提取酸化重金属尾矿中基因组总dna的方法

提取酸化重金属尾矿中基因组总dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，在酸化重金属尾矿中加入TE1缓冲液，涡旋振荡并离心处理后，加入TE2提取缓冲液和溶菌酶进行水浴处理；在液氮中冷却后在沸水浴中放置处理多次；加入SDS和蛋白酶K消化后进行离心处理；取离心后的上清液依次进行加入预冷的8mol/L?KAc进行冰浴后进行离心处理、加入酚氯仿异戊醇进行离心处理、加入氯仿异戊醇进行离心处理、加入3mol/L?NaAc和预冷异丙醇。进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀后自然晾干，加入TE溶解沉淀。操作简单，能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低pH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少。
【专利说明】提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酸化重金属尾矿的处理方法，尤其涉及一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法。
【背景技术】
[0002]基因组总DNA提取是PCR技术、限制性内切、分子杂交等分子生物学研究的基础，酸化重金属尾矿有其相对于土壤更特殊的环境，主要表现为高盐分、重金属种类多及含量高、高硫酸盐含量和低pH。在此条件下，酸化重金属尾矿中基因组总DNA总量相比较土壤要少，溶菌酶和其他酶的活性受到抑制。
[0003]现有技术中，普通的土壤基因组总DNA方法步骤如下:
[0004](I)取1.0g 土样，倒入灭菌的50mL离心管中，加入IOmLTENPP缓冲液[TENPP缓冲液组成:20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，50mmol/L Tris (三羟甲基氨基甲烷)，1%PVPP (交联聚乙烯吡咯烧酮)，100mmol/L NaCl (氯化钠),ρΗΙΟ.0]用振荡仪振荡数分钟,使土样悬浮并充分混匀。
[0005](2) 10000r/min离心5min,弃上清,重复洗漆3-5次,至上清液基本无色。
[0006](3)加入5mL PBS缓冲液[缓冲液组成:2.7mmol/L KC1(氯化钾)，IOOmmoI/L NaCl，2mmol/L KH2PO4 (磷酸二氢钾)，10mmol/L Na2HPO4 (磷酸氢二钠)，ρΗ7.4]漂洗，10000r/min离心5min,弃上清。
[0007](4)加入 13.5mL DNA 提取缓冲液[100mmol/L Tris, IOOmmoI/L EDTA, IOOmmoI/LNa3PO4 (磷酸钠)，1.5mol/L NaCl，1%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，ρΗ8.0]，混匀后液氮反复冻融3次，加入100 μ L蛋白酶K (25mg/mL)和200 μ L溶菌酶(50mg/mL，ρΗ8.0)，37°C水浴30min,期间颠倒混匀3次。
[0008](5)加入2mL20%SDS (十二烷基苯磺酸钠)，65°C水浴2h，期间颠倒混匀5-6次，8000r/min室温15min,取上清至新管。
[0009](6)用等体积氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇体积比为24:1)抽提，吸出水层，加入0.6倍体积的异丙醇，4°C沉淀Ih或更长。
[0010](7)11000r/min4°C离心 20min,沉淀 DNA,去上清,用 70% 乙醇漂洗，11000r/min4°C离心5min，并重复漂洗I次，置于超净工作台吹干。
[0011](8)干燥后，用100 μ L ddH20 (重蒸水)[含RNase (核糖核酸酶)20mg/mL]溶解，转入1.5mL离心管,37°C放置30min。
[0012]取3 μ L用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明上述现有技术中的土壤DNA提取方法不能有效地提取酸化重金属尾矿中的DNA。

【发明内容】

[0013]本发明的目的是提供一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，该方法操作简单，能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低PH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，可满足分子生物学实验的需要。
[0014]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0015]本发明的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，包括步骤:
[0016]A、在酸化重金属尾矿中加入TEl缓冲液，涡旋振荡并离心处理I至3次，弃上清液；
[0017]B、加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37°C恒温水浴锅中水浴处理；
[0018]C、在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；
[0019]D、加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；
[0020]E、取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/L KAc (醋酸钾)进行冰浴后,进行离心处理；
[0021]F、取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；
[0022]G、取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；
[0023]H、取步骤G离心后的上清液加入3mol/L NaAc (醋酸钠)和预冷异丙醇，室温沉淀2h ；
[0024]1、进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。
[0025]由上述本发明提供的技术`方案可以看出，本发明实施例提供的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，在酸化重金属尾矿中加入TEl缓冲液，涡旋振荡并离心处理I至3次，弃上清液；加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37°C恒温水浴锅中水浴处理；在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/LKAc进行冰浴后，进行离心处理；取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；取步骤G离心后的上清液加入3mol/LNaAc和预冷异丙醇，室温沉淀2h ;进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干,加入TE溶解沉淀。操作简单,能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低PH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，可满足分子生物学实验的需要。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1为现有技术中使用普通土壤提取方法提取酸化重金属尾矿基因组总DNA的
0.8%琼脂糖凝胶电泳示意图；
[0027]图2为本发明实施例一中酸化重金属尾矿基因组总DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳示意图；
[0028]图3为本发明实施例三中酸化重金属尾矿基因组总DNA的16S rRNA扩增PCR产物电泳示意图。
【具体实施方式】
[0029]下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。[0030]本发明的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，其较佳的【具体实施方式】包括步骤:
[0031]A、在酸化重金属尾矿中加入TEl缓冲液，涡旋振荡并离心处理I至3次，弃上清液；
[0032]B、加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37°C恒温水浴锅中水浴处理；
[0033]C、在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；
[0034]D、加入SDS (十二烷基苯磺酸钠)和蛋白酶K，放入65°C恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；
[0035]E、取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/L KAc进行冰浴后，进行离心处理；[0036]F、取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；
[0037]G、取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；
[0038]H、取步骤G离心后的上清液加入3mol/L NaAc和预冷异丙醇，室温沉淀2h ；
[0039]1、进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE (TE 为 Tris-EDTA 缓冲液，市场购买，组成成分:10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,PH=8.0)溶解沉淀。
[0040]具体包括步骤:
[0041]A、取0.5g酸化重金属尾矿，置于1.5mL离心管中，加入ImL TEl缓冲液，涡旋振荡5min, 6000r/min离心5min,弃上清液,再加入ImlTEl缓冲液,润旋振荡5min, 6000r/min离心5min,弃上清液；
[0042]B、加入600 μ L ΤΕ2提取缓冲液和10 μ L浓度为100mg/mL的溶菌酶，放入恒温水浴锅中37°C水浴Ih,每IOmin颠倒混匀一次；
[0043]C、在液氮中冷却5min，迅速在沸水浴中放置5min，如此重复3次；
[0044]D、加入120 μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒温水浴锅中65°C消化Ih,期间每IOmin颠倒混匀一次，降至常温后,8000r/min离心IOmin ；
[0045]E、取步骤D中离心后的上清液加入0.2倍体积的预冷的8mol/L KAc，冰浴20min，10000r/min4°C离心 IOmin ；
[0046]F、取步骤E离心后的上清液加入等体积的酚氯仿异戊醇(酚:氯仿:异戊醇体积比为 25:24:1), 12000r/min 离心 IOmin ；
[0047]G、取步骤F离心后的上清液加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇体积比为24:1), 12000r/min 离心 IOmin ；
[0048]H、取步骤G离心后的上清液加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的预冷异丙醇，室温沉淀2h ；
[0049]1、14000r/min4°C离心lOmin，弃去离心后的上清液，用500 μ L浓度为70%的乙醇
洗涤沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
[0050]所述TEl 缓冲液配方:0.lmol/L 磷酸缓冲液，3mol/L EDTA,0.lmol/L Tris-HCl,pH=8.0:
[0051]所述TE2提取缓冲液配方:0.lmol/L磷酸缓冲液，3mol/L EDTA, 0.lmol/LTris-HCl,1.5mol/L NaCl,1%CTAB,pH=8.0 ；[0052]酸化重金属尾矿中的基因组总DNA的提取与普通土壤的提取的差别在于，酸化重金属尾矿的重金属种类多、含量高，高盐分，呈酸性，酸化重金属尾矿中的基因组总DNA含量比普通土壤低。酸化重金属尾矿中的重金属以及酸性环境会抑制溶菌酶的活性，要获得高浓度的基因组总DNA，首先需要去除重金属、调节电导率和pH，避免其对溶菌酶活性的影响。EDTA能有效地螯合重金属，在提取尾矿重金属之前使用具有高浓度EDTA的缓冲液可以去除尾矿中大量的重金属。使用本发明的缓冲液可以有效稳定样品的PH和电导率。同时为保证基因组总DNA的纯度，蛋白酶K、SDS和酚氯仿异戊醇(酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24: I)可以去除大量的蛋白质，CTAB、KAc也可以有效地去除多糖类物质。本发明操作简单，获得的DNA条带清晰，完整性好，纯度高，杂质含量少。
[0053]具体实施例:
[0054]实施例一，提取酸化重金属尾矿基因组总DNA，包括步骤:
[0055](I)取0.5g左右酸化重金属尾矿，置于1.5mL离心管中，加入ImL TEl缓冲液，涡旋振荡5min,6000r/min离心5min,弃上清液,再加入ImlTEl缓冲液,润旋振荡5min,6000r/min离心5min,弃上清。
[0056](2)加入600 μ L ΤΕ2提取缓冲液和10 μ L溶菌酶(100mg/mL)放入恒温水浴锅中37°C水浴Ih,每IOmin颠倒混匀一次。
[0057](3)在液氮中冷却5min,迅速在沸水浴中放入5min,如此重复3次。
[0058](4)加入120 μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒温水浴锅中65°C消化Ih,期间每IOmin颠倒混匀一次。降至常温,8000r/min离心lOmin。
[0059](5)取上述离心后的上清液加入0.2倍体积的预冷的8mol/L KAc,冰浴20min，10000r/min4°C离心 lOmin。
[0060](6)取上述离心后的上清液加入等体积的酚氯仿异戊醇(酚:氯仿:异戊醇体积比为 25: 24:1), 12000r/min 离心 lOmin。
[0061](7)取上述离心后的上清液加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇体积比为24:I), 12000r/min 离心 IOmin0
[0062](8)取上述离心后的上清液加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的预冷异丙醇，室温沉淀2h。
[0063](9)14000r/min4°C离心lOmin，弃去上述离心后的上清液，用500 μ L70%乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
[0064]取3 μ L用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明用本发明方法得到的DNA亮度高，比较丰富，比较清晰，样品间的重复性较好。
[0065]与现有技术中传统的土壤DNA提取方法相比，本方法提取的DNA有更好的稳定性，提取出来的DNA浓度较高。
[0066]实施例二，测定样品中基因组总DNA的浓度和纯度:
[0067]利用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，分别测提取的DNA溶液在260nm、280nm时的吸光值，本发明方法提取DNA的吸光值如表1所示，传统的土壤DNA提取方法获得的DNA的吸光值如表2所示，计算得到DNA样品的浓度和纯度。
[0068]表1本发明方法提取的酸化重金属尾矿基因组总DNA的纯度和浓度
[0069]
【权利要求】
1.一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，其特征在于，包括步骤: A、在酸化重金属尾矿中加入TEl缓冲液，涡旋振荡并离心处理I至3次，弃上清液； B、加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37°C恒温水浴锅中水浴处理； C、在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次； D、加入SDS和蛋白酶K，放入65°C恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理； E、取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/LKAc进行冰浴后，进行离心处理； F、取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理； G、取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理； H、取步骤G离心后的上清液加入3mol/LNaAc和预冷异丙醇，室温沉淀2h ； I、进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。
2.根据权利要求1所述的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，其特征在于，具体包括步骤: A、取0.5g酸化重金属尾矿，置于1.5mL离心管中，加入ImL TEl缓冲液，涡旋振荡5min, 6000r/min离心5min,弃上清液,再加入ImL TEl缓冲液,润旋振荡5min, 6000r/min离心5min,弃上清液； B、加入600μ L ΤΕ2提取缓冲液和10 μ L浓度为100mg/ml的溶菌酶，放入恒温水浴锅中37°C水浴Ih,每IOmin颠倒混匀一次； C、在液氮中冷却5min，迅速在沸水浴中放置5min，如此重复3次； D、加入120μ L20%SDS和10 μ L100mg/mL蛋白酶K，放入恒温水浴锅中65°C消化lh，期间每IOmin颠倒混匀一次，降至常温后,8000r/min离心IOmin ； E、取步骤D中离心后的上清液加入0.2倍体积的预冷的8mol/L KAc,冰浴20min，10000r/min4°C离心 IOmin ； F、取步骤E离心后的上清液加入等体积的酚:氯仿:异戊醇体积比为25: 24:1的酚氯仿异戊醇，12000r/min离心IOmin ； G、取步骤F离心后的上清液加入等体积的氯仿:异戊醇体积比为24: I的氯仿异戊醇，12000r/min 离心 IOmin ； H、取步骤G离心后的上清液加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的预冷异丙醇，室温沉淀a ； 1、14000r/min4°C离心lOmin，弃去离心后的上清液，用500μ L浓度为70%的乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入50 μ LTE溶解沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，其特征在于: 所述 TEl 缓冲液配方:0.lmol/L 磷酸缓冲液，3mol/L EDTA，0.lmol/L Tris-HCl,pH=8.0: 所述TE2提取缓冲液配方:0.lmol/L磷酸缓冲液，3mol/L EDTA,0.lmol/L Tris-HCl,1.5mol/L NaCl,1%CTAB, pH=8.0。
【文档编号】C12N15/10GK103509787SQ201310496889
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】孙庆业, 李杨, 杨扬 申请人:安徽大学