专利名称：刺参希瓦氏菌hs7菌株及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从刺参肠道优势菌群中分离的益生菌，尤其是一种可作为刺参饲料添加剂的刺参希瓦氏菌HS7菌株。
背景技术：
近年来，食品和环境安全问题的各类事件已经产生巨大的社会影响。我国水产品多起残留事件不但给养殖业造成了巨大的经济损失，而且也为我们食品和环境安全敲响了警钟。随着集约化程度的的不断提高，刺参养殖业面临着种质退化、病害频发等问题，以抗生素和化学消毒剂为代表的传统抗病手段已逐渐被禁止和取代，寻求替代抗生素等传统手段的益生菌成为当前的研究重点。因此，从健康刺参体内筛选高效专用的益生菌对降低刺参养殖风险，实现绿色无公害养殖具有重要意义。肠道正常微生物群对维持动物(宿主)正常消化功能，抑制非正常菌在肠道内的定植十分重要。有研究结果表明，动物肠道正常微生物群对动物机体的饲料消化吸收、抵抗病害以及健康生长等方面发挥着显著作用，健康动物的肠道优势菌群和次优势菌群可以作为益生菌的来源。国内广泛应用于水产行业的益生菌大多源自陆生动物或借鉴陆生动物思路研制，甚至有厂家直接将淡水种的益生菌不加选择的应用于海水养殖系统，其功能效应较难充分发挥。有的益生菌虽然有一定的效果，但也存在难定植的不足，效果不能持续。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可作为刺参饲料添加剂的刺参希瓦氏菌HS7菌株及用途。本发明的技术解 决方 案是:一种刺参希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)，属于希瓦氏菌，菌株代码HS7,拉丁文学名Shewanellajaponica,已2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC M 2012513。所述刺参希瓦氏菌HS7菌株的16S rDNA的基因片段如下: CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGG
ACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCC
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1)能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促进刺参消化吸收的能力，可提高刺参的生长 生倉泛;
2)在水体中能够存活并且对藻类无杀灭作用；大量地增殖，可与水体中病原菌竞争营养以及分解了水体中的有机质，起到净化水质的作用；
3)是真正意义上的可定植优势菌，能够调节肠道正常微生态平衡，提高机体免疫力，在肠道内能够同病原菌竞争黏附位点，可以替代化学药物进行疾病防治且不破环生态环境。
图1是依据16S rDNA序列构建的刺参希瓦氏菌HS7菌株的系统进化树图。菌种保藏日期:2012年12月6日
保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
保藏号:CCTCC M 2012513。
具体实施例方式1.刺参希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)，属于希瓦氏菌，菌株代码HS7，拉丁文学名SlwwaiwllB japonica,已2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为 CCTCC M 2012513。2.刺参希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)的制备方法:
I)刺参来源
采自大连海域。2)菌株的分离与纯化
用75 %酒精冲洗刺参体表。在无菌条件下，用剪刀剪开刺参体腔，取出刺参消化道，用0.9 %生理盐水冲洗肠道外壁，挤出肠道内容物，将肠壁置于无菌试管中，称重后将肠壁置于研钵中，用5 mL无菌生理盐水充分研磨均匀为样品。用无菌生理盐水对样品进行倍比稀释至10_6，各稀释度样品均用旋窝振荡器震荡均匀。选取合适梯度，分别取100 μ L涂布2216Ε平板，每个平板3个重复，28°C培养5 d。挑取不同形态的菌株在2216E培养基上多次划线分离纯化，直到单一菌落为止。将得到的纯种菌株保存于-80°C备用。所述的221 6E培养基的组分及配比为:蛋白胨5 g，酵母膏I g，磷酸高铁0.01 g，海水 1000 mL, pH 7.2 7.4，121°C灭菌 20 min。
刺参希瓦氏菌HS7菌株的鉴定:I)形态学的特征刺参希瓦氏菌HS7菌株在2216E培养基上生长呈粉红色，表面光滑，生长良好。培养特征见表I。
表I刺参希瓦氏菌HS7菌株的培养特征
形状I颜色I光滑度 I凸起程度I边缘I透明度I大小I菌体特征I革兰氏染色 HS7 I圆状I粉红色I光滑湿润I高起 I全缘I不透明|2mn |杆状单个|阴性
2)刺参希瓦氏菌HS7菌株的分子生物学鉴定。(I)刺参希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA的基因片段序列测定
将刺参希瓦氏菌HS7纯培养物接种于普通肉汤，28°C摇床培养48 h，离心收集菌体，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。扩增刺参希瓦氏菌HS7菌株16SrDNA的基因采用通用引物，正向引物为:5 ; - CAGGCCTAACACATGCAAGTC - 3 ;(对应于万.16S rDNA 5 ; 43_63f)，反向引物为:3' - GGGCGGffGTGTACAAGGC - 5 ;(对应于万.16S rDNA 3 ; 1405-1387r),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系(50 yL):Mix 25 μ L, ddH20 19UL，正向引物I yL，反向引物I yL，DNA4 μ L0 PCR反应条件:在94°C预变性5 min，进入循环扩增阶段:94°C变性45 s— 53°C复性45 s — 72°C延伸90 S，循环32次，最后720C延伸7 min。结束反应后，PCR产物用I %的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收，上海生工生物工程技术服务有限公司测序。刺参希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA的基因片段序列长度是1438 bp。
16S rDNA 序列如下:CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGG
ACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCC
CTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTA
ATGGCTTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG
GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTAGCAGCTTAATACGTTGTTACTGTGACGTTACCTACA
GAAGAAGGACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
TAAAGCGTACGCAGGCGGTTCATTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGT
GAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTG
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TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC
AACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGA
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCT
TATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAA
GTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCAAGGTCT
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CGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCA
CCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGAGGACGTTAACCAACGGTTGGTTCATGTGT(2)刺参希瓦氏菌HS7菌株序列分析和系统进化树的构建
将测定的刺参希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA序列，与GenBank数据库中的所有已测定的原核生物16S rDNA进行比对，依据同源序列搜索结果，下载数株同代表菌株相似度最高的菌株的16S rDNA序列，与代表菌株一同根据Clustal W方法进行匹配排列(Alignment),用MEGA5.0 软件中的 Kimura2_Parameter Distance 模型以及 neighbour-joining 分析法构建得到系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。刺参希瓦氏菌HS7菌株的系统发育树见图1。试验例1:刺参希瓦氏菌HS7产酶能力分析
将刺参希瓦氏菌HS7菌株点种于蛋白酶选择培养基、淀粉酶选择培养基和脂肪酶选择培养基上，28°C培养48 h。若菌落周围产生透明环，说明菌株具有相应产酶活力，测量并记录菌落周围透明环与菌落直径比值。相关培养基配方如下:
蛋白酶选择培养基:酪蛋白10 g，酵母膏I g，琼脂16 g，人工海水1000 mL ;调pH至7.4。121.5°C，灭菌 20 min。淀粉酶选择培养基:可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏I g，琼脂16 g，人工海水 1000 mL ;调 pH 至 7.4。121.5。。，灭菌 20 min。脂肪酶选择培养基:蛋白胨10 g，吐温一80 10 mL, CaCl2.7Η20 0.1 g，琼脂9 g，人工海水 1000 mL ;调 pH 至 7.4。121.5°C，灭菌 20 min。实验结果见表2。表2刺参希瓦氏菌HS7菌株产酶能力分析
权利要求
1.一种刺参希瓦氏菌HS7菌株，分类命名为Japonica希瓦氏菌(.Shewanellajaponica ),已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为为CCTCC M2012513。
2.根据权利要求1所述的刺参希瓦氏菌HS7菌株，其特征在于:所述刺参希瓦氏菌HS7菌株的16S rDNA的基因片段如下:CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTAGCAGCTTAATACGTTGTTACTGTGACGTTACCTACAGAAGAAGGACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTCATTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGTGAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGCCTTGAGCACTGGGCTCCCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCAAGGTCTAGCTAATCTCATAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGAGGACGTTAACCAACGGTTGGTTCATGTGT 。
3.—种如权利要求1或2所述的刺参希瓦氏菌HS7菌株作为刺参饲料添加剂的用途。
全文摘要
本发明公开一种刺参希瓦氏菌HS7菌株(CCTCCM2012513)，分类命名为刺参Japonica希瓦氏菌HS7(Shewanellajaponica)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为为CCTCCM2012513，可作为刺参饲料添加剂使用。能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促进刺参消化吸收的能力，可提高刺参的生长性能；在水体中能够存活并且对藻类无杀灭作用；大量地增殖，可与水体中病原菌竞争营养以及分解了水体中的有机质，起到净化水质的作用；是真正意义上的可定植优势菌，可以替代化学药物进行疾病防治且不破环生态环境。
文档编号C12N1/20GK103232950SQ20131002908
公开日2013年8月7日 申请日期2013年1月27日 优先权日2013年1月27日
发明者许淑芬, 刘小林, 常亚青, 费世洲, 王高学, 张喜昌, 冷晓飞, 李丹 申请人:大连海宝渔业有限公司