850279SQ20061003386
公开日2006年10月25日 申请日期2006年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者宋长绪, 张洪利, 王建龙, 黄忠, 蒋智勇 申请人:广东省农业科学院兽医研究所