一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1a的特异引物组合的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，包括ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本发明同时还提供了根据上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特异引物组合进行PCR检测。本发明根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的ISSR引物扩增序列设计引物，通过PCR扩增，可以快速从其他水稻品种中鉴定三系杂交水稻不育系骏1A。本发明提供的三系杂交水稻不育系骏1A的鉴定方法，可用于上述水稻品种的纯度鉴定，进而在辅助其育种中进行应用。
【专利说明】-种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测【技术领域】，特别涉及一种用于检测三系杂交水稻不育系骏IA 的特异引物组合。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具有庞大的杂交水稻种子市 场。目前国内杂交水稻年种植面积约占水稻年种植总面积的59%以上，使水稻产量大幅度 提高，为保障我国的粮食安全做出了重要贡献。获得高纯度的杂交种子是充分发挥杂种优 势增产潜力的基础。机械混杂和生物学混杂是三系杂交水稻亲本杂株的主要来源。种子纯 度是衡量杂交水稻种子质量的主要指标，纯度的下降将导致作物产量和质量的明显降低。 低纯度、真实性差的杂交水稻种子给农业生产带来极大损失，是种子质检部门、育种研究单 位、制种单位和种子公司共同关心的问题。三系杂交水稻不育系的纯度是制约杂交稻生产 的关键因素。
[0003] 三系杂交水稻不育系"骏1A"为本 申请人:自主培育的，不育系"骏1A"与恢复系 "R0172"配组育成的三系杂交中稻品种"骏优172"，以及不育系"骏1A"与恢复系"R522"配 组育成的三系杂交早熟中稻品种"骏优522"，均已通过湖北省品种审定，抗稻瘟病，米质优， 是适合湖北省恩施州种植的农作物新品种。
[0004] 在实现上述研发的过程中，本申请的发明人发现现有技术至少存在以下问题：
[0005] 没有鉴定三系杂交水稻不育系"骏1A"的特异引物，无法将上述水稻品种与其亲本 区分开，不能对其进行快速的种子纯度分子标记鉴定和相关的分子标记辅助育种等工作。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的特异引物组合，解决了
【背景技术】中的问题，采用该引物组合能够快速、准确的对三系杂交水稻不育系骏IA进行鉴 定。
[0007] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
[0008] -种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的特异引物组合，包括ZJJU01、 ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其中ZJJUOl正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0009] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0010] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0011] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0012] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0013] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0014] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0015] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0016] 本发明同时还提供了根据上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的方 法，步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特异 引物组合进行PCR检测。
[0017] 所述的PCR反应条件为：95°C 5min ;95°C变性30s，65°C退火40s，其中每个循环降 低 0.7°C，72°C延伸 lmin30s，15 个循环；
[0018] 94°C变性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 个循环；72°C后延伸 lOmin。
[0019] 所述的PCR反应体系为：50ng/y 1的DNA模板0. 8μ 1，10XPCR缓冲液1μ 1，2. 5mM dNTPs 0. 8 μ 1，10 μ M 正、反向引物各 0. 2 μ 1，DNA 聚合酶 0. 5U，ddH20 补足至 10 μ 1。
[0020] 本发明还提供了一种含有上述特异引物组合的检测试剂盒。
[0021] 上述试剂盒能够在鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的纯度以及辅助其育种中进行 应用。
[0022] 本发明根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的ISSR引物扩增序列设计引物，通 过PCR扩增，可以快速从其他水稻品种中鉴定三系杂交水稻不育系骏1Α。本发明提供的三 系杂交水稻不育系骏IA的鉴定方法，可用于上述水稻品种的纯度鉴定，进而在辅助其育种 中进行应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本实施例中通过PCR反应在水稻中的扩增结果图A
[0024] 图2为本实施例中通过PCR反应在水稻中的扩增结果图Β。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图以及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范 围并不局限于以下实施例。
[0026] 以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 的《分子克隆：实验室手册》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中 所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂均为市售商品。
[0027] 本实施例提供的用于鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的特异引物组合，包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0028] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0029] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0030] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0031] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0032] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0033] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0034] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0035] 本实施例中采用上述引物组合来鉴定三系杂交水稻不育系骏IA的方法，步骤如 下：
[0036] 1.实验材料
[0037] I. 1植物材料
[0038] 中骏优1及其亲本不育系418A、保持系418B和恢复系R964,中骏优1的相似来源 不育系中九A和保持系中九B ;駿优522及其未本不育系駿1A、保持系駿IB和恢复系R522， 骏优522的的相似来源不育系福伊A和保持系福伊B。
[0039] L 2酶与试剂
[0040] 分子生物学试剂，TAKARA rTaq DNA聚合酶，10XPCR缓冲液，dNTP Mixture (2. 5mM)购自大连宝生物公司。
[0041] 其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成。
[0042] 1. 3实验仪器
[0043] 振荡破碎仪（Geno/grinder, USA);
[0044] PCR 扩增仪：PTC-1OOTM (MJ, USA);
[0045] 核酸电泳仪：DYYIII型YY0115-94(北京六一仪器厂）；
[0046] DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；
[0047] 其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。
[0048] 2.实验方法
[0049] 2. 1水稻基因组DNA的提取
[0050] 水稻单粒种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，依照参照冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin 和 Kaaren A. Janssen 编著的 《分子克隆》一书提取水稻材料的总DNA。
[0051] 2.2PCR 扩增
[0052] 根据能鉴定三系杂交水稻不育系骏IA及其组合的ISSR引物扩增序列设计的特异 引物，利用该4对引物组合，以水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增.
[0053] PCR 扩增体系为：10XPCR 缓冲液 1μ l，2.5mM dNTPs 0·6μ 1，10μΜ 正、反向引物 各(λ 2 μ 1，DNA 聚合酶(λ 5U，50ng/μ I DNA 模板(λ 5 μ 1，ddH 20 补足至 10 μ 1。
[0054] PCR扩增程序：95°C 5min ;95°C变性30s，65°C退火40s，（其中每个循环降低 0. 7°C ) 72°C延伸 lmin30s，15 个循环；94°C变性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 个循 环；72°C后延伸10min。
[0055] 3.实验结果
[0056] 扩增均以无菌水为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果 可靠。统计被检测材料的扩增带，阴性计为〇,阳性计为1。统计结果和聚类分析结果如下 表以及图1和图2所示。结果表明，本发明的4对分子标记组合可以将三系杂交水稻不育 系骏IA与其组合区分开。
[0057] 4对分子标记引物组合扩增2个三系杂交水稻组合的指纹图谱统计
[0058]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的特异引物组合，其特征在于：包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ； ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ; ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ; ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ; ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCmTCGGCCAGGA ; ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ; ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
2. -种基于权利要求1所述的引物组合的鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，其特 征在于步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特 异引物组合进行PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，其特征在于：所述的 PCR反应条件为：95°C 5min ;95°C变性30s，65°C退火40s，其中每个循环降低0. 7°C，72°C延 伸lmin30s，15个循环； 94°C变性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 个循环；72°C后延伸 10min。
4. 根据权利要求2或3所述的鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的方法，其特征在 于：所述的PCR反应体系为：50ng/iil的DNA模板0.8iil，10XPCR缓冲液liil，2.5mM dNTPs0.8ii l，10iiM 正、反向引物各 0.2ii 1，DNA 聚合酶 0.5U，ddH20 补足至 10ii 1。
5. -种含有权利要求1所述特异引物组合的检测试剂盒。
6. 权利要求5所述试剂盒在鉴定三系杂交水稻不育系骏1A的纯度以及辅助其育种中 的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104404147SQ201410693230
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】徐鑫, 刘学群, 谭艳平, 王春台, 熊杰 申请人:中南民族大学