一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途，具体提供了人类血小板12个抗原组成系统基因分型的参比质粒、该参比质粒的用途、含有以上参比质粒的试剂盒以及该试剂盒的用途。本发明为临床上的人类血小板抗原基因分型提供了便利，有助于血小板输注无效患者针对性开展血小板制品同型输注，并为评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度提供了重要的参考依据。
【专利说明】—种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途
[0001]【【技术领域】】
本 发明涉及分子生物学和临床诊断【技术领域】，具体地说，是一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途。
[0002]【【背景技术】】
随着输血医学的发展，成分输血不断推广使用，血小板输注已经成为临床输血治疗的重要手段之一。人类血小板抗原(HPA)是分布在血小板膜糖蛋白上的一类具有型特异性的抗原。目前，血清学方法已检出34个血小板抗原，其中12个抗原组成系统，包括HPA-la、HPA-1b, HPA-2a、HPA_2b、HPA_3a、HPA_3b、HPA_4a、HPA_4b、HPA_5a、HPA_5b、HPA_15a、HPA-15b。在临床产生的HPA抗体中，针对这些抗原的抗体占据绝大多数，充分体现了其临床重要性。HPA在临床上具有特定意义，可介导机体产生同种抗体，由同种免疫可引发多种疾病,如血小板输注无效、输血后紫癜、新生儿同种免疫性血小板减少症等。为此,准确进行HPA的基因分型，开展血小板同型输注，对于临床输血具有重要的意义，也是输血领域的发展方向。
[0003]目前已报道的基因分型方法种类很多，主要是基于检测SNP，以PCR反应为基础。由于绝大多数HPA基因多态性都表现为单核苷酸多态性(SNP)，因此检测SNP的方法基本都适用于HPA的基因分型，其共同特点是均以聚合酶链式反应(PCR)为基础，不同之处在于PCR引物设计和检测产物的方法。然而，对于HPA基因分型参比体系的研究鲜有报道，可能与一些HPA基因型别在人群中频率极低，对应的基因参比品难以获得有关。
[0004]在基因分型实验中遇到某些低频或高频等位基因时，往往缺乏标准参比品(质控DNA)作为对照。但是，由于SNP只有一个碱基的差异，某些方法难免出现引物非特异错配，最终导致实验结果不够准确。因此，为促进临床血小板同型输注，规避输血风险，提供一种HPA基因分型参比品，用于评估HPA基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度，具有十分重要的意义。
[0005]中国期刊《中国输血杂志》，2011年05月第24卷第05期，刊出的论文“人类血小板抗原基因分型参考品的制备及鉴定”，构建了 22型人类血小板抗原基因分型参考品，并对其进行了测序鉴定，其方法是提取人血液基因组DNA，以其为模板，通过特异性引物扩增出各HPA(la~16a)基因片段，胶回收后克隆至pUCm-T载体，随后转化Ε.coli DH5a，提取质粒酶切鉴定并测序；再以构建成功的HPA-la~16a质粒为模板，通过定点突变获得HPA_llTl6bW基因片段，经克隆、转化后，作酶切鉴定并测序。最终获得了 HPA-1a~16a、HPA-1lT16bw基因片段，克隆出各型HPA基因分型参考品质粒，其序列与GenBank中公布的数据完全一致。结论:各型HPA基因分型参考品质粒的成功构建，解决了基因频率较低型别(HPA-ltTl6bw)质控DNA难以获得的实际问题，为HPA基因分型方法的研究奠定了基础。但是该论文构建了参比质粒后，仅使用测序方法鉴定了其准确性，首先并未进一步使用其他方法来验证构建的质粒的准确性；其次并未进一步应用这些参比质粒进行基因分型实验，。因此本领域技术人员根据该文献报道的内容并不能毫无疑义且直接地确定这些参比质粒在不同抗原组成系统中的分型结果判定方法，难以确定其可有效地用于基因分型中作为阴阳性对照的效力，也难以以该质粒来评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度。
[0006]【
【发明内容】
】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人类血小板抗原基因分型参比质粒。
[0007]本发明的再一的目的是，提供上述人类血小板抗原基因分型参比质粒的用途。
[0008]本发明的另一的目的是，提供一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒。
[0009]本发明的第四个目的是，提供上述人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒的用途。[0010]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种人类血小板抗原基因分型参比质粒，它是通过以下方法构建得到的:
a)用SEQ ID N0.1-24 的引物扩增得到 HPA-la、HPA_2a、HPA_3a、HPA_4a、HPA_5a 以及HPA-15a的基因片段；
b)将步骤a)的基因片段分别连入pGM-T载体得到高频等位基因分型参比质粒；
c)对步骤b)的高频等位基因分型参比质粒进行定点突变获得相应低频等位基因分型参比质粒。
[0011]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
[0012]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，所述的试剂盒至少包含如上所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒中的一种。
[0013]优选地，所述的试剂盒包含如上所述的所有人类血小板抗原基因分型参比质粒。
[0014]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
[0015]本发明优点在于:本发明利用分子生物学技术，包括PCR扩增，载体连接，转化克隆，以及定点突变技术建立了 HPA基因分型参比质粒，该参比质粒含有正确的HPA基因序列，并在不同的基因分型方法中起到了预期的效果。当使用限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法进行基因分型时，该参比质粒的酶切产物特征性条带差异明显，在琼脂糖凝胶上能很好地进行分辨，极大地方便了结果的判定，保证了判定的准确性。可将以上参比质粒制备成试剂盒，将为临床上HPA基因分型提供便利，有助于同型输注的开展，并为评估基因分型方法(如RFLP、SSP、SSCP、SSOP法等)的准确性、特异性和灵敏度提供重要的参考依据。
[0016]【【专利附图】
【附图说明】】
图1是不同HPA基因型PCR产物片段琼脂糖电泳结果。M:100bp DNA marker ;IaneI:HPA-1a ；lane 2:HPA_2a ；lane 3:HPA_3a ；lane 4:HPA_4a ；lane 5:HPA_5a ；lane 6:HPA-15a。
[0017]图2是所有参比质粒测序图谱，红色箭头所示为定点突变处。
[0018]图3是PCR-SSP对HPA-1基因分型琼脂糖电泳结果。每份样品均用商业试剂盒中的 “HPA-la”和 “HPA-lb”进行检测。M:1OObp DNA marker ；lanes I, 2:HPA_la 质粒；lanes 3，4 ；HPA-lb质粒；lanes 5~8:两份基因组DNA样品。
[0019]图4是针对HPA-1的PCR-RFLP后酶切产物琼脂糖电泳结果。M:1OObp DNAmarker ；lane 1:HPA_la 质粒；lane 2:HPA-1b 质粒；lanes 3, 4:两份基因组 DNA 样品。
[0020]【【具体实施方式】】
下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0021]实施例1 一、材料
E.coli T0P10菌株、pGM-T连接试剂盒、TIANamp血液DNA抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、内切酶MspI购自宝生物工程(大连)有限公司；定点突变试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司；PCR-SSP试剂盒购自美国G&T公司。
[0022]二、方法
1、引物设计
引物根据Genbank数据库中的标准HPA基因序列设计，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。
[0023]表1基因克隆和定点突变的引物设计序列
【权利要求】
1.一种人类血小板抗原基因分型参比质粒，其特征在于，它是通过以下方法构建得到的: a)用SEQ ID N0.1-24 的引物扩增得到 HPA-la、HPA_2a、HPA_3a、HPA_4a、HPA_5a 以及HPA-15a的基因片段； b)将步骤a)的基因片段分别连入pGM-T载体得到高频等位基因分型参比质粒； c)对步骤b)的高频等位基因分型参比质粒进行定点突变获得相应低频等位基因分型参比质粒。
2.权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
3.一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒至少包含权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒中的一种。
4.根据权利要求3所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的所有人类血小板抗原基因分型参比质粒。
5.权利要求3或4所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103911431SQ201410070306
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】李睿书, 陆萍, 凌冰, 刘达庄 申请人:上海市血液中心