专利名称：一种融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
具有特定功能基团的手性醇在手性药物制备中占有重要地位，其为多种抗病毒、 抗真菌、抗肿瘤及治疗神经系统、心血管等疾病的手性药物的重要中间体。因此，手性醇合成方法的成熟与改进对手性药物的合成具有积极的促进作用。
酶催化法由于具有催化效率高，一般情况下是无机催化剂效率的100倍以上，而且产物的纯度很高，反应条件温和，一般在室温条件下就能反应，因此，近年来酶催化法在手性醇的制备研究中被广泛关注。乙醇脱氢酶具有催化效率高且产物对映体纯度高的优势而被广泛应用于手性醇的转化研究，该酶属于短链的氧化还原酶超家族(SDRs)的一员， 为同源四聚体，每个单体的分子量是26. 6kD，每个单体含251个氨基酸，催化产生特异性的 R-构型产物。但由于该酶催化过程中需要消耗体系中的还原型辅酶，还原型辅酶的额外添加使反应成本显著增加。因此开发体系中还原性辅酶再生的方法成为研究的关键。发明内容
本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。
本发明提供的融合蛋白，为将乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到的蛋白质。
上述融合蛋白中，所述连接肽为(EAAAK)2，为刚性结构linker，其氨基酸序列为序列2自N’末端第365-374位。
上述融合蛋白中，所述乙醇脱氢酶来源于短乳杆菌(Lac tobacillus brevis),所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)；
所述融合蛋白具体是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活的由序列2衍生的蛋白质。
编码上述融合蛋白的基因也是本发明保护的范围。
上述基因是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子
(I)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活蛋白的DNA分子；
(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且编码具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活蛋白的DNA分子。
其中序列表中序列2自N’末端第375-625位为乙醇脱氢酶；自N’末端第365-374位为linker ；自N’末端第1-364位为甲酸脱氢酶。
序列表中序列自5’末端第1123-1878位为乙醇脱氢酶编码基因；自5’末端第 1093-1122位为linker编码基因；自5’末端第1-1092位为甲酸脱氢酶编码基因。
含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为上述融合蛋白的基因插入表达载体中，得到表达上述融合蛋白的重组载体。在本发明的实施例中，表达载体为pETDuet-Ι，重组载体 pETDuet-FDH-linker-ADH具体为将序列表中序列I插入表达载体pETDuet-Ι的NcoI和 XhoI酶切位点间得到的载体。
上述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中，得到的重组菌。
上述融合蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高甲酸脱氢酶酶活性或制备乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤发酵上述重组菌，收集发酵产物，即得到乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶。
本发明的实验证明，本发明提供了一种由乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到的融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，且融合蛋白中的甲酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，融合后的乙醇脱氢酶在有机底物中的稳定性及热稳定性均强于单独表达时的情况。该融合蛋白表现出的酶活性的提高及酶在有机底物中的稳定性及热稳定性增强，提示该酶在催化制备手性醇及手性羟基化合物时具有更加优势的催化效果，为手性醇及手性羟基化合物制备方法的改进提供参考。
图1为重组菌诱导表达SDS-PAGE分析结果
图2为不同苯乙酮浓度下ADH的残留活性结果
图3为不同温度下ADH的残留活性结果具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、融合蛋白及其编码基因的获得
本研究选用催化活性高且对映体选择性强的短乳杆菌(Lactobacillus brevis) 来源的乙醇脱氢酶(ADH)和博伊丁假丝酵母Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶(FDH), 根据大肠杆菌密码子偏爱性原则，对两酶基因分别进行密码子优化。将在乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶之间加入刚性结构linker (EAAAK)2,得到融合蛋白FDH-1inker-ADH,该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序 列2。该融合蛋白的编码基因为序列表中的序列I。
其中序列表中序列2自N’末端第375-625位为乙醇脱氢酶；自N’末端第365-374 位为linker ；自N’末端第1-364位为甲酸脱氢酶。
序列表中序列I自5’末端第1123-1878位为乙醇脱氢酶编码基因；自5’末端第1093-1122位为linker编码基因；自5’末端第1-1092位为甲酸脱氢酶编码基因。
实施例2、融合蛋白及其编码基因的应用
一、双酶共表达载体的构建
1、重组载体 pETDuet-FDH-ADH 的构建
将含FDH的载体pGH-FDH (含FDH序列，全序列为序列3)用NdeI和Xhol酶切；得到的1164bp酶切产物与经过同样酶切的5364bp共表达载体pETDuet_l(Novagen, 71146-3) 骨架连接，得到中间载体PETDuet-FDH ；
将含ADH的载体pGH-ADH (含ADH序列，全序列为序列4)用BamHI和NotI酶切； 得到的768bp酶切产物与经过同样酶切的6484bp中间载体pETDuet_FDH骨架连接，得到重组载体pETDuet-FDH-ADH (经过酶切鉴定正确)。
2、重组载体 pETDuet-FDH-linker-ADH 的构建
以 pGH-FDH 为模板，以 FDHF: GACCATGGGCAAAATCGTTCTGGTTCTG, FLAR: TTTGGCCGCTG CTTCTTTGGCCGCTGCTTCTTTTT TGTCGTGTT 为引物，得到 1124bp 的 PCR 产物；以 pGH-ADH 为模板，以 FLAF:GCAGCGGCCAAAGAAGCAGCGGCCAAATCTAACCGTCTGGACADHR:GTCTCGAGTTACTGAGCGGT GTAAC为引物，得到79Ibp的PCR产物；
以上述两个PCR产物为模板，用FDHF和ADHR为引物进行融合PCR，得到 1896bpPCR产物(具有序列表中序列I所示的核苷酸)；1896bpPCR产物用NcoI和XhoI 酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的共表达载体pETDuet-Ι连接，得到重组载体 pETDuet-FDH-linker-ADH。
经过测序,该重组载体为将序列表中序列I插入表达载体pETDuet-Ι的NcoI和 XhoI酶切位点间得到的载体。
二、重组菌的构建及诱导表达融合蛋白
1、重组菌的构建
将上述一得到的两种重组载体pETDuet-FDH-ADH 和 pETDuet-FDH-linker-ADH 分别转化大肠杆菌 Rosseta (DE3)中，得到 Rosseta (DE3) /pETDuet-FDH-ADH和 Rosseta (DE3) / pETDuet-FDH-l inker-ADH。
2、重组菌诱导表达融合蛋白
将转化后的Rosseta (DE3)/pETDuet-FDH-ADH 和 Rosseta (DE3) / pETDuet-FDH-l inker-ADH分别涂布Amp+平板，分别挑取阳性转化子于37°C培养过夜，然后按1:100接种，37°C、200r/min振荡培养约3h，加IPTG至终浓度lmmol/L，20°C诱导8h，离心收集菌体沉淀备用。PBS洗涤两次，用PBS重悬，将菌体沉淀超声破碎后12000r/min离心 30min，分别收集每种菌的上清液及沉淀，对蛋白成分进行SDS-PAGE分析。
结果如图1 所示，I 为 Rosseta(DE3)/pETDuet-FDH_linker-ADH(上清)、2 为 Rosseta (DE3) /pETDuet-FDH-l inker-ADH ( 沉淀)、3 为 Rosseta (DE3) /pETDuet-FDH-ADH (上清)、4 为 Rosseta(DE3)/pETDuet-FDH-ADH(沉淀)、M 为 10_230KDa 的 marker ;可以看出， I与2中有分子量为66. 6KDa的融合蛋白FDH-1inker-ADH的表达，且双酶串联后的融合蛋白在上清中含量较高，说明双酶串联的融合蛋白能实现可溶性表达。而Rosseta(DE3)/ pETDuet-FDH-ADH不是融合表达，而是将两种酶分别同时表达。
说明上述超声破碎后离心得到的上清液即为FDH-1inker-ADH粗酶液和FDH-ADH粗酶液。
三、融合蛋白酶活性检测
1、双酶串联后的融合蛋白酶活性测定
为验证重组菌中双酶串联的融合蛋白的活性，将上述超声破碎后收集的上清液进行如下酶活性分析
乙醇脱氢酶酶活(ADH)的测定酶反应体系包括100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 值 7.0)，O. lmmol/LNADH，ImMMgCl2, 50mmol/L 苯乙酮和 IOOul 超声破碎粗酶液；在 340·!处测定(测60s)吸光值的下升。由标准曲线y=0. Ollx+O. 003 (R2=I)计算反应消耗NADH的量。酶活单位每分钟消耗I μ mo INADH所需要的酶量为一个酶活单位U。
甲酸脱氢酶酶活(FDH)的测定酶反应体系包括100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 值7. 0),0. 5mmol/L NAD+, 100mmol/L甲酸钠和IOOul超声破碎粗酶液；在340nm处测定(测 60s)吸光值的上升。由标准曲线y=0. Ollx+O. 003 (R2=I)计算反应生成NADH的量。酶活单位每分钟产生I μ mo I NADH所需要的酶量为一个酶活单位U。
结果如表I和表2所示，串联后的融合蛋白具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的活性， 串联表达后ADH的活性略有下降，而FDH的活性较融合前显著提高，可能是通过刚性结构连接肽串联后，FDH的C端原本不规则的空间结构形成了更易于活性发挥的定向结构，此外， 由于ADH为同源四聚体蛋白，所以其活性受融合表达的影响较大，显示出活性略有下降。以上结果说明双酶串联后仍能较好的保持两酶的活性。
表I为乙醇脱氢酶酶活测定结果
权利要求
1.一种融合蛋白，为将乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述连接肽的氨基酸序列为序列2 自N，末端第365-374位。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于所述乙醇脱氢酶来源于短乳杆菌(Lactobacillusb revis)，所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)；所述融合蛋白具体是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活的由序列2衍生的蛋白质。
4.编码权利要求1-3中任一所述融合蛋白的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因是如下(1)-(3)中任一种的DNA 分子(1)编码序列为序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶活蛋白的DNA分子。
6.含有权利要求4或5所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求1-3中任一所述融合蛋白的基因插入表达载体中，得到表达利要求1-3中任一所述融合蛋白的重组载体。
8.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中，得到的重组菌。
9.权利要求1-3中任一所述融合蛋白、权利要求4或5所述基因或权利要求6所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高甲酸脱氢酶酶活性或提高乙醇脱氢酶耐热性或提高乙醇脱氢酶在有机底物中的稳定性或制备乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶中的应用。
10.一种制备乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶的方法，包括如下步骤发酵权利要求6或 8所述重组菌，收集发酵产物，即得到乙醇脱氢酶和/或甲酸脱氢酶。
全文摘要
本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的融合蛋白为将乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到的蛋白质。所述乙醇脱氢酶来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)；所述连接肽为刚性结构linker(EAAAK)2。本发明的实验证明，本发明提供了一种由乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到的融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，其甲酸脱氢酶酶活比单独表达甲酸脱氢酶的活性提高，且乙醇脱氢酶在有机底物中的稳定性及热稳定性也有所提高。该融合蛋白的构建为手性醇及手性羟基化合物的制备方法的改进提供了重要参考。
文档编号C12R1/24GK103060281SQ20131002877
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者李玉霞, 陈惠鹏, 曲芬, 凌焱, 李炳娟, 岳俊杰, 孙芳, 毛艳, 张景海, 吴逊, 白东梅, 李伟东, 刘刚, 梁龙, 周围, 李北平, 高原 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所