一种hiv-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下a)或b)或c)：a)由序列1的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)或b)限定的蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV-1相关的蛋白质。实验证明，本发明所提供的HIV-1多表位重组蛋白具有很好的免疫原性，是一种具有应用前景的用于HIV-1预防和治疗的免疫活性蛋白。
【专利说明】—种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种Hiv-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)。自1981年世界报道首例艾滋病(AIDS)病例以来，短短30余年，艾滋病迅速在全球范围内蔓延扩散，成为当今全球最大的健康危机，也是影响我国公众健康的重要公共卫生问题。近年来，艾滋病感染在我国出现新的流行态势，即发病率逐年增加，感染对象覆盖不同人群，性传播比例增多，尤其是男-男同性恋病人上升显著，变异重组病毒在流行分离株中所占比例增多。如何有效防治HIV感染，降低发病率和病死率是我国面临的紧迫任务。疫苗是控制HIV感染的有效手段，虽然在HIV疫苗研发方面取得了重要的进展，一种能够同时诱导体液和细胞免疫的HIV疫苗RV144的临床III期试验表明，该疫苗能够在一定程度上降低HIV的感染从而降低艾滋病的发生，但仍然没有有效的疫苗应用于人群。应用HIV-1疫苗预防和治疗HIV-1感染仍然是HIV研究的重要课题。
[0003]一种有效的HIV疫苗应该能诱导针对不同流行株、适用于不同人群，由于我国流行的HIV病毒与其它国家和地区不同，人群MHC限制性不同，在疫苗设计时应该选择针对不同流行株和中国主要HLA亚型的HIV保护性表位，以期诱导有效的体液和细胞免疫应答。重组蛋白疫苗与核酸疫苗及活病毒载体疫苗相比具有更好的安全性，更加适于将来临床应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种HIV-1多表位重组蛋白及其编码基因与应用。
[0005]本发明所提供的HIV-1多表位重组蛋白，包含在中国主要HIV-1流行株中高度保守、且为中国主要HLA亚型MHC限制性的12个HIV-1 T细胞表位，将该蛋白命名为HIV-MEPl，具体可为如下(a)或(b)或(c)所述的蛋白质:
[0006](a)由序列表中序列I的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007](b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008](c)将序列表中序列I的第13-164位所示的氨基酸序列，或序列表中序列I所示的氨基酸序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV-1相关的由(a)或(b)衍生的蛋白质。
[0009]其中，序列I由164个氨基酸组成，第5-10位为6个His标签，第13-164位为HIV-1多表位蛋白。
[0010]所述HIV-MEPl蛋白在制备HIV-1疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
[0011] 活性成分为所述HIV-MEPl蛋白的HIV-1疫苗也属于本发明的保护范围。
[0012]根据需要，所述HIV-1疫苗中还含有佐剂，具体如铝佐剂。
[0013]所述铝佐剂即可为氢氧化铝佐剂，也可为磷酸铝佐剂。在本发明中，采用的所述铝佐剂具体为2%氢氧化铝(InvivoGen公司，其产品目录号为Vac-alu_250)。
[0014]在所述HIV-1疫苗中，所述HIV-MEPl蛋白与所述铝佐剂的质量配比可为25:1。
[0015]编码所述HIV-MEPl蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0016]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0017]在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述HIV-MEPl蛋白的基因(名称为HIV-MEG1.E)，所述HIV-MEG1.E基因为如下1)_4)中任一所述的DNA分子:
[0018]I)序列表中序列2的第37-495位所示的DNA分子；
[0019]2)序列表中序列2的第1-495位所示的DNA分子；
[0020]3)在严格条件下与I)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述HIV-MEPl蛋白的DNA分子；
[0021]4)与I)或2 )所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码所述HIV-MEPl蛋白的DNA分子。
[0022]上述严格条件可为用6XSSC，0.5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0023]其中，序列2由499个核苷酸组成，第13_30位编码序列I的第5_10位所示的6个His标签蛋白，第37-495位编码序列I的第13-164位所示的HIV-1多表位蛋白。序列2的第1-495位编码序列I所示的蛋白质。
[0024]含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0025]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0026]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为T5启动子。
[0027]更加具体的，所述重组表达载体为将序列表中序列2的第37-493位所示的DNA片段插入到PQE30载体的多克隆位点处得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为BamH I和Hind III。
[0028]所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0029](I)制备抗HIV-1病毒的药物；
[0030](2)治疗和/或预防艾滋病的药物。
[0031]所述蛋白质的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0032]所述蛋白质的制备方法，具体可包括如下步骤:将所述核酸分子导入目的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，培养重组大肠杆菌，得到所述蛋白质。
[0033]在所述方法中，所述目的大肠杆菌可为大肠杆菌M15。
[0034]在所述方法中，所述培养重组大肠杆菌的过程中，向培养体系中加入IPTG至终浓度为ImM，诱导培养4小时。
[0035]本发明所提供的HIV-1多表位重组蛋白(HIV-MEP1蛋白)与DNA疫苗相比，具有更好的安全性，同时具有较强的免疫原性，有望用于HIV的预防和治疗。BALB/c小鼠体内免疫学研究表明，HIV-MEPl蛋白单独免疫小鼠即可诱导机体产生较高水平的体液和细胞免疫应答，铝佐剂可以同时增强其诱导的体液和细胞免疫应答；、HLAA2.1/DR1转基因小鼠体内免疫学研究表明，HIV-MEPl可诱导人MHC限制性的特异性细胞免疫应答。说明HIV-1多表位重组蛋白(HIV-MEP1蛋白)具有很好的免疫原性，是一种具有应用前景的用于HIV-1预防和治疗的免疫活性蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为重组表达载体pQE30-HIV-MEPL E.coli的BamH I和Hind III酶切鉴定结果。其中，M为DNA分子量标准；1为重组表达载体pQE30-HIV-MEPl.E.coli经BamH I和Hind III酶切的结果。
[0037]图2为HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl的表达、纯化与鉴定。其中，A为HIV-MEPl蛋白纯化过程产物分析，M:蛋白分子量标准，1:8M脲溶解包涵体溶液，2:穿柱液，3:平衡缓冲液洗脱液，4:20mM咪唑洗脱液，5:50mM咪唑洗脱液，6:300mM咪唑洗脱液。B为纯化复性后的HIV-MEPl蛋白的SDS-PAGE分析结果。C为Western blot鉴定结果。
[0038]图3为HIV-1重组蛋白HIV-MEPl在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫和细胞免疫。其中，A为重组蛋白HIV-MEPl诱导的抗体水平及亚类分析；B为以12个HIV-1混合肽刺激小鼠脾细胞ELISP0T检测结果。图中，A1+HIV-MEP1即为添加了铝佐剂的组I 表示p〈0.01 ;*** 表示 ρ〈 0.001。
[0039]图4为HIV-1重组蛋白HIV-MEPl免疫的BALB/c小鼠不同肽激活脾细胞IFN Y ELISP0T结果。其中，P印pool为混合多肽作为刺激物，NC为阴性对照。图中，A1+HIV-MEP1即为添加了铝佐剂的组I。
[0040]图5为以HIV-MEPl蛋白和混合多肽刺激免疫铝佐剂+HIV-MEPl的人HLAA2.1/DR1转基因小鼠和C57/B6小鼠脾细胞IFN Y ELISP0T检测结果。图中，A1+HIV-MEP1即为添加了铝佐剂的免疫组。
[0041]图6为以不同肽单独刺激铝佐剂+HIV-MEPl免疫人HLA A2.1/DR1转基因小鼠和C57/B6小鼠脾细胞IFN Y ELISP0T结果比较分析。其中，A为ELISP0T代表性结果；B为每组小鼠统计得到的各样本的斑点形成细胞(SFC)的数目。图中，P1-P12即表示12条多肽Pepl_Pepl20
【具体实施方式】
[0042]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]下述实施例中主要试剂有:
[0045]胰蛋白胨、酵母提取物(Oxoid公司)；质粒提取试剂盒(TIANGEN公司)；限制性内切酶、T4连接酶(TAKARA公司)；最小截留分子量为3500Da的透析袋(北京瑞达恒辉公司)；异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、N1- NTA Resin (南京金斯瑞生物科技有限公司)；Western Blot发光试剂盒(Millipore)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(天根生化科技有限公司)。TMB显色液购自(万泰生物技术有限公司。鼠抗His抗体(中杉金桥生物技术有限公司)、HRP标记的山羊抗鼠IgG、IgGl、IgG2a (Southern B1tech公司);ELISP0T检测用HIV-1多肽，纯度95% (南京金斯瑞生物公司合成)。Mouse IFN-y ELI SPOT Set (551083),Mouse IL-4 ELI SPOT Set (551017)，显色底物 AEC Substrate Set (BD B1science,目录号551951);铝佐剂(2%氢氧化铝佐剂，InvivoGen公司，其产品目录号为Vac-alu-250)。
[0046]下述实施例中主要仪器有:
[0047]水平电泳仪(北京六一仪器厂)；高速低温冷冻离心机；超声波细胞粉碎机JY92-2D(宁波新芝生物科技股份有限公司)；高速低温离心机(HITACHI，CR22G III);垂直电泳仪、电转仪、电泳槽(北京六一仪器厂);核酸蛋白定量分析仪NanodroplOOO (Thermo公司)；凝胶图像分析系统ISlOOO (美国Alpha Ihnotech公司)；ELX_50型洗板机、ELX800型酶标仪(美国B1-TEK公司)；ELISP0T Reader (CTL公司)。
[0048]下述实施例中主要生物材料有:
[0049]pQE30载体=QiaGen公司产品
[0050]大肠杆菌M15 =QiaGen公司产品，目录号:34210。
[0051]BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠:雌性，6_8周龄，购买于军事医学科学院实验动物中心。
[0052]人HLA A2.1/DR1 转基因小鼠(HLA-A2.l-/HLA-DRl-transgenic H_2 class 1-/class I1-KO mice and HLA-A2.1-transgenic H-2 class 1-KO mice):以 C57/B6 为背景的转基因小鼠，为本发明发明人所在单位从法国十一大学引进的小鼠(参考文献PajotA, Michel ML, Fazilleau N, PancreV, Auriault C，Ojcius DM, Lemonnier FA, Lone YC.Amouse model of human adaptive immune funct1ns:HLA-A2.l-/HLA-DRl_transgenic H-2class 1-/class ΙΙ-knockout mice.Eur J Tmmunol.2004 Nov ；34(11):3060-9.
[0053]实施例1、HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl的表达和纯化
[0054]一、符合中国人群优势MHC限制性的保守表位筛选及DNA序列合成
[0055]于HIV Databases 获取 HIV-1 中国主要流行株(CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B) env、gag和pol基因上全部已报道的表位，筛选出所有序列保守且符合中国人群优势MHC限制性的表位，进一步将筛选的表位用连接序列GGGS串联后经大肠杆菌密码子优化，并于南京金斯瑞公司合成相应双链DNA(并且在两端分别加上BamH I和Hind III识别序列)，如序列表中序列2的第31-499位(其中第31-36位为BamH I识别序列，第494-499位为Hind III识别序列，第493-495位为终止密码子TAA)。将该双链DNA对应的基因命名为HIV-MEG 1.E基因。序列2的第37-495位编码序列表中序列I的第13-164位所不的HIV-1多表位蛋白。
[0056]二、HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl原核表达载体pQE30_HIV_MEPL E.coli的构建与鉴定
[0057]利用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切步骤一合成的两端带有相应酶切位点的双链DNA (序列表中序列2的第31-499位)，胶回收后与经过同样双酶切的pQE30载体(对于PQE30载体而言，在酶切位点BamH I的上游存在起始密码子ATG及6个His标签蛋白的编码基因)的骨架大片段相连，得到重组质粒。
[0058]将经BamH I和Hind III双酶切初步鉴定正确的重组质粒(得到大小约为460bp和3460bp的两个目的条带，如图1所示)送样测序。将经测序表明将PQE30载体的酶切位点BamH I和Hind III之间的小片段替换为序列表中序列2的第37-493位所示DNA片段的重组质粒命名为PQE30-HIV-MEP1.E.coli。在重组表达载体pQE30-HIV_MEPl.E.coli中，启动所述HIV-MEG1.E基因转录的启动子为T5启动子。在T5启动子的下游，整个ORF如序列表中序列2的第1-495位所示(第13-30位编码6个His标签蛋白)，编码序列表中序列I所示的蛋白质。
[0059]三、HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl的诱导表达
[0060]将步骤二构建并鉴定正确的重组表达载体pQE30-HIV-MEPl.E.coli转化大肠杆菌M15感受态，将鉴定正确的单克隆接种Amp+LB培养基，37°C、200rpm摇菌，当0D600为
0.4~0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，继续原条件摇菌4小时诱导蛋白表达；8000rpm离心4分钟收菌，菌体沉淀用适量PBS重悬洗涤后8000 rpm离心并重复洗涤一次，洗涤后菌体沉淀用适量蒸馏水重悬，超声破碎，超声条件为:功率40%，时长40分钟，占空比为3秒:3秒；超声完成后12000 rpm离心10分钟，收集超声上清，超声沉淀依次用适量包涵体洗液I (配方:体积分数0.5% TritoX-100,1OmmoI/LEDTA ;溶剂为水)、11 (配方:体积分数10% TritoX-100, 1mmoI/L EDTA ;溶剂为水)重悬，每次重悬后10000 rpm离心10分钟，弃上清，末次离心后沉淀用适量8M脲包涵体溶解缓冲液(NaH2PO4.2H20 15.6g ；Tris碱1.2g ;脲素480.5g ;去离子水定容至1L,用NaOH调pH至8.0)重悬，4°C过夜溶解。
[0061]四、HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl的纯化、复性与鉴定
[0062]将8M脲包涵体溶解缓冲液于12000rpm、4°C离心15分钟，收集离心上清液，过镍柱(GenScript)纯化目的蛋白，步骤如下:
[0063]将适量柱料填入重力柱中，静置待柱料自然沉降至柱底部，流出柱料保存液，一次用5倍柱体积的蒸馏水和平衡缓冲液(配方=NaH2PO4.2H20 15.6g ；Tris碱1.2g ;脲素480.5g ;去离子水定容至1L，用NaOH调pH至8.0)洗涤平衡柱料；将离心上清液加入重力柱中，控制流出速率为0.5-lml/min，回收流出液；向重力柱中加入5倍柱体积平衡缓冲液，控制流出速率为0.5-lml/min,回收流出液；向重力柱中加入8倍柱体积20mM咪唑洗脱液(配方:20mM咪唑溶于平衡缓冲液)，控制流出速率为0.5-lml/min，回收流出液；向重力柱中加入8倍柱体积50mM咪唑洗脱液(配方:50mM咪唑溶于平衡缓冲液)，控制流出速率为
0.5-lml/min，回收流出液；向重力柱中加入8倍柱体积300mM咪唑洗脱液(配方:300mM咪唑溶于平衡缓冲液)，控制流出速率为0.5-lml/min,回收流出液；各流出液取少量用于SDS-PAGE鉴定纯化结果。
[0064]各流出液的SDS-PAGE鉴定结果如图2中A所示，目的蛋白在300 mM咪唑洗脱液洗脱时目的蛋白纯度和得率最高。
[0065]本发明的发明人进一步根据各流出液的SDS-PAGE鉴定结果选择性将仅含有目的蛋白的洗脱液(300mM咪唑洗脱液)利用不同浓度尿素逐级透析复性后进行浓缩(利用PEG-6000浓缩法，将样品置于最小截留分子量为3500Da的透析袋中)，并取少量最终浓缩蛋白液进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。其中，Western Blot采用的一抗为鼠抗His抗体(中杉金桥生物技术有限公司，目录号:TA-02)，二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG(BDB1science,目录号:554021)。
[0066]纯化后复性HIV-MEPl蛋白的SDS-PAGE结果如图2中B所示，从图中可以看出得到了大小为16KD的单一目的条带,无其他杂带。Western Blot鉴定结果如图2中C所示，从图中可以清晰的看到目的信号，可见纯化后复性HIV-MEPl蛋白保持了较好的抗原性。
[0067]实施例2、HIV-1多表位重组蛋白HIV-MEPl在BALB/c小鼠体内的免疫学评价
[0068]—、动物免疫及标本采集:
[0069]将雌性BALB/c小鼠(6_8周龄)随机分为三组，即重组蛋白铝佐剂组(组I)、重组蛋白单独免疫组(组2)和PBS对照组(组3)，共免疫三次，每次免疫的时间间隔为4周，每次的免疫剂量相同。分组情况及免疫策略详见表1。
[0070]表1动物免疫实验分组及免疫策略
[0071]
【权利要求】
1.蛋白质，是如下(a)或(b)或(C): (a)由序列表中序列I的第13-164位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)将序列表中序列I的第13-164位所示的氨基酸序列，或序列表中序列I所示的氨基酸序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，得到的且与抗HIV-1相关的由(a)或(b)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质在制备HIV-1疫苗中的应用。
3.HIV-1疫苗，其活性成分为权利要求1所述蛋白质。
4.根据权利要求3所述的HIV-1疫苗，其特征在于:所述HIV-1疫苗中还含有佐剂； 所述佐剂具体为铝佐剂。
5.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子: 1)序列表中序列2的第37-495位所示的DNA分子； 2)序列表中序列2的第1-495位所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 4)与I)或2)所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
7.含有权利要求5或6所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体； 所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为T5启动子。
9.权利要求5或6所述的核酸分子，或权利要求7或8所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用: (1)制备抗HIV-1病毒的药物； (2)治疗和/或预防艾滋病的药物。
10.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤:将权利要求5或6所述核酸分子导入目的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，培养重组大肠杆菌，得到权利要求1所述蛋白质。
【文档编号】C12N15/49GK104163857SQ201410394686
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】周育森, 寇志华, 杨裔, 郭彦, 于虹, 孙世惠, 赵光宇, 李军锋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所