靛玉红衍生物在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：靛玉红衍生物在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用的制作方法
专利说明靛玉红衍生物在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用 本发明涉及靛玉红衍生物(IO)在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用，特别是在制备治疗帕金森病药物中的应用。帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一种常见的，以黑质、纹状体和核团的多巴胺能神经元进行性丢失为特征的神经系统变性疾病。程序化细胞死亡(即凋亡)在帕金森病的神经元变性过程中发挥重要作用。临床上对帕金森病的治疗主要是给予多巴胺前体药左旋多巴跟外周脱羧酶抑制剂联合对症治疗以缓解帕金森病的症状。近年来研究大热的还有帕金森病的基因治疗和干细胞治疗。但由于基因治疗存在着靶基因选择、载体和基因可控性问题；干细胞治疗存在着移植干细胞大量凋亡以至不能产生治疗浓度的多巴胺等问题，使得后两种方法现在还只是处于研究阶段。所以目前临床上对帕金森病的治疗主要还是依赖于药物。但是，由于左旋多巴的应用只是对症治疗，并不能有效地控制帕金森病的自然病变进程，而且还有许多严重的副作用，例如开关现象和运动障碍。更令人失望的是，左旋多巴的治疗作用只能维持两年左右。如果长期使用，左旋多巴还会损伤神经元，加速神经元的凋亡。因此，现在迫切需要能够有效控制帕金森病病程的神经元保护性药物一方面既能抑制“原发性”黑质多巴胺神经元进行性丢失，另一方面又能保护性干预左旋多巴引起的“药源性”神经元凋亡，从而达到有效治疗帕金森病的目的。
既然黑质多巴胺神经元进行性凋亡是帕金森病(PD)发生的根本原因，那么，怎样有效地保护性干预多巴胺神经元凋亡的发生就成为治疗帕金森病的关键。申请人根据JNK是帕金森病黑质多巴胺神经元凋亡的关键性激酶这一事实，确定以c-Jun N-末端激酶(Jun N-terminalkinase，JNK)为靶点治疗帕金森病。实验证实JNK介导了黑质多巴胺神经元凋亡并参与帕金森病的发生；JNK抑制剂SP600125通过抑制黑质多巴胺神经元凋亡而发挥治疗帕金森病动物的作用。然而，JNK通路并非介导黑质多巴胺神经元凋亡的单一信号通路。已有多篇报道证明细胞周期素依赖激酶5(cyclin-dependent kinase5，CDK5)在多巴胺神经元凋亡中发挥重要作用。最近，申请人还首次观察到促凋亡激酶——糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)介导了黑质多巴胺神经元凋亡；抑制GSK3β对原代培养的黑质多巴胺神经元的凋亡具有保护性干预作用、对帕金森病动物具有治疗作用。这些研究表明，GSK3β在帕金森病发生中发挥重要作用，可能成为潜在的治疗帕金森病的新的药物靶点。
由此可见，促凋亡激酶JNK、CDK5和GSK3β均参与了多巴胺神经元凋亡的发生，同时阻断这几个激酶将能达到有效治疗帕金森病和其它神经退行性变疾病的目的。因此，申请人提出了以JNK/CDK5/GSK3β为靶点治疗上述疾病的新方案。
以JNK/CDK5/GSK3β为靶点治疗帕金森病和其它神经退行性变疾病的最简单的方法就是联合使用这三种激酶的抑制剂，但最理想的方法莫过于“一石三鸟”——即以单一药物同时阻断这三个关键的促凋亡激酶。因此，找到符合这一标准的抑制剂便成了完成本发明技术方案的关键。本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种能同时阻断JNK/CDK5/GSK3β这三种促神经细胞凋亡激酶的抑制剂，为帕金森病的治疗开拓新思路、新方法；为帕金森病和其它神经退行性变疾病治疗提供一类全新药物。
中药青黛以往被用于抗白血病的治疗。申请人的前期工作证明我国中药青黛中可提取出一个单体靛玉红(Indirubin)，其衍生物Indirubin-3’-oxime(IO)是JNK/CDK5/GSK3β的抑制剂。
靛玉红衍生物(IO)，化学结构如下所示
本发明的目的是这样实现的靛玉红衍生物(IO)在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用。
靛玉红衍生物(IO)在制备治疗帕金森病药物中的应用。
本发明旨在以靛玉红衍生物为抑制剂，以它抑制的三种介导凋亡的激酶——JNK/CDK5/GSK3β为明确靶点，创新性地研究和开发出一类靶点明确、毒性小、特异性高、作用强的治疗帕金森病和其它神经退行性变疾病的新药物，提高上述疾病患者的生活质量，为家庭和社会解除沉重负担，具有巨大的社会效益，并能创造巨大的经济效益。

图1.靛玉红衍生物(IO)保护了MPTP诱导的黑质多巴胺能神经元的丢失。
图2.靛玉红衍生物(IO)提高了MPTP降低的纹状体多巴胺水平。
图3.靛玉红衍生物(IO)改善了帕金森病小鼠的行为学异常。
图4.靛玉红衍生物(IO)抑制MPP+诱导的体外培养黑质多巴胺能神经元。1.靛玉红衍生物(IO)抗帕金森病实验动物多巴胺神经元凋亡分析(细胞实验)
神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导帕金森病动物模型建立及靛玉红衍生物(IO)抗动物多巴胺能神经元凋亡分析按照实施例1进行。
2.靛玉红衍生物(IO)抗体外多巴胺神经元凋亡分析(细胞实验)体外黑质多巴胺神经元培养以及抑制剂神经元凋亡分析仍然按照实施例2进行。
实施例1.
靛玉红衍生物(IO)对MPTP诱导的C57小鼠帕金森病动物模型中脑腹侧黑质多巴胺能神经元凋亡有保护性干预作用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)是一种白色粉末状神经毒素，可特异地破坏多巴胺神经细胞，从而损害大脑内黑质纹状体通路，使人与动物出现酷似帕金森病的症状。MPTP用生理盐水配成所需浓度。
参照Tatton N.A.和Kish S.J.等的实验方法(Neuroscience，1997；771037-1048)，选取雄性C57BL/6N型小鼠90只，随机分为生理盐水(NS)组、MPTP(M)组、MPTP+IO三个剂量组，每组15只。实验第一天，IO组分别腹腔注射0.3mg/ml、1mg/ml、3mg/ml IO10ml/kg，NS组和M组均腹腔注射3％DMSO 10ml/kg；第二天IO组先腹腔注射IO(剂量均同第一天)，其余组腹腔注射3％DMSO10ml/kg。30min后IO组、M组一起腹腔注射6mg/ml MPTP 5ml/kg，NS组腹腔注射等容量的生理盐水，连续5天(共6天)。在MPTP注射的第二天，MPTP注射后仔细观察并记录实验动物出现震颤麻痹症状的潜伏期和维持时间。潜伏期自注射MPTP完毕开始至出现震颤麻痹症状为止；维持时间自出现震颤麻痹症状开始至震颤麻痹症状完全消失为止。在MPTP末次注射第7天，每实验组取两只小鼠，用10％水合氯醛麻醉后，从左心室进针进入主动脉，顺序灌注血管冲洗液和4％PFA各50ml。血管冲洗液成分为PBS 1000ml，1％NaNO22ml，肝素0.02g和NaCl 9g。小鼠断头取全脑，在4％PFA中室温浸泡2小时后转移至30％蔗糖溶液中4℃过夜。利用冰冻切片机于黑质致密部切取35μm的脑片，悬浮于24孔板内的PBS液中。每隔5片取一片做ABC染色以检测黑质神经元内酪氨酸羟化酶(TH)的含量。分析黑质内残存神经元的情况；MPTP末次注射后第10天，各实验组的小鼠在完成了行为学的检测后，颈椎脱臼致死。取全脑，沸水中煮2分钟后，小心地剥离纹状体，称重后保存于-70℃，准备利用高效液相分析纹状体内多巴胺含量。
观察指标有黑质残存多巴胺神经元计数，纹状体多巴胺含量和行为学的评分。
(1)靛玉红衍生物(IO)保护了MPTP诱导的黑质多巴胺能神经元的丢失图1为IO保护了MPTP诱导的黑质多巴胺能神经元的丢失的实验结果图。
多巴胺神经元以酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化来鉴定。MPTP末次注射后第7天，各实验组中脑组织固定后切成厚度为35μm的冰冻切片。(a)溶剂对照组；(b)MPTP处理组；(c-e)MPTP和不同浓度的IO处理组。注意MPTP注射后，黑质TH阳性细胞数目明显减少(a vs.b)，而IO可浓度依赖地增加黑质TH阳性细胞的数目(c-e)。图片来源于三次独立实验(放大40×)。(f)计数和统计结果。结果显示IO在浓度为3，10，30mg/kg就可明显保护MPTP诱导的TH阳性细胞，使其不致凋亡(图1f，p＜0.01，IO和MPTP组相比)。
在MPTP末次注射后7天，用ABC法检测黑质内残余多巴胺神经元的数目。结果发现与溶剂对照组相比，MPTP导致黑质内多巴胺神经元的大量丢失(图1.b)，大约只残留对照组的50.06±6.35(P＜0.01)(图1.f)；而IO以浓度依赖性的方式减少了因MPTP毒性所引起的多巴胺神经元的丢失(图1.c-e)。在IO的高浓度组(30mg/kg)，黑质内多巴胺神经元的数目与溶剂对照组的相近，即达到了正常水平。
(2)靛玉红衍生物(IO)提高了MPTP降低的纹状体多巴胺水平图2为IO提高了MPTP降低的纹状体多巴胺水平的结果图。其中图2A为计数图，图2B为对数量效曲线图。
在MPTP末次注射后十天，用高效液相色谱测定纹状体多巴胺含量。图2A为IO影响纹状体多巴胺浓度的计数图，图2B为IO影响纹状体多巴胺浓度的半对数量效曲线图。数据以平均值±标准误形式表达。*p＜0.05，**p＜0.01与对照相比；***P＜0.01与MPTP处理组相比。回归方程Y＝0.70+1.02X，r＝0.96。
在MPTP末次注射后十天，我们检测了纹状体多巴胺的浓度。与对照组(7.80±1.07ng/mg)相比，MPTP引起了纹状体多巴胺浓度的大幅度下降，只有1.47±0.29ng/mg(P＜0.01)；而IO却能浓度依赖性地提高纹状体多巴胺的含量(图2A)，IO 3、10、30mg/kg分别使多巴胺浓度上升至1.73±0.18、2.36±0.30和2.50±0.78(P＜0.01)。
(3)靛玉红衍生物(IO)改善了帕金森病小鼠的行为学异常在MPTP末次注射后十天进行实验鼠的行为学测试。爬杆和悬挂实验的实施和评分按照方法学介绍进行。数据以平均值±标准误形式表达。(*P＜0.01与对照组相比；**P＜0.01与MPTP处理组相比)。
在MPTP末次注射后十天，对帕金森病小鼠实施行为学检查。检查内容为爬杆试验(pole test)和悬挂试验(traction test)。
①爬杆实验(pole test)目的检测小鼠肢体运动协调情况。
方法将一直径为2.5厘米的软木小球固定于一根长50厘米粗1厘米的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下几个时间小鼠在顶球上停留的时间；小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间；小鼠爬完杆子的下半部分所用的时间。然后按以下标准计分3秒内完成上述某一动作的记3分；6秒内完成的记2分；超过6秒的记1分。最后计算三项累计得分情况，并作统计学分析。
②悬挂实验(traction test)目的检测小鼠肢体运动协调情况。
方法将受试小鼠两前爪悬于一水平电线上，如小鼠用两后爪抓住电线则记3分；如用一后爪抓住电线则记2分。如果小鼠两后爪均抓不住电线则记1分，最后计算得分情况，并作统计学分析。
实验结果显示在MPTP撤离后，我们能够从爬杆试验和悬挂试验中清楚地观察到实验动物肢体运动的不协调性(图3)。在爬杆试验中，对照组小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间和爬完杆子的下半部分所用的时间要比MPTP组的少得多。其中，对照组小鼠爬完杆子的上半部分和下半部分所用的时间分别为2.61秒和3.94秒；而MPTP组小鼠则分别用了7.21秒和8.63秒(P＜0.01)。与MPTP组相比，IO使所用时间明显减少，高浓度组(30mg/kg)所用的时间与对照组相仿。
在悬挂试验中，对照组小鼠用四肢抓住电线，而MPTP组小鼠却只能用前爪抓住电线，后爪无力；IO处理的小鼠虽然有的后爪仍然运动受阻，但至少可以用一只后爪抓住电线，表明后肢运动有所改善。
实施例2.
靛玉红衍生物(IO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyiridiniumion，MPP+)诱导的体外培养的中脑腹侧黑质多巴胺能神经元凋亡有保护性干预作用如图4，用孕14天胎鼠体外培养黑质多巴胺能神经元。体外培养第7天，用10μM MPP+诱导神经元凋亡。特异性酪氨酸羟化酶抗体检测TH阳性细胞(a)溶剂对照组，红色荧光为TH阳性细胞；(b)10μM MPP+使TH阳性细胞数目减少；IO 1μM(c)和3μM(d)挽救了神经元的凋亡。(放大×200)。
MPP+是MPTP在体内的活性代谢产物，MPP+可诱导的体外培养的胎鼠腹侧中脑多巴胺神经元凋亡。
参考文献的细胞培养方法(J Neurosci，1998；18(13)4929-37.Restor Neurol Neurosci.2003；21(1-2)29-37.)，取孕14天的大鼠，用CO2窒息后颈椎脱臼致死。乙醇消毒腹部后用剪刀垂直剪开腹部，暴露腹腔内容物，向两边延长切口至肋胁。无菌条件下取出子宫，用冰D-Hank液洗净，再经75％酒精洗浴30s，置于盛有冰D-Hank液的平皿中。用小剪刀沿子宫系膜对侧缘剪开子宫，取出胚胎，于解剖显微镜下检查胎鼠的顶臀距(CRL)为10-12mm，置于盛有冰D-Hank液的平皿中待用。用解剖刀从眼睛经过嘴巴直到腹侧的中脑褶缝切一刀；滚动胎儿使其背向下，从脑干祛除前脑，暴露侧脑室系统和它作为第三脑室及中央导水管在脑干的延伸；用分离剪向背面剪去两边的脑室，接着近尾部剪一刀，在中脑皱褶的底部再剪一刀；腹侧中脑(ventral mesencephalon，VM)的残余就与脑的其他部分分离了。用镊子将上面的脑膜清除后将分离的VM放入另一个装有冷解剖液(500ml中含有氯化钠36.25g，氯化钾2g，NaH2PO4·2H2O 0.91g，葡萄糖13g，酚红50mg，HEPES 29.7g，pH7.4)的皿中。剥去脑膜，用组织切片机切碎组织后加入0.1％胰酶溶液(必须在37℃浴槽内预热)20ml，在37℃下消化15min后加入10ml预热的DNA酶和胰酶抑制剂终止反应。1500rpm离心5min后吸去上清液，加入破碎液15ml(含1.2mg DNase I，7.8mg胰酶抑制剂，15ml解剖液，150μl 3.82％MgSO4)；用吸管轻轻吹打10次，制成细胞悬液。静置15min，将上清(约为总体积的9/10)吸至另一试管中。1500rpm离心5min，用培养基稀释细胞悬液至5×105个/ml。将细胞悬液接种在预先用Poly-Lysine包被的24孔板(每孔0.5ml)内。置37℃，5％CO2培养箱内培养，24h后在培养液内加入5μM Ara-C以抑制胶质细胞生长。每3天换一次培养液，在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。
在培养的第五天，不同浓度的IO预孵2h后，在培养基中加入终浓度为10μM的MPP+，48h后做TH染色，观察IO对MPP+诱导凋亡的黑质神经元的保护作用。对照组加等体积的DMSO，阴性对照组直接加10μM的MPTP。观察指标主要是酪氨酸羟化酶染色阳性的TH细胞计数。
权利要求
1.靛玉红衍生物在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用。
2.靛玉红衍生物在制备治疗帕金森病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及靛玉红衍生物(IO)在制备治疗神经退行性变疾病药物中的应用，特别是在制备治疗帕金森病药物中的应用。本发明旨在以靛玉红衍生物为抑制剂，以它抑制的三种介导凋亡的激酶——JNK/CDK5/GSK3β为明确靶点，创新性地研究和开发出一类靶点明确、毒性小、特异性高、作用强的治疗帕金森病和其它神经退行性变疾病的新药物，提高上述疾病患者的生活质量，为家庭和社会解除沉重负担，具有巨大的社会效益，并能创造巨大的经济效益。
文档编号A61P25/00GK101023944SQ20061003379
公开日2007年8月29日 申请日期2006年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者黎明涛, 韩怡凡, 陈汝筑, 李文明 申请人:黎明涛, 韩怡凡, 陈汝筑, 李文明