专利名称：用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸及其组合的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及RNA干扰技术，具体是涉及用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸及其组合。
背景技术：
1998年2月，Fire A et al.发现双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)在线虫(Csenorhabditis elegans)中能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们将这一现象称为RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)。随后在果蝇、真菌、昆虫、植物等生物及哺乳动物细胞中发现了RNAi现象。这种广泛性的存在表明RNAi很可能出现在生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正逐步地被阐明，同时亦成为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越被重视。2001年，它被《Science》杂志评为年度十大科学成就之一(Science，2001294(5551)2443-2447)。2002年RNAi的研究又有了新的突破，发现它在基因表达调控中发挥重要作用，因此荣登2002年《Science》杂志评出的十大科学成就之首(Science，2002298(5602)2296-2297)。2003年再次被评为世界十大科学成就之一(Science，2003302(5653)2039-2045)，连续三年被《Science》杂志评为十大科学成就之一，在科学史上比较罕见。《Fortune》杂志(Fortune2003，May12)也认为这一技术将成为近十年甚至几十年新药开发最主要的途径之一，并将为人类创造亿万价值的新药。
RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象，是双链RNA分子在mRNA水平阻断相应基因的表达。在果蝇中，dsRNA首先被Dicer酶(一种RNA聚合酶III，对dsRNA特异性切割的内切酶)切割成21～23nt有5’磷酸化和3’悬端(overhang)的小干扰RNA分子(small interference RNA，siRNA)(Sabine B.Biochemical etBiophysica Acta，2002，1575(531)15225.)。Dcr2(一种Dicer酶)和R2D2、siRNA组成复合物，与ago2(Argonaute蛋白家族成员之一)发生相互作用后，siRNA被转运至RISC(dsRNA-inducing silencing complex，dsRNA诱导沉默复合物)中。同时解螺旋酶(unwidase)将siRNA解旋，解链，其中反义链继续留在RISC中，而正义链离开RISC，之后被降解。siRNA的反义链通过碱基互补配对原则识别靶基因转录的mRNA并与之结合，再由RISC将mRNA切割成21～23nt片段，这些片段由于缺少PolyA尾巴及特定的头部而很易被降解，导致翻译受阻，产生转录后基因沉默效应。在不同的生物体内，RNAi的作用机制的某些方面可能不完全相同。比如，在线虫、某些真菌和植物中存在沉默的扩大效应，RNAi在局部的作用能够扩散至整个有机体，而在果蝇、哺乳动物中就不存在这种现象。
研究表明，RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果。因此，用siRNA代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，RNAi技术的应用领域已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。利用RNAi不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且在基因功能测定和基因治疗等方面开辟一条新思路，因此具有非常广阔的应用前景。
2001年，Elbashir SM.et al.(Nature.411494-498)发现长度为21nt的siRNA能在哺乳动物细胞中引起特异性RNAi。这扩大了RNAi的应用范围，让人们看到了将siRNA应用于人体的希望。2002年，Lee NS et al.(Nature biotechnology.2002.20500-505)设计了一种Pol III启动子系统，并且利用该系统在人体细胞中能够表达双链siRNAs。他们发现这些针对HIV-I基因组的siRNAs能够有效的抑制HIV-1基因的表达。这为治疗艾滋病带来了新的希望。现有治疗艾滋病的方法都具有以下缺点花费大，副作用大，治疗不彻底。使用RNA干扰技术来治疗艾滋病就能克服上述缺点。
只有双链siRNA中反义序列与目的RNA序列完全互补，才能发挥出最大的干扰作用。相差一个碱基都有可能使siRNA的作用失效。但是艾滋病病毒逆转录酶不具有3’到5’的外切核酸酶(校正)活性，所以该病毒在进行逆转录时，忠实性较低，基因组易发生突变。因此目前文献和专利中针对艾滋病病毒基因组设计的siRNA以及基于使用siRNA的治疗艾滋病的方法很容易失效。
本发明人领导的课题组在应用siRNA预防和治疗猴体的SAR冠状病毒方面，取得了重大突破。这一研究论文发表在《nature medicine》(2005，11(9)944-951)。而HIV病毒与SARS病毒均为RNA病毒，故应用siRNA预防治疗HIV前途光明。
HIV的基因组含有gag、pol、env三个结构基因以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调控基因。在基因组的5’端和3’端各含长末端重复序列(LTR)，HIV的LTR含顺式调控序列，控制着前病毒基因的表达。gag基因是编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因。pol基因编码HIV复制所需的酶类。env基因编码env蛋白，糖基化后形成包膜刺突糖蛋白前体。nef基因编码NEF蛋白，是一种负性调节因子。vif基因编码VIF蛋白，为病毒体感染性因子。vpr基因编码病毒蛋白r。如果使用RNAi技术抑制上述基因的表达，以及降解目的基因，可以使HIV不能正常复制和繁殖。
目前文献和专利中针对艾滋病病毒基因组设计的干扰核糖核酸小分子(简称siRNA，包括干扰RNA小分子，对应的干扰DNA/RNA杂合链小分子，以及其对应的干扰DNA小分子)以及使用siRNA预防与治疗艾滋病的方法存在的问题是由于艾滋病毒基因组的高突变率和siRNA的高度特异性，致使这些siRNA很容易失去作用。
发明内容
本发明的目的是克服因HIV-I病毒的突变而使原设计的siRNA的有效性降低或失效的问题，做了以下的改进1、参照已有设计siRNA的成功经验，设计出有效的、新的siRNA；2、针对HIV-I基因组的保守区域，设计双链siRNA。
3、在应用siRNA预防与治疗艾滋病时，同时使用两条或两条以上的siRNA。当siRNA的靶序列中有碱基发生了突变，同时给药的另一条或几条siRNA可能还能够继续产生作用。因为两条或以上的双链siRNA的各自的靶序列区域都同时发生2个或2个以上突变的几率很小。这种组合化是指同时应用多个siRNA预防与治疗HIV的技术，将可应付HIV病毒不断产生突变的情况。
4、在应用针对HIV-I基因组的siRNA预防与治疗艾滋病时，首先从艾滋病患者身上提取出HIV基因组，对整个基因组或者某些基因进行测序，根据测序结果，可以选择性的使用某个或某些siRNA。这些siRNA的特征是在HIV-I基因组中，这些siRNA的靶序列区域没有发生突变，并且该序列区域比较保守。或者可以即时设计并加入一个或一些新的siRNA。这些siRNA的特征是在HIV-I基因组中，这些siRNA的靶序列区域发生了突变，并可能致使原设计的siRNA失效。
本发明所述的用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸为RNA双链分子，即siRNA双链分子；所述的siRNA双链分子有19个碱基配对，正义链和反义链各自在5′末端有两个突出碱基dT，GC含量为40-55％，所针对的靶序列选自HIV基因组的gag基因、pol基因、vif基因、vpr基因、env基因与nef基因，为在90％以上的HIV-I毒株中保守的且与人体基因组中的所有基因序列不同源的序列区域；所述的siRNA双链分子的正义链序列选自SEQ ID NO.1-116，反义链是根据碱基互补原则与正义链序列一一相应。
本发明中的siRNA针对目的基因的靶序列具有以下全部或大部分特征(1)将HIV基因组中对病毒的生存和繁殖具有重要作用的功能基因作为靶序列；(2)序列长度为19bp；长度过长的siRNA会发生非特异性作用，长度过短的不能保证其特异性；(3)本发明中的siRNA中的GC含量40-55％左右；(4)在90％以上的HIV-I毒株中，HIV-I基因组中的靶序列的大部分碱基都是保守的；我们从NCBI(美国国立生物技术信息中心)，EMBL(欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库)，DDBJ(日本DNA数据库)及HIV序列数据库(http:∥hiv-web.lanl.gov/content/index)中下载所有HIV-I基因组，并进行同源性比对后，选取在90％以上的HIV-I毒株中保守的序列区域作为靶序列。(5)靶序列在HIV-I基因组所处的位置，不易形成二级结构，从而避免其与siRNA分子难以相互接近；siRNA发生作用是通过碱基互补原则识别与其对应的RNA或mRNA；如果在该序列区域存在二级结构而难以使siRNA接近，就会导致siRNA难以识别该互补序列，从而不能降解RNA或mRNA。
本发明中的siRNA针对HIV-I基因组中的靶序列与人体基因组中所有基因的mRNA序列不同源。通过将siRNA分子的靶序列在GenBank进行Blast。对于针对HIV-I基因组的，与靶序列相比，如在人类基因中不存在等于或多于16个连续相同碱基，则选取该靶序列用来设计siRNA。这样避免siRNA分子在人体内抑制其他不相关基因的表达，导致引起人体细胞功能失调，而产生副作用。
考虑到HIV病毒的高突变性，本发明中的siRNA所针对的靶序列会发生部分改变。因此，本发明中的siRNA所针对的靶序列的范围不仅仅包括与附表1完全一致的靶序列，而且针对与靶序列具有70％和70％以上的同源的序列，并由此而得到的相应正义链和反义链序列。
将本发明的siRNA进行修饰，如将部分碱基进行磷酸化、巯基化等，能够使siRNA更稳定，更容易进入细胞等。
本发明的另一目的是提供所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合，为两条或两条以上的siRNA双链分子的组合。
方式一所述的siRNA双链分子根据针对的靶序列所在基因分为以下各组(1)正义链序列选自SEQ ID NO.1-11的siRNA双链分子，针对HIV基因组的gag基因；(2)正义链序列选自SEQ ID NO.10-99的siRNA双链分子，针对HIV基因组的pol基因；(3)正义链序列选自SEQ ID NO.97-101的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vif基因；(4)正义链序列选自SEQ ID NO.102-103的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vpr基因；(5)正义链序列选自SEQ ID NO.104-115的siRNA双链分子，针对HIV基因组的env基因；上述同组siRNA双链分子的两条或两条以上相互组合。
方式二所述的siRNA双链分子根据针对的靶序列所在基因分为以下各组(1)正义链序列选自SEQ ID NO.1-11的siRNA双链分子，针对HIV基因组的gag基因；(2)正义链序列选自SEQ ID NO.10-99的siRNA双链分子，针对HIV基因组的pol基因；(3)正义链序列选自SEQ ID NO.97-101的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vif基因；(4)正义链序列选自SEQ ID NO.102-103的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vpr基因；(5)正义链序列选自SEQ ID NO.104-115的siRNA双链分子，针对HIV基因组的env基因；(6)正义链序列选自SEQID NO.116的siRNA双链分子，针对HIV基因组的nef基因；上述不同组siRNA双链分子的两条或两条以上相互组合。
本发明还提供了如权利要求1所述的双链小分子干扰核糖核酸的筛选方法，包括以下步骤1)对所有HIV-I基因组进行同源性比对后，选取在90％以上的HIV-I毒株中保守的序列区域作为靶序列；2)剔除容易形成二级结构而使siRNA分子难以接近的靶序列；3)剔除与人体基因组中的所有基因序列同源的靶序列；4)在上述靶序列中选取长度为19bp的序列；5)计算GC含量，选取GC含量为40-55％左右的序列；6)经上述筛选得到候选siRNA的靶位点，设计出相应的siRNA，然后通过抑制靶基因融合蛋白的体外实验进行筛选，得到有效抑制HIV-1病毒的siRNA序列。
本发明还提供了所述的双链小分子干扰核糖核酸用于制备预防与治疗艾滋病的药物的用途，以及所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合用于制备针对不同的HIV病毒株及艾滋病易感者或患者的组合化预防与治疗药物的用途。
由于不同的HIV病毒株的某些共同特征以及高突变性等，所以，采用组合化和个体化siRNA策略是对不同的艾滋病易感者或患者进行预防和治疗的有效手段。
图1为载体pEGFP-pol的构建过程。
图2为本发明所述的干扰siRNA小分子的结构，N为A、T、C、G、U中任一碱基。
具体实施例方式
实施例一siRNA的设计本发明采取以下全部或大多数原则来选择靶序列，进行设计siRNA1、选取长度为18-25bp的序列；2、计算GC含量，选取GC含量为40-55％左右的序列；3、在90％以上的HIV-I毒株中，HIV-I基因组中的靶序列的大部分碱基都是保守的；从NCBI(美国国立生物技术信息中心)，EMBL(欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库)，DDBJ(日本DNA数据库)及HIV序列数据库(http:∥hiv-web.lanl.gov/content/index)中下载所有HIV-I基因组，并进行同源性比对后，选取在90％以上的HIV-I毒株中保守的序列区域作为靶序列。
4、在HIV-I基因组中的靶序列所在的区域不会因形成二级结构而使siRNA分子难以接近；siRNA发生作用是通过碱基互补原则识别与其互补的mRNA，在同源序列的中部剪切mRNA；如果在该序列区域存在二级结构而难以使siRNA接近，就会导致siRNA难以识别该互补序列，从而不能降解mRNA。
5、本发明中的siRNA所针对HIV-I基因组中的靶序列是与人体基因组中的所有基因序列不同源。将siRNA分子的靶序列在GenBank进行Blast。如与靶序列相比，在人类基因中不存在等于或多于16个连续相同碱基，则选取该靶序列用来设计siRNA。这样避免siRNA分子在人体内降解其他不相关基因，引起人体细胞功能失调，而产生副作用。
根据上述原则，得到了候选siRNA的靶位点，从而设计出相应的siRNA，然后通过实验进行筛选，得到了116条siRNA(见附表1)。
实施例二siRNA抑制艾滋病病毒的gag基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.3设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA 35’ G G A G A C A U C U A U A A A A G A U dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C C U C U G U A G A U A U U U U C U A 5’
2、gag基因序列的获得以HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的gag基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物(GCGAATTCGGCTAGAAGGAGAGAGATGG，100ng)，以HIV-I的gag基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物(GCGGATCCGGGTCGTTGCCAAAGAGT，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切，并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的gag基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-gag。
4、将质粒pEGFP-gag和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-gag和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-GAG融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、将其他针对gag基因的siRNA(如附表一中所列的NO.1-9)进行上述类似实验，实验结果表明大部分siRNA双链分子能够抑制pEGFP-gag融合基因表达的效率一般都为60％以上，极少数的抑制效率达到90％。
实施例三siRNA抑制艾滋病病毒的pol基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中NO.45靶序列设计并合成相应的正义链和反义链序列，可以得到如下结构的siRNA 455’G G A C U G U C A A U G A U A U A C A dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C C U G A C A G U U A C U A U A U G U5’2、pol基因序列(3kb)的获得将HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的pol基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物PpolS(CGGAATTCGCAGACCAGAGCCATCAG，100ng)，以HIV-I的pol基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物PpolA(GCGGATCCGTGATGTCTATAAAACCACCC，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切，并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的pol基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-pol。
4、将质粒pEGFP-pol和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-pol和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-POL融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、将其他针对pol基因的siRNA双链分子(如附表一中所列的NO.10-98，NO.116)进行上述类似实验，实验结果表明大部分siRNA双链分子能够抑制pEGFP-pol融合基因表达的效率一般都为60％以上，极少数的抑制效率达到90％。
实施例四siRNA抑制艾滋病病毒的vif基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.101设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA 1015’ C A U G G G G U C U C C A U A G A A U dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT G U A C C C C A G A G G U A U C U U A 5’2、vif基因序列的获得以HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的vif基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物(GCGAATTCGGCAGTGGTAATACAGGA，100ng)，以HIV-I的vif基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物(GCGGATCCCAGCTTCATGCTTAAGATC，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的vif基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-vif。
4、将质粒pEGFP-vif和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-vif和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-VIF融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、将另一条针对vif基因的siRNA 100双链分子进行上述类似实验，实验结果表明siRNA 100、101双链分子均能有效抑制pEGFP-vif融合基因的表达。
实施例五siRNA抑制艾滋病病毒的vpr基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.103设计并合成相应的正义链和反义链，得到如下结构的siRNA 1035’ G U U U G U U C A U U U C A G A A U U dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C A A A C A A G U A A A G U C U U A A 5’2、vpr基因序列的获得以HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的vpr基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物(GAATTCGCCTAGTGTTAGGAAACTAAC，100ng)，以HIV-I的vpr基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物(GCGGATCCGATGATTCCAGGGCTCTA，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切，并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的vpr基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-vpr。
4、将质粒pEGFP-vpr和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-vpr和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-VPR融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、将针对vpr基因的siRNA 102进行上述类似实验，实验结果表明siRNA 102、103双链分子均能有效抑制pEGFP-vpr融合基因的表达。
实施例六siRNA抑制艾滋病病毒的env基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.104设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA 1045’ C C A A U U C C U A U A C A U U A U U dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT G G U U A A G G A U A U G U A A U A A 5’2、env基因序列的获得将HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的env基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物(GCGAATTCAGACAGTGGCAATGAAAG，100ng)，以HIV-I的env基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物(GCGGATCCTTGTCCTATTTCTATAACCCTA，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切，并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的env基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-env。
4、将质粒pEGFP-env和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-env和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-ENV融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、将其他针对env基因的siRNA双链分子(如附表一中所列的NO.104-115)进行上述类似实验，实验结果表明大部分siRNA双链分子能够抑制pEGFP-env融合基因表达的效率一般都为60％以上，极少数的抑制效率达到90％。
实施例七siRNA抑制艾滋病病毒的nef基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.115设计并合成相应的正义链和反义链，得到如下结构的siRNA 1165’ G C C A C U U U U U A A A A G A A A A dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C G G U G A A A A A U U U U C U U U U 5’
2、nef基因序列的获得以HIV-1的基因组进行逆转录，生成cDNA。以cDNA作为模板(0.5ng)，以HIV-I的nef基因5’端之前的保守序列和EcoRI酶切位点作为正向引物(GCGAATTCGGTGGACAGATAGGGTTA，100ng)，以HIV-I的nef基因3’端之后的保守序列和BamHI酶切位点作为反向引物(GCGGATCCTCTTCTACTTCAGTTGGGT，100ng)，加入2.5单位pfu高保真酶，相应体积的10×buffer，dNTP 250μmol/L，进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目的片断的大小，确定PCR产物是否与预期一致；如一致，则将PCR产物回收，进行EcoRI和BamHI酶切，并进行电泳，再次确认该产物是否与预期一致。
3、载体的构建将载体pEGFP(Clontech，CA)进行EcoRI和BamHI双酶切，进行胶纯化回收大片断。与双酶切的nef基因的PCR产物进行连接，转化至大肠杆菌。挑取阳性菌落，提取质粒，进行酶切鉴定，确认获得完全正确的质粒pEGFP-nef。
4、将质粒pEGFP-nef和上述合成的siRNA，共转染至HEK细胞(购自ATCC)，并将质粒pEGFP-nef和无关siRNA共转染至HEK细胞作为对照。48小时后，用荧光照相法比较绿色荧光蛋白-NEF融合蛋白的表达量，并将融合蛋白的表达产量进行比较，以确认这一设计的siRNA的特异基因沉默功效。
5、实验结果表明siRNA 116双链分子能够有效抑制pEGFP-nef融合基因的表达。
实施例八使用组合化siRNA抑制艾滋病病毒的pol基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.43、60、79设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA 43、60、79siRNA 435’G C U G G A C U G U C A A U G A U A U dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C G A C C U G A C A G U U A C U A U G5’siRNA 605’C A A U G G C U A G U G A U U U U A A dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT G U U A C C G A U C A C U A A A A U U5’siRNA 795’G C A G U A U U C A U U C A C A A U U dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C G U C A U A A G U A A G U G U U A A5’2、如实施例三获得pol基因，并与质粒pEGFP构建成载体pEGFP-pol。
3、将质粒pEGFP-pol与siRNA共转染至HEK细胞(购自ATCC)，五组siRNA分别为1、1.0μg siRNA 43；2、1.0μg siRNA 60；3、1.0μg siRNA 79；4、siRNA 43、60和79各0.33μg混合；5、1.0μg无关siRNA。48小时后，用荧光照相法比较各组细胞的绿色荧光蛋白-POL融合蛋白的表达量，以确认各组siRNA的特异基因沉默功效。
采用其他组合进行上述类似实验，结果发现联合作用组对融合蛋白的抑制效果最好，其高于每条siRNA单独对pEGFP-pol融合基因表达的抑制效果。
实施例九使用组合化siRNA抑制艾滋病病毒基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.8、75、108设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA8、75、108siRNA 85’ G A A G G A C A U C A A A U G A A G A dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT C U U C C U G U A G U U U A C U U C U5’siRNA 755’ C U U A A G A C A G C A G U A C A A A dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT dT G A A U U C U G U C G U C A U G U U U5’siRNA 1085’G G U G G A G A G A G A A A A A A G A dT dT 3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’ dT C C A C C U C U C U C U U U U U U C U dT5’2、如实施例二获得gag基因，并与质粒pEGFP构建成载体pEGFP-gag。如实施例三获得pol基因，并与质粒pEGFP构建成载体pEGFP-pol。如实施例六获得env基因，并与质粒pEGFP构建成载体pEGFP-env。
3、将质粒pEGFP-gag、pEGFP-pol、pEGFP-env与siRNA共转染至HEK细胞(购自ATCC)，五组siRNA分别为1、1.0μg siRNA 8；2、1.0μg siRNA 75；3、1.0μg siRNA 108；4、siRNA 8、75和108各0.33μg混合；5、1.0μg无关siRNA。48小时后，用荧光照相法比较各组细胞的绿色荧光蛋白的表达量，以确认各组siRNA的特异基因沉默功效。
采用其他组合进行上述类似实验，结果发现联合作用组siRNA对pEGFP-突变融合基因表达的抑制效果最好，其高于每条siRNA单独对pEGFP融合基因表达的抑制效果。
实施例十使用组合化siRNA抑制人工突变的艾滋病病毒pol基因的表达1、siRNA的合成根据附表1中的靶序列NO.24、58、88设计并合成相应的正义链和反义链序列，得到如下结构的siRNA24、58、88siRNA 245’ G A A U U G G A G G C U U U A U C A A dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’dT dT C U U A A C C U C C G A A A U A G U U 5’siRNA 585’ G A G A G C A A U G G C U A G U G A U dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’dT dT C U C U C G U U A C C G A U C A C U A 5’siRNA 885’ G G A A A G A A U A A U A G A C A U A dT dT3’| | | | | | | | | | | | | | | | | | |3’dT dT C C U U U C U U A U U A U C U G U A U 5’2、如实施例三获得pol基因，以pol基因为模板，进行易错PCR(error prone PCR)。易错PCR反应体系(100μL)50mmol/L KCI，10mmol/L Tris-HCI PH8.3(25℃)，7mmol/L MgCI2，0.5mmol/L MnCI2，0.2mmol/L dATP和dGTP、1mmol/L dCTP和dTTP，5U Taq DNA聚合酶，引物PpolS和PpolA各0.3μM，模板5ng。易错PCR反应条件94℃ 5min；94℃30s，45℃ 1min，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min。将PCR产物进行纯化、回收，并与实施例三类似，将进行突变的pol基因与载体质粒pEGFP构建成载体pEGFP-pol。
3、将质粒pEGFP-pol与siRNA共转染至HEK细胞(购自ATCC)，五组siRNA分别为1、1.0μg siRNA 24；2、1.0μg siRNA 58；3、1.0μg siRNA 88；4、siRNA 24、58和88各0.33μg混合；5、1.0μg无关siRNA。48小时后，用荧光照相法比较各组细胞的绿色荧光蛋白-POL融合蛋白的表达量，以确认各组siRNA的特异基因沉默功效。
采用其他组合进行上述类似实验，结果发现联合作用组siRNA对pEGFP-突变pol融合基因表达的抑制效果最好，其高于每条siRNA单独对pEGFP-突变pol融合基因表达的抑制效果。
实施例十一抑制HIV基因表达的模型1、细胞筛选系统本发明中的siRNA分子能够使用不同的细胞筛选系统，这些系统能应用于筛选具有抗HIV活性的物质。B细胞，T细胞，巨噬细胞和内皮细胞等细胞筛选系统都能够应用于筛选本发明的siRNA分子。以293/EcR细胞筛选系统为例，该系统使用U6 snRNA启动子表达系统，将siRNA分子与HIV-I pNLA-3前病毒DNA共转染至293/EcR细胞，然后进行筛选(Lee NS.et al.，2002，Nature Biotechnology，19，500-505)。
在293/EcR细胞筛选系统中的表达载体是pTZ U6+1载体。将长为21nt的核苷酸正义序列和相对应的反义序列(见附表1)构建至pTZ U6+1载体中。这些序列针对的靶目标位于HIV-1 RNA上。与HIV-1和人基因组均不同源的正义和反义(S/AS)序列也克隆至pTZ U6+1载体中，作为阴性对照。将siRNA构建体与HIV-I pNLA-3前病毒DNA共转染至293/EcR细胞，加入Ponasterone诱导构建体表达核苷酸序列。提取RNA，进行Northern blotting。并在1天、2天、3天、4天分别取上清，检测HIV-1 p24抗原的含量。同时，取细胞测定其存活率。
2、动物模型评价抗HIV物质的治疗效果需要利用动物模型。现有的人类HIV-1感染动物模型一般使用啮齿动物和灵长类动物。本发明的siRNA分子能通过很多动物模型来评估，如hu-PBL-SCID mouse模型(McCune J.M.Animal models of HIV-1 disease.Science.1997，2782141-2142.)，SCID-hu mouse thy/liv模型(Mosier D.Human xenograftmodels for virus infection.Virology.2000，271215-219.)，HIV-1/SIVmac嵌合病毒非人类灵长类动物模型(Li J.et al.Infection of cynomolgus monkeys with a chimericHIV-1/SIVmac virus that expresses the HIV-1 envelope glycoproteins.J.Acquiredlmmune Defic.Synd r.1992，5639-646.)等等。siRNA分子可以通过不同方法给药，然后通过提取RNA来检测HIV基因的量，以及滴定HIV p24的含量等等方法，确定siRNA分子对HIV的抑制效果。
附表1
通过上述各实施例的实验结果，上表中所列的大部分siRNA双链分子对HIV病毒的抑制效率一般都达到70％以上，少数的抑制效率达到90％，另有少数的抑制效率为50％。
上表中所列的116条序列，凡针对HIV病毒基因组同一基因的siRNA双链分子，可任意组合用于制备针对不同的HIV病毒株的组合化预防与治疗药物；凡针对HIV病毒基因组不同基因的siRNA双链分子，可任意组合用于制备针对不同的HIV病毒株的组合化预防与治疗药物。
序列表<110>李，宝健<120>用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸及其组合<130>
<160>116<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1gcgagagcgu caguauuaa19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>2cauguuuaca gcauuauca 19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>3ggagacaucu auaaaagau 19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>4caucuauaaa agauggaua 19<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>5ggauuaaaca aaauaguaa 19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>6gcuacauuag aagaaauga 19<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>7cuacauuaga agaaaugau 19<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>8gaaggacauc aaaugaaga 19
<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>9ggacaucaaa ugaaagacu 19<210>10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>10caggcgaauu uuuuaggga 19<210>11<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>11cuaauuuuuu agggaaaau 19<210>12<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>12gauacagggg cagaugaua 19<210>13<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>13caggggcaga ugauacagu 19<210>14<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>14ggagcagaug acacaguau 19<210>15<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>15gagcagauga cacaguauu19<210>16<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>16cagaugauac aguacuaga19<210>17<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>17ccaggaaaau ggaaaccaa19<210>18<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>18caggaaaaug gaaaccaaa19<210>19<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>19ggaaaaugga aaccaaaaa19<210>20<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>20gaaaauggaa accaaaaau19<210>21<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>21gggggaauug gaggcuuua19
<210>22<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>22ggggaauugg aggcuuuau 19<210>23<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>23ggaauuggag gcuuuauca 19<210>24<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>24gaauuggagg cuuuaucaa 19<210>25<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>25cuguaccagu aacauuaaa 19<210>26<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>26guuaaacagu ggccauuaa 19<210>27<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>27ccauuaacag aagagaaaa 19<210>28<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>28cauuaacaga agagaaaau19<210>29<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>29agagaaaaua gaagcauua19<210>30<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>30caaaaauugg accugaaaa19<210>31<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>31ggccugaaaa uccauacaa19<210>32<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>32gccugaaaau ccauacaau19<210>33<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>33ccugaaaauc cauacaaua19<210>34<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>34guggaggaaa uuaguagau19
<210>35<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>35ggaggaaauu aguagauuu19<210>36<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>36gaaaaaauca gugacagua19<210>37<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>37ccacaaggau ggaaaggau19<210>38<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>38ggaaaggauc accagcaau19<210>39<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>39gaaaggauca ccagcaaua19<210>40<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>40gcaugacaaa aaucuuaga19<210>41<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>41cuccauccug acaaaugga 19<210>42<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>42caguuggacu gucaaugau 19<210>43<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>43gcuggacugu caaugauau 19<210>44<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>44cuggacuguc aaugauaua 19<210>45<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>45ggacugucaa ugauauaca 19<210>46<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>46cugucaauga uauacagaa 19<210>47<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>47caauggacau accaaauuu 19
<210>48<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>48gcucacacua augauguaa 19<210>49<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>49cucacacuaa ugauguaaa 19<210>50<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>50cacuaaugau guaaaacaa 19<210>51<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>51cuaaugaugu aaaacaauu 19<210>52<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>52aggaauagga ggaaaugaa 19<210>53<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>53gaauuggagg gaaugaaca 19<210>54<211>19<212>RNA<213>人工序列
<400>54gaggaaauga gcaaguaga 19<210>55<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>55ggaaaugaac aaauagaua 19<210>56<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>56gaaaugaaca gguagauaa 19<210>57<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>57caaguagaca aauuaguca 19<210>58<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>58gagagcaaug gcuagugau 19<210>59<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>59gcaauggcua gugauuuua 19<210>60<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>60caauggcuag ugauuuuaa 19
<210>61<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>61guagccagcu gugauaaau 19<210>62<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>62ccagcuguga uaaauguca 19<210>63<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>63cagcugugau aaaugucaa 19<210>64<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>64cugugauaag ugucaacua 19<210>65<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>65gugauaaaug ucaacuaaa 19<210>66<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>66cagggauaug gcaauuaga 19
<210>67<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>67gggauauggc aauuagauu 19<210>68<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>68caggaaggug gccaguaaa 19<210>69<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>69ccuacaaucc acaaaguca 19<210>70<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>70cuacaaucca caaagucaa 19<210>71<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>71aucuaugaau aaggaauua 19<210>72<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>72cuaugaauaa ggaauuaaa 19<210>73<211>19<212>RNA
<213>人工序列<400>73gaauaaggaa uuaaagaaa 19<210>74<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>74ggaauuaaag aaaaucaua 19<210>75<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>75cuuaagacag caguacaaa 19<210>76<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>76caguacagau ggcaguauu 19<210>77<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>77guacagaugg caguauuca 19<210>78<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>78ggcaguauuc auucacaau 19<210>79<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>79gcaguauuca uucacaauu 19
<210>80<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>80caguauucau ucacaauuu 19<210>81<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>81guauucauuc acaauuuua 19<210>82<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>82cauucacaau uuuaaaaga 19<210>83<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>83cagugcagga gaaagaaua 19<210>84<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>84gugcaggaga aagaauaau 19<210>85<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>85caggggaaag aauaauaga 19<210>86<211>19<212>RNA
<213>人工序列<400>86ggggaaagaa uaauagaca 19<210>87<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>87gggaaagaau aauagacau 19<210>88<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>88ggaaagaaua auagacaua 19<210>89<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>89gaaagaauaa uagacauaa 19<210>90<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>90cauaauagca ucagacaua 19<210>91<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>91gaauuacaaa aacaaauua 19<210>92<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>92caaaaacaaa uuauaaaaa 19
<210>93<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>93caaauuauaa aaauucaaa 19<210>94<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>94caaaauuucc ggguuuauu 19<210>95<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>95ggaaaggacc agccaaacu 19<210>96<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>96gugaaggagc aguaguaau 19<210>97<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>97cagauggcag gugcugauu 19<210>98<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>98gauggcaggu gcugauugu 19<210>99<211>19<212>RNA
<213>人工序列<400>99guagacagga ugaagauua 19<210>100<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>100cauggaacag uuuaguaaa 19<210>101<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>101cauggggucu ccauagaau 19<210>102<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>102gcugucagac auuuuccua 19<210>103<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>103guuuguucau uucagaauu 19<210>104<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>104ccaauuccua uacauuauu 19<210>105<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>105caauuggaga aaugaauua 19
<210>106<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>106ggagaaguga acuauauaa 19<210>107<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>107gugguggaga gagaaaaaa 19<210>108<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>108gguggagaga gaaaaaaga 19<210>109<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>109ggagcagccg gaagcacua 19<210>110<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>110gagcagccgg aagcacuau 19<210>111<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>111caaauuggcu augguauau 19<210>112<211>19<212>RNA
<213>人工序列<400>112ggcuauggua uauaaaaau 19<210>113<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>113gcuaugguau auaaaaaua 19<210>114<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>114gguauauaaa aauauuuau 19<210>115<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>115guauauaaaa auauuuaua 19<210>116<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>116gccacuuuuu aaaagaaaa 19
权利要求
1.用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸，其特征在于所述的双链小分子干扰核糖核酸为RNA双链分子，即siRNA双链分子；所述的siRNA双链分子有19个碱基配对，正义链和反义链各自在5’末端有两个突出碱基dT，GC含量为40-55％，所针对的靶序列选自HIV基因组的gag基因、pol基因、vif基因、vpr基因、env基因与nef基因，为在90％以上的HIV-I毒株中保守的且与人体基因组中的所有基因序列不同源的序列区域；所述的siRNA双链分子的正义链序列选自SEQ ID NO.1-116，反义链是根据碱基互补原则与正义链序列一一相应。
2.如权利要求1所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合，其特征在于为两条或两条以上的siRNA双链分子的组合。
3.根据权利要求2所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合，其特征在于所述的siRNA双链分子根据针对的靶序列所在基因分为以下各组(1)正义链序列选自SEQ ID NO.1-11的siRNA双链分子，针对HIV基因组的gag基因；(2)正义链序列选自SEQ ID NO.10-99的siRNA双链分子，针对HIV基因组的pol基因；(3)正义链序列选自SEQ ID NO.97-101的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vif基因；(4)正义链序列选自SEQ ID NO.102-103的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vpr基因；(5)正义链序列选自SEQ ID NO.104-115的siRNA双链分子，针对HIV基因组的env基因；上述同组siRNA双链分子的两条或两条以上相互组合。
4.根据权利要求2所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合，其特征在于所述的siRNA双链分子根据针对的靶序列所在基因分为以下各组(1)正义链序列选自SEQ ID NO.1-11的siRNA双链分子，针对HIV基因组的gag基因；(2)正义链序列选自SEQ ID NO.10-99的siRNA双链分子，针对HIV基因组的pol基因；(3)正义链序列选自SEQ ID NO.97-101的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vif基因；(4)正义链序列选自SEQ ID NO.102-103的siRNA双链分子，针对HIV基因组的vpr基因；(5)正义链序列选自SEQ ID NO.104-115的siRNA双链分子，针对HIV基因组的env基因；(6)正义链序列选自SEQ ID NO.116的siRNA双链分子，针对HIV基因组的nef基因；上述不同组siRNA双链分子的两条或两条以上相互组合。
5.如权利要求1所述的双链小分子干扰核糖核酸的筛选方法，其特征在于1)对所有HIV-I基因组进行同源性比对后，选取在90％以上的HIV-I毒株中保守的序列区域作为靶序列；2)剔除容易形成二级结构而使siRNA分子难以接近的靶序列；3)剔除与人体基因组中的所有基因序列同源的靶序列；4)在上述靶序列中选取长度为19bp的序列；5)计算GC含量，选取GC含量为40-55％左右的序列；6)经上述筛选得到候选siRNA的靶位点，设计出相应的siRNA，然后通过抑制靶基因融合蛋白的体外实验进行筛选，得到有效抑制HIV-1病毒的siRNA序列。
6.权利要求1所述的双链小分子干扰核糖核酸用于制备预防与治疗艾滋病的药物的用途。
7.权利要求2所述的双链小分子干扰核糖核酸的组合用于制备针对不同的HIV病毒株及艾滋病易感者或患者的组合化预防与治疗药物的用途。
全文摘要
本发明涉及用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸及其组合。本发明所述的用于预防与治疗艾滋病的双链小分子干扰核糖核酸为RNA双链分子，即siRNA双链分子；所述的siRNA双链分子有19个碱基配对，正义链和反义链各自在5’末端有两个突出碱基dT，GC含量为40－55％，所针对的靶序列选自HIV基因组的gag基因、pol基因、vif基因、vpr基因、env基因与nef基因，为在90％以上的HIV－I毒株中保守的且与人体基因组中的所有基因序列不同源的序列区域；所述的siRNA双链分子的正义链序列选自SEQ ID NO.1－116，反义链是根据碱基互补原则与正义链序列一一相应。本发明克服了因HIV－I病毒的突变而使原设计的siRNA的有效性降低或失效的问题。
文档编号A61P31/00GK101024668SQ200610033799
公开日2007年8月29日 申请日期2006年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者李宝健 申请人:李宝健