共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，涉及共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用。本发明对转染试剂聚乙烯亚胺进行疏水性共价修饰，改变该阳离子聚合物的部分理化性质，制得共价疏水修饰的聚乙烯亚胺；该共价疏水修饰的聚乙烯亚胺具有式（Ⅰ）的结构。经测试结果表明，所述共价疏水修饰的聚乙烯亚胺对核酸的转染效率较未修饰的聚乙烯亚胺明显提高；其可制备转染试剂，用于动物或者人体水平的转基因动物或者基因治疗，或用于细胞水平的核酸转染。（Ⅰ）
【专利说明】共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，涉及共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和 应用；尤其涉及共价疏水修饰的聚乙烯亚胺在核酸转染中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，基因治疗、转基因动物操作中，重要的环节是将基因转入真核细胞，而将基 因转入真核细胞的技术可归纳为三种：（1)生化方法转染；（2)物理方法转染；（3)病毒介 导的转化。所述的生化方法转染中常用的生化试剂有：磷酸钙，二乙氨乙基-葡聚糖，阳离 子脂质体和阳离子聚合物。已知聚乙烯亚胺（polylethyleneimine, PEI)是最常用的阳离 子聚合物转染试剂(美国专利6013240);其作用机理推测为带负电荷的核酸和PEI静电吸 附形成PEI-DNA (PEI-RNA)复合物，然后该复合物和带负电荷的细胞膜静电吸附，再后通 过胞吞作用转入真核细胞内。美国专利6013240公开了阳离子聚合物PEI和阳离子脂质体 DOGS或DOPE能够协同作用提高转染效率；但实际使用中，仍发现其存在转染效率不高的缺 陷，尚需对其进行改进。
[0003] 因此，本发明的 申请人:拟提供一种共价疏水修饰的聚乙烯亚胺；其与细胞膜不仅 有静电吸附作用，还有疏水相互作用，使转染复合物更容易进入真核细胞内。迄今为止，尚 未见有关共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用；尤其 涉及该共价疏水修饰的聚乙烯亚胺在核酸转染中的应用；所述共价修饰的聚乙烯亚胺能提 高转染效率，可用于细胞核酸转染、转基因动物、基因治疗等。
[0005] 本发明中，利用有机化学手段对聚乙烯亚胺进行修饰，使其带有一定的疏水性，同 时在水溶液(或者PBS，DMEM培养基）中可溶或者部分可溶；经测试结果显示，修饰后的聚乙 烯亚胺较未修饰的聚乙烯亚胺对真核细胞的转染效率有显著提高，所述疏水修饰后的聚乙 烯亚胺与细胞膜不仅有静电吸附作用，还有疏水相互作用，使转染复合物更容易进入真核 细胞内。
[0006] 具体而言，本发明的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，对转染试剂聚乙烯亚胺（美国专 利6013240)进行疏水性共价修饰，改变其中的阳离子聚合物的部分理化性质；该共价疏水 修饰的聚乙烯亚胺的结构式如式（I )所示，
【权利要求】
1. 一种共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，其结构式如式（I )所示，
(I) 其中， 修饰基团为长度在1-20之间的直链或者支链烃基，选自饱和烃基、不饱和烃基、或其 他形式的疏水性的集团； 修饰方式选自氨基和羧基之间的缩合反应、或其他方式的共价修饰； 修饰位点为聚乙烯亚胺上的氨基、或碳原子； 共价修饰的烃基和聚乙烯亚胺单体的摩尔比为1:20(Tl: 1。
2. 按权利要求1所述的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于，所述共价修饰的烃 基和聚乙烯亚胺单体的摩尔比为l:2(Tl:5。
3. 按权利要求1所述的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于，所述共价疏水修饰 的聚乙烯亚胺其分子量为15_180kD。
4. 按权利要求1所述的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于，所述聚乙烯亚胺选 自支链聚乙烯亚胺，或支链聚乙烯亚胺。
5. 按权利要求1所述的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于，所述其他形式的疏 水性的集团是胆固醇。
6. 制备权利要求1的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺的方法，其特征在于，其包括步骤： (1) 共价修饰聚乙烯亚胺 聚乙烯亚胺溶于乙醇，油酸或者其他形式的脂肪酸或者胆酸溶于乙醇，添加羰基二咪 唑（CDI)，室温反应两个小时，制得共价疏水修饰的聚乙烯亚胺； (2) 纯化修饰后的聚乙烯亚胺 将上述反应产物用10倍体积甲苯稀释，冰上放置2h，抽滤，用冰冷甲苯洗两遍，收集洗 涤后的固体，冷冻干燥； (3) 配置修饰后聚乙烯亚胺溶液 用双蒸水或者PBS溶液或者TBS溶液溶解修饰后的聚乙烯亚胺，配成浓度为lmg/ml的 储液，制得共价疏水修饰的聚乙烯亚胺溶液。
7. 按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，还包括用稀盐酸降低溶液 的pH值。
8. 权利要求1所述的共价疏水修饰的聚乙烯亚胺在制备转染核酸的试剂中的应用。
9. 按权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核酸选自DNA或RNA。
10. 按权利要求8所述的应用，其特征在于，所述DNA或RNA的形式为环形、线形或发卡 结构。
【文档编号】C12N15/87GK104109241SQ201310133707
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】虞先濬, 秦毅, 徐近, 张波, 倪泉兴, 龙江, 刘辰, 刘亮, 许文彦, 吉顺荣 申请人:复旦大学附属肿瘤医院