一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有shRNA干扰载体，该shRNA干扰载体上设有启动子-shRNA-miR30的元件排列。该口服重组酵母能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道DC细胞传递shRNA新方法，该方法可以有效的解决现有技术中向DC呈递时存在的弊端，能够广泛应用于基因治疗。
【专利说明】—种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学和基因工程【技术领域】，涉及一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用。
【背景技术】
[0002]基因治疗(Gene Therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。纠正的途径既可以是修复有缺陷的基因，也可以是按需求调控异常基因的表达，从而实现对缺陷基因的治疗。常用的基因治疗分为两类，一类为基因修正和基因置换，即基因打靶技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因抑制，即在不敲除异常基因的情况下，通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异阻断某些基因的转录或翻译，从而抑制基因的表达，实现基因治疗。
[0003]RNA干扰(RNA interference)是普遍存在于真核生物细胞内的一种可以高特异性的抑制祀基因表达的自然现象。这种基因沉默机制往往使用siRNA(small interferingRNA)或shRNA(short hairpin RNA)来实现。目前已经有超过30种临床试验使用21种不同的siRNA或者shRNA来进行基因治疗。由于使用RNAi技术一方面可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，具有较高的特异性和高效性，另外由于其发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，具有一定的安全性，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
[0004]shRNA作为siRNA的前体通常使用病毒、细菌两种工具进行传递，一般根据不同的应用选择不同的运载工具。目前使用shRNA活体治疗采用的方法是先在体外利用细菌或者病毒将shRNA传递到靶细胞中，然后将修饰的靶细胞重新注入患者体内，这种方式耗时，成功率低，风险大。因此亟需寻找一种安全有效的shRNA传递工具，将shRNA干扰技术安全、广泛的应用与基因治疗领域。`
[0005]树突状细胞(Dendritic cells, DC)是机体内功能最强的抗原呈递细胞(Antigenpresenting cells, APC),能够高效地摄取、加工处理和呈递抗原，处于调控和维持免疫应答的中心环节，是肿瘤细胞免疫治疗的重要组成部分。传统的DC细胞治疗通过采用病人自体的单核细胞在体外培养诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成负载肿瘤抗原的DC,再将这些DC细胞注入体内后刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖，发挥肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用，达到消灭肿瘤的目的，但这种方式操作繁琐、耗时长，费用昂贵等特点，因此亟需寻找一种能够快速、安全并能活体治疗DC细胞的方式。
[0006]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为普遍公认的安全菌被广泛应用于食物、饮料加工等行业，与我们的生活息息相关。酿酒酵母可以通过口服的方式被活体食用，方便安全。和细菌相比，酿酒酵母可以有效的抵抗抗生素作用，同时还可以高效的存活于活体动物的胃肠道环境而不被降解。
【发明内容】
[0007]本发明解决的问题在于提供一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用，通过基因工程发酵酵母疫苗向活体动物肠道DC细胞靶向递呈shRNA干扰载体，可用于DC细胞的治疗。
[0008]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0009]一种口服重组酵母，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有shRNA干扰载体，该shRNA干扰载体上设有hU6启动子-shRNA-miR30的元件排列。
[0010]所述的shRNA干扰载体上设有hU6-shRNA-miR30的元件排列，其中shRNA的序列为SEQ.1D.N0.1~SEQ.1D.N0.3所示的一种或几种。
[0011]所述的hU6的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示，miR30的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5 所示。
[0012]所述的shRNA干扰载体为JMB84-hU6-shRNA-miR30载体，该载体是将hU6启动子克隆到载体JMB84上得到JMB84-hU6，再将miR30克隆到JMB84_hU6中hU6的下游得到JMB84-hU6-miR30载体，然后将shRNA干扰序列克隆到JMB84-hU6_miR30中的miR30之间得到 JMB84-hU6-shRNA-miR30。
[0013]所述的宿主细胞为酵母菌株JMYl[MATa，hi s3-Λ I trpl-289 radl-Δura3-52]，shRNA干扰载体通过LiAc的方法转染到宿主细胞中。
[0014]所述的口服重组酵母在制备靶向肠道树突状细胞呈递shRNA的制剂中的应用。
[0015]所述的口服重组酵母在制备靶向肠道树突状细胞呈递shRNA并抑制其⑶40蛋白表达量的制剂中的应用。
[0016]所述制剂为增加细胞因子表达量的制剂，所述的细胞因子包括IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α 和 INF-Y。
[0017]所述的口服重组酵母在向肠道树突状细胞呈递shRNA中的应用。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0019]本发明提供的口服重组酵母，能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道DC细胞传递shRNA新方法，该方法可以有效的解决现有技术中向DC呈递时存在的弊端，能够广泛应用于基因治疗。
[0020]本发明提供的口服重组酵母介导的靶向肠道DC呈递shRNA，该方法能够快速、安全并且高效的用于活体动物肠道DC细胞的治疗，克服了传统技术上耗时长、风险大、费用昂贵、不易活体治疗等缺陷，为DC细胞活体治疗提供新途径。另外，酿酒酵母作为一种常用的安全模式生物，对生物体没有副作用，因此作为药物传递载体是可行的。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为PCR扩增hU6启动子；
[0022]图2 为 KpnI/Sall 酶切鉴定 JMB84_hU6 载体；
[0023]图3 为 Sall/SacI 酶切鉴定 JMB84-hU6_miR30 载体；
[0024]图4为三步PCR扩增shRNA干扰序列示意图；
[0025]图5 为 XhoI/SacI 酶切鉴定 JMB84-hU6-shRNA_miR30 载体；[0026]图6 为 JMB84-hU6-shRNA-miR30 干扰载体图谱；
[0027]图7为ELISA检测细胞因子分泌量；
[0028]图8为Western blot检测肠道树突状细胞CD40蛋白表达量。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0030]一、JMB84-hU6 载体的构建
[0031]1、以人基因组DNA为模板，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计能够特异扩增hU6启动子序列的引物hU6-F和hU6-R，并在上游引物hU6-F中引入KpnI酶切位点，下游引物hU6-R中引入SalI酶切位点。序列设计如表1_1:
[0032]表1-1 hU6启动子基因PCR扩增引物
[0033]
【权利要求】
1.一种口服重组酵母，其特征在于，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有shRNA干扰载体，该shRNA干扰载体上设有hU6启动子-shRNA_miR30的元件排列。
2.如权利要求1所述的口服重组酵母，其特征在于，所述的shRNA干扰载体上设有hU6-shRNA-miR30的元件排列，其中shRNA的序列为SEQ.1D.N0.1~SEQ.1D.N0.3所示的一种或几种。
3.如权利要求2所述的口服重组酵母，其特征在于，所述的hU6的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示，miR30的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示。
4.如权利要求1或3所述的口服重组酵母，其特征在于，所述的shRNA干扰载体为JMB84-hU6-shRNA-miR30载体，该载体是将hU6启动子克隆到载体JMB84上得到JMB84-hU6,再将miR30克隆到JMB84_hU6中hU6的下游得到JMB84-hU6_miR30载体，然后将 shRNA 干扰序列克隆到 JMB84-hU6-miR30 中的 miR30 之间得到 JMB84-hU6-shRNA_miR30。
5.如权利要求1所述的口服重组酵母，其特征在于，所述的宿主细胞为酵母菌株JMYl [MAT a，his3- Δ 1 trp 1-289 radl-Δ ura3_52]，shRNA 干扰载体通过 LiAc 的方法转染到宿主细胞中。
6.权利要求1所述的口服重组酵母在制备靶向肠道树突状细胞呈递shRNA的制剂中的应用。
7.权利要求2所述的口服重组酵母在制备靶向肠道树突状细胞呈递shRNA并抑制其CD40蛋白表达量的制剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，该制剂为增加细胞因子表达量的制剂，所述的细胞因子包括 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, TNF- α 和 INF- Y。
9.权利要求1所述的口服重组酵母在向肠道树突状细胞呈递shRNA中的应用。
【文档编号】C12R1/865GK103695327SQ201310647359
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】张智英, 张龙, 邵斯旻, 徐坤, 李欣憶, 徐华荣 申请人:西北农林科技大学