P0基因沉默构建体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种在细胞中转录时能够形成双链自身互补RNA序列的重组BMYV?P0病毒核苷酸序列。
【专利说明】PO基因沉默构建体和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于在植物中，尤其是在糖用甜菜植物中传递对一种或多种病毒，尤其是对甜菜轻型黄化病毒(BMYV)和对甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)或仅对BMYV的病毒抗性或耐受性的方法。此外，本发明涉及根据这种方法获得的抗病毒或耐受病毒的植物，以及涉及由其衍生的种子和后代。 [0002]本发明还涉及基因沉默构建体，尤其是介导BMYV，或BMYV和BNYVV RNA沉默的发夹构建体和它们的应用。
【背景技术】
[0003]对于许多主要农作物植物病毒是严重的问题，因为病毒感染引起极大的收获损失。
[0004]在糖用甜菜中，主要病因有:(i)由其主要载体桃姆(Myzus persicae)以持久性方式传播的马铃薯卷叶病毒属(polerovirus)、甜菜轻型黄化病毒(BMYV)引起的黄化；(ii)由通过多粘菌姆传播(Polymyxa betae)的甜菜坏死黄脉病毒属(benyvirus)、甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)引起的糖用甜菜丛根病。抗BNYVV抗性的广泛使用使得能够保持产量，然而，正在出现破坏抗性的病毒分离株，因此迫切需要新的抗性变体。
[0005]一旦土地受到感染，真菌传播的病毒，如BNYVV可以在土壤中以休眠孢子保持数年。由于在植物中或在土壤中还没有用于消除这种病毒的有效的化学或物理方法，对于糖用甜菜菜农来说唯一的选择是使用遗传性抗病品种。几家公司已经通过育种提供了多种耐受性的，甚至部分抗性的变种。然而，这是一个非常繁琐和耗时的过程，通常需要很长的时间才能获得有用的抗性植物。
[0006]植物工程领域的快速变革已经引发了新策略的开发以赋予对病毒的遗传抗性。通过引入部分病毒基因组序列而由此将病毒序列(构建体)转化到植物细胞和植物中的对病毒性疾病抗性，已经成为抗性的新来源。
[0007]糖用甜菜被称为基因工程中的顽固物种，使可能的成功诱导病毒抗性变得复杂化。
[0008]已经公开了工程耐受性的几个实例，例如，通过在糖用甜菜基因组中转化和表达BNYVV衣壳蛋白序列(W091/13159)，尽管对整个功能性转基因糖用甜菜植物的报道来说这仅是很少的数据，如公开于EP1169463B1中的那些。具体而言，这些报道显示，关于在感染的病状中观察到的用编码BNYVV衣壳蛋白序列的基因转化的转基因糖用甜菜植物的抗性水平的数据有限。
[0009]甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的基因组由五个正义RNA组成，其中的两个(RNA1和RNA2)编码对感染所有植物至关重要的功能，而其他三个(RNA3、RNA4和RNA5)涉及糖用甜菜(甜菜)根的载体介导的感染。由RNA2上称之为三基因连锁(TGB)的一组三个连续的稍微重叠的病毒基因决定BNYVV的细胞至细胞之间的移动，这三个基因依次编码病毒蛋白P42，P13和P15 (基因产物由其以千道尔顿计而计算的Mr命名)。[0010]BMYV的基因组由具有六个主要的开放阅读框(0RF0-5)的线性正义RNA组成。ORFl和0RF2编码涉及病毒复制的蛋白质，而其他3个ORF (0RF3、0RF4和0RF5)每一个编码结构蛋白(主要和次要的衣壳蛋白)和推定的运动蛋白(putative movement protein)进行。
[0011]已经证明BMYV的PO蛋白具有较差的表达，这是POAUG不利起始密码子背景和维持低表达的强烈倾向的后果。此外，这部分的基因组是高度可变的，而已经探索研究此序列多样性用于区分不同的种。
[0012]已经证明由BNYVV所致的疾病能够地域性地扩张，其速度取决于许多当地环境和农业要素的组合。因此，有必要改进遗传抗性的机制，这可能，单独或组合地，赋予工业用途种植的糖用甜菜植物以稳定而持久的抗性。
[0013]现有技术的状态
[0014]专利申请W02007/128755公开了一种TGB-3序列，其用于降低和/或抑制植物中野生型TGB-3的有害作用，以产生抗病毒性转基因植物，尤其是糖用甜菜对甜菜坏死黄脉病毒的抗性。
[0015]Carmen Simon-Mateo et al.,Biochimica et.,Biophysica Acta，1809Νο.11-12，722-731,2011公开了最近25年内用于获得病毒抗性植物的抗病毒策略。
[0016]A.Kozlowska-Makulska et al., Journal of General Virology Vol.91, N0.4,1082-1091,2010公开了来自甜菜感染马铃薯卷叶病毒属甜菜褪绿黄化病毒和甜菜轻型黄化病毒的不同分离株的PO蛋白的RNA沉默抑制物活性。
[0017]Pu Yan et al.Journal of Virological Methods Vol.166, N0.1-2,pagesl01-105,2010公 开了 RNA沉默构建体来通过表达病毒衍生的发夹RNA开发病毒抗性植物。
【发明内容】
[0018]本发明提供了在植物细胞或植物中，具体而言在糖用甜菜植物细胞或在糖用甜菜植物(可能由这些植物细胞产生)中赋予不表现出现有技术状态的缺点的病毒耐受性或抗性的方法和手段，优选赋予耐受性、抗性，优选极度抗性或完全抗性，尤其是BMYV (甜菜轻型黄化病毒)病毒耐受性或抗性(包括极度BMYV抗性或完全BMYV抗性)或优选综合的BMYV(甜菜轻型黄化病毒)和BNYVV (甜菜坏死黄脉病毒)耐受性或抗性(包括极度BMYV和BNYVV抗性或完全BMYV和BNYVV抗性)的方法和手段。
[0019]本发明进一步提供了如此可获得的、或由此方法获得并可以生长成表现出对以上提及的植物病毒增加的耐受性或抗性的植物的基因修饰或转化的植物细胞。
[0020]本发明还提供了源自这种转化的植物或植物细胞的后代，即病毒耐受性或病毒抗性后代、种子或其他可再生器官或结构。
[0021]本发明第一方面是一种包含具有从BMYV基因组的PO基因(或由编码BO蛋白的基因)或从直系同源基因推导的序列的正义区段序列和反义区段序列的RNA构建体，其中所述正义区段和所述反义区段序列都包含具有与来自BMYV基因组或直系同源基因的PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0022]优选地，在此RNA构建体中正义区段和/或反义区段序列进一步包含具有与紧邻PO基因核苷酸序列的5’ -端非翻译序列(5’ UTR)共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0023]更优选在此RNA构建体中，正义区段和反义区段序列包含具有与来自BMYV基因组的PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0024]有利地，在此RNA构建体中，正义区段和反义区段序列进一步包含具有与BMYV基因组的PI基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0025]可能的是，在这些RNA构建体中，正义区段包含或由序列SEQ.1D.NO:1组成和/或反义区段包含或由序列SEQ.1D.NO:3组成。
[0026]有利的是，在这些RNA构建体中，正义区段和反义区段序列进一步都包含与BNYVV基因组共有至少85%的序列同一性的核苷酸片段。
[0027]本发明的一个相关方面是可转录成此(这些)RNA构建体的DNA构建体。
[0028]另一个相关方面是包含这些(DNA)核酸构建体的核苷酸序列的载体。
[0029]另一个相关方面是由这些DNA构建体或载体表达的双链自身互补的RNA分子。
[0030]本发明还涉及用于在植物或植物细胞中诱导对至少BMYV病毒和可能的其他病毒耐受性或抗性、优选完全抗性的方法，所述方法包括以下步骤:制备本发明的核酸构建体(例如，包含由PO基因推导的和/或BMYV基因组的序列)，可操作地连接至一个或多个植物或植物细胞中有活性的调 控序列，和用核酸构建体转化植物细胞，由此在植物或植物细胞中诱导对至少BMYV病毒的抗性。
[0031]有利的是，这种方法进一步诱导对另一种病毒的耐受性，这种病毒选自由以下组成的组:芜菁黄化病毒、南瓜蚜传黄化病毒、马铃薯卷叶病毒、甘蔗黄叶病毒、豌豆耳突花叶病毒、甜菜西部黄化病毒-USA、甜菜褪绿病毒、谷物黄矮病毒和BNYVV病毒，优选BNYVV病毒。
[0032]一个相关方面是用于诱导对至少BMYV病毒的耐受性的方法，包括以下步骤:制备一种包含由BNYVV核苷酸序列推导的，优选由编码所述BNYVV的P15蛋白的基因推导的正义和反义区段的核酸构建体。
[0033]又一个相关方面是包含由PO基因推导的和/或BMYV基因组的序列和/或本发明的RNA、DNA或载体的序列的核苷酸序列用于在植物或植物细胞中诱导对BMYV病毒和/或对BNYVV病毒耐受性或抗性、优选完全抗性的应用。
[0034]另一个方面是对至少BMYV病毒和可能的一种或多种其他病毒具有耐受性或抗性的、优选完全抗性的转基因植物或转基因植物细胞，并且该转基因植物或转基因植物细胞包含能够表达可操作地连接至一个或多个植物或植物细胞中有活性的调控序列的本发明的核苷酸序列(包含由PO基因和/或由BMYV基因组推导的序列)的核酸构建体、包含本发明的载体、或包含本发明的双链自身互补RNA分子。
[0035]优选地，这种转基因植物或转基因植物细胞对其他选自由以下组成的组中的病毒具有抗性:芜菁黄化病毒、南瓜蚜传黄化病毒、马铃薯卷叶病毒、甘蔗黄叶病毒、豌豆耳突花叶病毒、甜菜西部黄化病毒-USA、甜菜褪绿病毒、谷物黄矮病毒和BNYVV病毒，优选BNYVV病毒。
[0036]优选地，这种转基因植物或转基因植物细胞选自由生菜、黄瓜、马铃薯、甘蔗、豌豆、大麦和糖用甜菜组成的组中，优选糖用甜菜或糖用甜菜细胞。
[0037]—个相关方面是衍生自(根据本发明的)这种转基因植物细胞的转基因植物组织和/或可再生结构，其中所述组织选自由果实、茎、根、块茎和种子组成的组或其中所述可再生结构选自由伤愈组织、芽或胚组成的组中。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1A和图1B不出根据本发明的病毒PO序列的片段(图1A和图1B ；SEQ.1D.NO: 13)，其中，用1352bp的矮牵牛内含子(下划线粗体，SEQ.1D.NO: 11)插入正义PO核苷酸序列(SEQ.1D.0:1，短于完整的PO序列SEQ ID NO:17)和相应的同源反义PO核苷酸序列(粗体，SEQ.1D.NO: 3)间。图1B中以粗体斜体表示几个核苷酸。它们对应于病毒BMYV基因组的5’UTR。在图1B中以斜体和下划线表示的其他几个核苷酸不属于PO也不属于内含子，但仍然存在，因为这些是克隆策略的残余物。包含完整发夹(SEQ.1D.NO: 13)的构建体也被称为hpPO构建体I。 [0039]图2 (A和B)示出根据本发明的病毒PO序列的另一个片段(图2A和图2B ;SEQ.1D.NO: 14)，其中，用91bp的甜菜内含子序列(下划线粗体，SEQ.1D.NO: 12)插入正义PO核苷酸序列和反义PO核苷酸序列(粗体)间。图2B中以粗斜体表示几个核苷酸。它们对应于病毒BMYV基因组的5’ UTR0图2B中以斜体和下划线表示的其他几个核苷酸，既不属于PO，也不属于内含子，仍然存在，因为这些都是克隆策略的残余物。此处的正义和反义PO核苷酸序列与图1B中给出那些相同。包含完整发夹(SEQ.1D.0:14)的构建体也被称为hpPO构建体2。
[0040]图3突出了 SEQ.1D.NO:1的5’ -端与由SEQ ID NO: 17表示的POBMYV编码序列的5’ -端相比的差异。图3中带下划线的序列对应于SEQ.1D.NO:1的非功能性5’ -前导序列。
[0041]图4 (A和B)是pFGC5941载体的示意图，将以下引入其中:将PO基因的片段按照正义(SEQ.1D.N0:1)和反义(SEQ.1D.N0:3)的方向、由矮牵牛的查耳酮合成酶A基因的内含子序列(CHSA ；SEQ.1D.NO: 11)插入其间(图 4A，pFGC5941，构建体 I ；SEQ.1D.NO: 13)，或由91nt的甜菜内含子序列(SEQ.1D.NO: 12)插入其间(图4B, pFGC5941，构建体2 ；SEQ.1D.NO: 14)。CaMV35S启动子:CaMV的启动子35S ;0CS3’:章鱼碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；MAS启动子:甘露碱合成酶基因的启动子；MAS3’:甘露碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；BAR:巴斯塔(Basta)除草剂(草丁膦)抗性基因；pVSl:pVSl的复制起点；NPTI1:卡那霉素抗性基因；LB、RB:左和右T-DNA边界。
[0042]图5是用构建体I (具有矮牵牛内含子的hpPOu)获得的抗性试验的统计分析。每个直方图代表具有10株BMYV接种的植物(Y)的标准误差的平均BMYV滴定度。hp:发夹；Inf:感染的。在Y轴上:通过ELISA0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2获得的光密度(Α4(ι5)。在X轴上，从左至右为:转基因系:hpP0-7、hpP0-8、hpP0-9、hpP0-10、hpP0-ll 和 hpPO-12 ；BMYV感染对照=ColOInf ；ColO健康。
[0043]图6是用构建体2 (具有甜菜内含子的hpPOu)获得的抗性试验的统计分析。每个直方图代表具有10株BMYV接种的植物的标准误差(Y)的平均BMYV滴定度。hp:发夹；hpPO:构建体I ；hpP0甜菜:构建体2 ；Inf:感染的。在Y轴上:通过ELISA0、0.5、1、1.5、2、
2.5、3获得的光密度(A405)。在X轴上，从左至右为:转基因系:hpP0_12 (构建体l)、hpP0甜菜-1 (构建体2)、hpP0甜菜-2、hpP0甜菜_3、hpP0甜菜_4、hpP0甜菜_5、hpP0甜菜-6、hpPO甜菜-7和hpPO甜菜-8 ；BMYV感染对照:Col0Inf ；Col0健康。[0044]图7是分别用构建体I和构建体2获得的抗性试验的统计分析。每个柱状图代表具有10株接种植物的标准误差(Y)的平均病毒滴定度。分别而言，暗灰色的柱状图代表由BMYV-EK克隆的感染而浅灰色柱状图代表由蚜虫传播的BMYV-2itb分离株的感染。hp:发夹；hpP0:构建体I ;hpP0甜菜:构建体2 ；Inf:感染的。在Y轴上:通过ELISA0、0.5、1、1.5、2、2.5获得的光密度(A405)。在X轴上，从左至右为:转基因系:hpP0_9 (构建体I)、hpP0-10、hpPO-12、hpPO甜菜-2 (构建体2)、hpPO甜菜-7和hpPO甜菜_8 ;感染对照:ColOInf ；ColO 健康。
[0045]图8 示出 WT PO 序列(SEQ.1D.0:17 和 18)。
[0046]图9 (A和B)示出根据本发明的发夹构建体hpP15A4_P0的序列(图9A和图9B，SEQ.1D.NO: 15)，该构建体用91bp的甜菜内含子序列(下划线的粗体，SEQ.1D.NO: 12)插入正义P15A4-P0核苷酸序列(SEQ.1D.NO:7，斜体核苷酸用于P15A4序列，其中3个突变被加下划线，并且正体核苷酸(usual nucleotides)用于PO序列；与WT P15相比:A被C替换而AG被GC替换。)和对应于反义P15A4-P0核苷酸序列的SEQ.1D.NO: 8 (粗斜体用于P15A4并且粗体用于PO)之间。以粗体斜体和下划线表示图9B中的一些核苷酸。这些对应于病毒BMYV基因组的5’ UTR0图9B中仍然存在的加下划线的其他几个核苷酸既不属于P15A4-P0也不属于内含子，由于它们是克隆策略的残余物。包含完整发夹的构建体(SEQ.1D.NO: 15)也被称为hpP15A4-P0构建体I。
[0047]图10 (A和B)代表根据本发明的发夹构建体hpP0-P15A4_A和hpP0_P15A4_B的序列(图1OA和图10B, SEQ.10.吣:16)，用9讣?的甜菜内含子序列(下划线的粗体，SEQ.1D.NO: 12)插入正义PO-P15A4核苷酸序列(SEQ.1D.NO:9，正体核苷酸用于PO序列并且斜体核苷酸用于P15A4序列，3个突变被加下划线)和对应于反义P0-P15A4核苷酸序列的SEQ.1D.NO: 10。这两个发夹构建体之间的差异是在hpP0-P15A4 - B构建体的P15A4序列中存在两个额外的核苷酸(加框的核苷酸)。图1OB中的一些核苷酸以粗斜体表不并加下划线。这些对应于病毒BMYV基因组的5’UTR。图1OB中仍然存在加下划线的其他几个核苷酸，既不属于P0-P15A4也不属于内含子，由于它们是克隆策略的残余物。包含完整发夹(SEQ.1D.NO: 16)的构建体也称为hpP0-P15A4-A构建体2和hpP0_P15A4 - B构建体3。
[0048]图11(A和B)是将P15A4-P0序列或P0-P15A4序列按照正义和反义方向引入其中的PFGC5941载体的图示，由91nt的甜菜内含子序列(图llA，pFGChpP15A4_P0，构建体1，而图 llB，pFGChpP0-P15A4-A 和 pFGChpP0_P15A4_B，分别为构建体 2 和 3)插入其间。CaMV35S启动子=CaMV的启动子35S ;0CS3’:章鱼碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；MAS启动子:甘露碱合成酶基因的启动子；MAS3’:甘露碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；BAR:巴斯塔除草剂抗性基因；pVSl:pVSl的复制起点；NPTI1:卡那霉素抗性基因；LB，RB:左和右T-DNA边界。
【具体实施方式】
[0049]考虑甜菜产区中两种病毒的出现，本发明人已经开发出对一种或两种(BMYV和/或BNYVV)病毒、或者甚至对能够感染该相同植物的另外的病毒是抗性的转基因植物。
[0050]事实上，BNYVV是主要关注的问题并且本发明人预期BMYV流行对种植也有风险。
[0051]本发明第一方面涉及一种RNA构建体(如发夹RNA,优选下文中描述为hpPO),该载体包含具有由PO基因(或核苷酸序列)或由BMYV基因组的基因(编码BO蛋白的核苷酸序列)或由直系同源基因推导(即，共有至少85%的序列同一性)的序列或具有由BMYV基因组推导的(即，共有至少85%的序列同一性)序列的正义(RNA)区段和反义(RNA)区段(两者都)。
[0052]有利地，该(发夹；hpP0)RNA构建体包含的正义(RNA)区段和反义(RNA)区段(两者都)进一步包含由BMYV的5’ -非翻译区(5’ -UTR)(紧邻这个编码BMYV的PO或直系同源基因的基因)推导(即，共有至少85%的序列同一性)的(RNA)(正义和/或反义)片段和/或该(发夹)RNA构建体包含具有同时由该5’ -UTR的核苷酸片段和由BMYV的PO核苷酸序列或直系同源基因的(紧邻)核苷酸片段推导的序列的正义RNA区段和反义RNA区段。
[0053]优选地，5’ -UTR和PO核苷酸序列的这些片段在所述BMYV基因组中是紧邻的。
[0054]这种RNA发夹，当包含5’ -UTR和PO的片段时，在本发明中优选称之为hpPOu核苷酸序列。
[0055]可能地(但较不优选地),根据本发明的该(hpPO和/或hpPOu (RNA)发夹)构建体不包含具有由其他病毒，如BNYVV基因组推导的序列的片段。
[0056]有利的是，根据本发明的这些RNA (发夹；hpP0和/或hpPOu)构建体包含的正义RNA区段和反义RNA区段进一步具有(是片段)由BNYVV基因组推导的序列，优选来自BMYV基因组(紧邻PO)除了 5’ -UTR序列外和/或这些RNA (发夹；hpP0和/或hpPOu)构建体包含的正义RNA区段和反义RNA区段(包含具有由PO基因推导的序列的片段)都进一步包含与(一部分)BNYVV基因组共有至少85%序列同一性的核苷酸片段。
[0057]更优选地，这 种由BNYVV基因组推导的正义和反义RNA区段是对应于BNYVV基因组的(一部分)P15序列的正义和/或反义序列(当它是发夹时，本文以下还称之为hpP0-P15或hpP0u-P15，后者进一步包含由BMYV基因组的5’-UTR序列推导的核苷酸片段)。
[0058]有利的是，这种hpPO和/或hpPOu RNA (发夹)构建体也包含具有由BMYV的Pl核苷酸序列推导的序列的正义和反义核苷酸(RNA)片段。
[0059]在本发明的上下文中，“直系同源基因”是指在不同物种中保留相同功能(例如，在进化的过程中)的基因。在表1中提供了 BMYV基因组的PO基因(或核苷酸序列)的直系同源基因的实例。
[0060]表1:确定的PO序列直系同源的非穷举列表
[0061]
【权利要求】
1.一种RNA构建体，包含具有由BMYV基因组的PO基因或由直系同源基因推导的序列的正义区段序列和反义区段序列，其中，所述正义区段序列和所述反义区段序列都包含具有与来自BMYV基因组的PO基因(SEQ.1D.NO: 17)或直系同源基因具有至少85%的序列同一'I"生的序列的核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的RNA构建体，其中，所述正义区段和/或反义区段序列进一步包含具有与紧邻来自所述BMYV基因组的PO基因核苷酸序列的5’ -端非翻译序列(5’ UTR)共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
3.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述正义区段和反义区段序列包含具有与来自BMYV基因组的所述PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
4.根据权利要求3所述的RNA构建体，其中，所述正义区段和反义区段序列进一步包含具有与BMYV基因组的PI基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
5.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述正义区段包含所述序列SEQ.1D.NO:1或由所述序列SEQ.1D.NO:1组成和/或所述反义区段包含所述序列SEQ.1D.NO:3或由所述序列SEQ.1D.NO:3组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述正义区段和反义区段序列都进一步包含与所述BNYVV基因组共有至少85%的序列同一性的核苷酸片段并且优选其中所述正义区段包含SEQ.1D.NO:5的片段并且所述反义区段包含SEQ.1D.N0:6的片段。
7.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中，所述一个或多个区段和所述一个或多个片段包含大于10个的核苷酸，优选15至25个核苷酸。
8.—种可转录成根据前述权利要求1至7中任一项所述的RNA构建体的DNA构建体。
9.一种包含根据前述权利要求1至8中任一项所述的核酸构建体的核苷酸序列的载体。
10.一种由根据权利要求8所述的DNA构建体或由根据权利要求9所述的载体表达的双链自身互补RNA分子。
11.一种用于在植物或植物细胞中诱导耐受性或抗性的方法，优选对至少所述BMYV病毒和可能的另外病毒的完全抗性，所述方法包括以下步骤:制备根据前述权利要求1至9中任一项所述的核酸构建体，可操作地连接至在植物或植物细胞中有活性的一个或多个调控序列，以及用所述核酸构建体转化所述植物细胞，由此在所述植物或所述植物细胞中诱导对至少所述BMYV病毒的抗性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，其他病毒选自由芜菁黄化病毒、南瓜蚜传黄化病毒、马铃薯卷叶病毒、甘蔗黄叶病毒、豌豆耳突花叶病毒、甜菜西部黄化病毒-USA、甜菜轻型黄化病毒、谷物黄矮病毒和BNYVV病毒组成的组，优选所述BNYVV病毒。
13.一种用于诱导对至少BMYV病毒的耐受性的方法，包括以下步骤:制备包含由BNYVV核苷酸序列推导的，优选由编码所述BNYVV的P15蛋白的基因推导的正义区段和反义区段的核酸构建体。
14.一种对至少BMYV病毒和可能的一种或多种其他病毒具有耐受性或抗性的转基因植物或转基因植物细胞，优选是完全抗性的，并且所述转基因植物或转基因植物细胞包含能够表达根据权利要求1至7中任一项所述的核苷酸序列的核酸构建体、优选包含可操作地连接至植物或植物细胞中有活性的一个或多个调控序列的根据权利要求8所述的DNA构建体、和/或包含根据权利要求9所述的载体、和/或包含根据权利要求10所述的双链自身互补RNA分子。
15.根据权利要求14所述的转基因植物或转基因植物细胞，选自由生菜、黄瓜、马铃薯、甘蔗、豌豆、大麦和糖用甜菜组成的组中，优选糖用甜菜或糖用甜菜细胞。
16.一种源自根据权利要求14或15所述的转基因植物细胞的转基因植物组织和/或可再生结构，其中所述组织选自由果实、茎、根、块茎和种子组成的组中或者其中所述可再生结构选自由伤愈组织、芽或胚组成的`组中。
【文档编号】C12N15/82GK103635581SQ201280031063
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】埃洛迭·克莱因, 韦罗妮克·格拉夫, 戴维·吉尔默, 韦罗妮克·布罗, 居伊·魏恩斯, 马克·勒菲弗 申请人:西斯凡德尔哈维公众公司