专利名称：一种快速准确鉴定杂交水稻不育系和杂交种子纯度的方法
技术领域：
本发明涉及籼型杂交水稻不育系和杂交种纯度鉴定方法，属于农作物种子纯度鉴定技术领域。
我国杂交水稻在生产上的成功利用举世瞩目，对我国粮食生产作出了巨大贡献。近年来，年均种植面积都达到或超过水稻种植面积的50％以上。在杂交水稻生产上，杂交种子纯度直接关系到杂交稻产量潜力的发挥，关系到它的推广和应用。
在不育系繁殖中，保持系常常混杂于生产的不育系种子中。由于不育系和保持系两者属于同核异质的遗传关系，极难用一般方法和手段将其区分。在杂交种子生产中，由于大面积制种，常常不能及时、彻底地将混杂于不育系中的保持系除去，混杂于杂交种子中。同时，在收获杂交种时，恢复系的部分稻穗经常混入杂交种中发生混杂。由于上述混杂现象是难于避免的，不育系种子和杂交种子纯度都需要进行严格的鉴定，才能确保生产应用。
为了解决“三系”不育系繁殖和杂交制种的纯度鉴定问题，国内外都进行了一些研究和探索，但终究未能找到一种快速、准确的杂交种子纯度鉴定方法。在国家“七五”水稻重点攻关中，湖南杂交水稻中心利用荧光检测法对杂交种子纯度进行检测，但检测的可靠度、准确度都远远达不到要求；也有学者利用DNA分析技术对细胞核基因组的特定带谱进行区别鉴定，需要至少两个以上分子标记，加之基于核基因的鉴别往往与相似遗传背景的材料混淆，出现一些不确定因素，而且成本较高。即便如此，它对于不育系繁殖的纯度也是束手无策。到目前为止，唯一的方法就是将生产的不育系种子或杂交种子，经抽样带去海南岛进行纯度的种植鉴定。这种方法费事、费力、费时，且严重影响种子的计划和销售。这是杂交水稻推广以来，各级种子部门所期盼解决的重要技术难题之一。
本发明的目的旨在获得一种有效方法，将繁殖的不育系种子与混杂的保持系区分开来；将杂交种子与混杂的保持系和恢复系检测出来，从而快速、准确地鉴定不育系种子或杂交种子的纯度，最大限度地发挥杂交水稻杂种优势潜力。
本发明的特征在于依据不育系种子或杂交种子的细胞质与它的保持系和恢复系的细胞质具有一定差异，包括DNA和蛋白质差异，并通过一个具有独特DNA序列的引物，利用现代DNA聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)技术，将不育系种子或杂交种子的纯度快速、准确鉴别。其详细鉴定方法如下一种快速、准确鉴定杂交水稻不育系种子和杂交种子纯度的方法。包括种子处理，DNA样品制备，聚合酶链反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，结果观察方法。
种子处理为将水稻不育系或杂交种种子置于25℃条件下，浸种48小时；再转入培养皿中，32℃进行湿润催芽24小时，25℃培养3-4天。
DNA样品制备为分别将每粒稻谷的幼芽和嫩叶取下，剪成0.5厘米长小段，放入碾缸中，加入250ul DNA提取液，碾磨成匀浆；再加入250ul DNA提取液混匀，转入1.5ml离心管，加入300ul氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡5分钟后，以3000转/分转速离心30秒，将上清液转入另一个1.5ml离心管中，加入500ul 100％冰冻乙醇混合后，静置5分钟，再离心1分钟去掉上清液，加入400ul 70％乙醇冲洗2次或/和离心20秒后，去掉乙醇、干燥，溶解于30ul TE缓冲液中待用。
聚合酶链反应为将2ul提取的DNA样品加入0.5ml离心管中，再加入8ul反应液后，加入半滴石蜡油，进行PCR循环反应，反应循环依次为94℃/2’30”循环1次；94℃/40”,53℃/1’,72℃/1’30”循环35次；72℃/8’；最后，将10ul 3×终止反应液加入0.5ml反应离心管充分混匀，放入-20℃贮藏待用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳为将大、小各一张的电泳玻璃用蒸馏水擦净，再用95％乙醇擦净，用新鲜配置的硅化剂均匀涂擦小块电泳玻璃，干燥5分钟后，用95％乙醇擦去多余的硅化剂；用几滴Sigma-cote均匀涂擦大块电泳玻璃，干燥5分钟。将大小两张电泳玻璃叠起，并在它们之间放入0.4mm间隙片，用宽胶带封闭形成凝胶糟，四周用大票夹夹紧；配制4％70ml变性聚丙烯酰胺凝胶将29.4g尿素和7.0ml 5XTBE，加热搅拌至尿素溶解，加入7.0ml 40％丙烯酰胺，再用双蒸水定溶至70.0ml，放入冰中冷却；加入新配制的700ul10％过硫酸铵和70ul TEMED快速混匀后灌胶后，立即将0.4mm塑料梳的平直边扦入胶中，深度约为7mm，放置至少4小时后，将塑料梳取出，去掉边沿的票夹和胶带，将凝装入电泳糟中，加入0.5×TBE电泳液，并用电泳液冲洗凝胶顶部3-4次，再扦入0.4mm上样梳；将样品置于PCR仪中，95℃5分钟变性处理，每一样品取8.0ul加入上样孔中，进行稳压电泳(40-50V/cm)，时间约1小时30分。
硝酸银染色为试剂准备固定1500ml(10％acetic acid):150ml冰醋酸，150ml甲醇，1200ml dH2O；染色液2000ml:2.0g硝酸银，3.0ml 37％福尔马林，1997ml d dH2O；冲洗液2000ml(夏天预冷至10℃):60.0g碳酸钠，3.0ml 37％福尔马林，400ul,10mg/ml硫代硫酸钠，1997ml dH2O；操作过程取下电泳凝胶板，平放于桌上(大玻璃在上，小玻璃在下)，抽去间隙片和上样梳，用单面刀片扦入右下角，小心用力撬起大玻璃，使之与凝胶分离，并取下大玻璃；将带有凝胶的小玻璃小心放入固定液中固定20分钟，放入dH2O洗涤二次，每次2分钟，转入染色液中，染色30分钟；用dH2O洗涤10秒钟，转入冲洗液中(10℃)，冲洗5-10分钟；转入固定剂中固定5-6分钟；最后，用dH2O洗涤2-5分钟。
结果观察为将染色后的凝胶玻璃板放在荧光灯下，观察经PCR扩增的DNA染色带谱；呈现阳性反应的样品为不育系种子，阴性反应的样品为其它混杂种子；呈现双阳性反应的样品为杂交种子，单阳性反应和阴性反应的样品为其它混杂种子。
本发明的种子纯度鉴定方法与现有的种子纯度鉴定方法相比，其优点和积极效果为1、时间短，速度快。采用本发明技术鉴定水稻不育系和水稻杂交种子纯度，比种子企业采用的田间种植鉴定方法，时间短，速度快，并且不误农时。水稻种子收获后，采用本发明即可在实验室15天内鉴定出种子纯度，无需抽样到海南岛进行纯度种植鉴定，不会影响生产销售。
2、准确度高，成本低。试验表明，采用本发明技术鉴定水稻不育系和杂交种子纯度，比荧光检测法的准确度高，可靠性达到99.9％。比常规DNA分析技术成本低2-3倍。
下面详细叙述
具体实施例方式
一、被检测种子要求不育系种子或杂交种子应具有正常的种子发芽率。
二、种子发芽处理将种子置于25℃条件下，浸种48小时；再转入培养皿中，32℃进行湿润催芽24小时，25℃培养3-4天。
三、DNA样品制备分别将每粒稻谷的幼芽和嫩片取下，剪成0.5厘米长小段，放入碾缸中，加入250ul DNA提取液(成份50mM Tris-HCl pH8.0,25mMEDTA,700mMNaCl,1％SDS)，碾磨成匀浆。再加入250ulDNA提取液混匀，转入1.5ml离心管，加入300ul氯仿/异戊醇(500∶21)，振荡5分钟，接着离心30秒(3000转/分)，将上清液小心转入另一个1.5ml离心管中，加入500ul 100％冰冻乙醇混合后，静置5分钟，再离心1分钟去掉上清液，加入400ul 70％乙醇冲洗2次(必要时可离心20秒)。然后，去掉乙醇、干燥，溶解于30ul TE缓冲液(成份0.01mM EDTA和10mM Tris-Cl,pH7.6)中，待用。
四、聚合酶链反应将2ul提取的DNA样品加入0.5ml离心管中，再加入8ul反应液(成份1xbuffer,1.5mM Mgl2,200uM dNTP,0.1uM Primer F,0.1uM Primer R和0.1unit Taq DNA Polymerase，对杂交种子的纯度，需要再加入一个相应的恢复系标记引物)。然后，加入半滴石蜡油，进行PCR循环反应，反应循环依次为94℃/2’30”循环1次；94℃/40”,53℃/1’,72℃/1’30”循环35次；72℃/8’；最后，将10ul 3×终止反应液(成份10mM NaOH,95％Formamide,0.05％Bromophenol blue,0.05％ Xylene Cyanol FF,10mM EDTA)加入0.5ml反应离心管充分混匀，放入-20℃贮藏、待用。
五、聚丙烯酰胺凝胶电泳将一幅(大、小各一张)电泳玻璃用蒸馏水擦净，再用95％乙醇擦净。用新鲜配置的硅化剂(1ul Binding Silane加入1.0ml 95％乙醇和5.0ul冰醋酸)均匀涂擦小块电泳玻璃。干燥5分钟后，用95％乙醇擦去多余的硅化剂。用几滴Sigma-cote均匀涂擦大块电泳玻璃，干燥5分钟。将大小两张电泳玻璃叠起，并在它们之间放入0.4mm间隙片(左右各一片)，用宽胶带封闭形成凝胶糟，四周用大票夹夹紧。配制4％70ml变性聚丙烯酰胺凝胶。将29.4g尿素和7.0ml 5×TBE(每升溶液中含54g Tris-base,27.5g Boric acid,20ml0.5M EDTA,pH8.0)加热搅拌混合，至尿素溶解，加入7.0ml 40％丙烯酰胺(成份2％ Bis-acrylamide,38％ Acrylamid)。再用双蒸水定溶至70.0ml，放入冰中冷却。加入新配制的700ul 10％过硫酸铵和70ul TEMED快速混匀后灌胶。灌胶后，立即将0.4mm塑料梳的平直边扦入胶中，深度约为7mm。放置至少4小时后，将塑料梳取出，去掉边沿的票夹和胶带，将凝装入电泳糟中，加入0.5×TBE电泳液，并用电泳液冲洗凝胶顶部3-4次，再扦入0.4mm上样梳。将样品置于PCR仪中，95℃ 5分钟变性处理，每一样品取8.0ul加入上样孔中，进行稳压电泳(40-50V/cm)，时间约1小时30分。
六、硝酸银染色试剂准备固定剂150ml(10％acetic acid)150ml冰醋酸150ml田3.0ml甲醛1200ml dH2O染色液2000ml2.0g硝酸银(剧毒)Silver Nitrate3.0ml 37％福尔马林Formaldehyde1997ml d dH2O(高纯双蒸水)冲洗液2000ml(夏天预冷至10℃)60.0g碳酸钠3.0ml 37％福尔马林400ul,10mg/ml硫代硫酸钠1997ml dH2O操作过程取下电泳凝胶板，平放于桌上(大玻璃在上，小玻璃在下)，抽去间隙片和上样梳，用单面刀片扦入右下角，小心用力撬起大玻璃，使之与凝胶分离，并取下大玻璃。将带有凝胶的小玻璃小心放入固定液中固定20分钟，放入dH2O洗涤二次，每次2分钟。转入染色液中，染色30分钟。用dH2O洗涤10秒钟，转入冲洗液中(10℃)，冲洗5-10分钟。转入固定剂中固定5-6分钟。最后，用dH2O洗涤2-5分钟。
七、结果观察和数据统计将染色后的凝胶玻璃板放在荧光灯下，观察经PCR扩增的DNA染色带谱。对不育系繁殖的纯度鉴定，呈现阳性反应的样品为不育系种子，阴性反应的样品为其它混杂种子。对杂交种子的纯度鉴定，呈现双阳性反应的样品为杂交种子，单阳性反应和阴性反应的样品为其它混杂种子。
权利要求
1.一种快速、准确鉴定杂交水稻不育系种子和杂交种子纯度的方法，其特征在于包括种子处理，DNA样品制备，聚合酶链反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，结果观察方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子处理为将水稻不育系或杂交种种子置于25℃条件下，浸种48小时；再转入培养皿中，32℃进行湿润催芽24小时，25℃培养3-4天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于DNA样品制备为分别将每粒稻谷的幼芽和嫩叶取下，剪成0.5厘米长小段，放入碾缸中，加入250ul DNA提取液，碾磨成匀浆；再加入250ul DNA提取液混匀，转入1.5ml离心管，加入300ul氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡5分钟后，以3000转/分转速离心30秒，将上清液转入另一个1.5ml离心管中，加入500ul 100％冰冻乙醇混合后，静置5分钟，再离心1分钟去掉上清液，加入400ul 70％乙醇冲洗2次或/和离心20秒后，去掉乙醇、干燥，溶解于30ul TE缓冲液中待用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于聚合酶链反应为将2ul提取的DNA样品加入0.5ml离心管中，再加入8ul反应液后，加入半滴石蜡油，进行PCR循环反应，反应循环依次为94℃/2’30”循环1次；94℃/40”,53℃/1’,72℃/1’30”循环35次；72℃/8’；最后，将5ul 3×终止反应液加入0.5ml反应离心管充分混匀，放入-20℃贮藏待用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于聚丙烯酰胺凝胶电泳为将大、小各一张的电泳玻璃用蒸馏水擦净，再用95％乙醇擦净，用新鲜配置的硅化剂均匀涂擦小块电泳玻璃，干燥5分钟后，用95％乙醇擦去多余的硅化剂；用儿滴Sigma-cote均匀涂擦大块电泳玻璃，干燥5分钟。将大小两张电泳玻璃叠起，并在它们之间放入0.4mm间隙片，用宽胶带封闭形成凝胶糟，四周用大票夹夹紧；配制4％70ml变性聚丙烯酰胺凝胶将29.4g尿素和7.0ml5XTBE，加热搅拌至尿素溶解，加入7.0ml 40％丙烯酰胺，再用双蒸水定溶至70.0ml，放入冰中冷却；加入新配制的700ul 10％过硫酸铵和70ul TEMED快速混匀后灌胶后，立即将0.4mm塑料梳的平直边扦入胶中，深度约为7mm，放置至少4小时后，将塑料梳取出，去掉边沿的票夹和胶带，将凝装入电泳糟中，加入0.5×TBE电泳液，并用电泳液冲洗凝胶顶部3-4次，再扦入0.4mm上样梳；将样品置于PCR仪中，95℃5分钟变性处理，每一样品取8.0ul加入上样孔中，进行稳压电泳(40-50V/cm)，时间约1小时30分。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于硝酸银染色为试剂准备固定1500ml(10％acetic acid):150ml冰醋酸，150ml甲醇，1200ml dH2O；染色液2000ml:2.0g硝酸银，3.0ml 37％福尔马林，1997ml d dH2O；冲洗液2000ml(夏天预冷至10℃):60.0g碳酸钠，3.0ml 37％福尔马林，400ul,10mg/ml硫代硫酸钠，1997ml dH2O；操作过程取下电泳凝胶板，平放于桌上(大玻璃在上，小玻璃在下)，抽去间隙片和上样梳，用单面刀片扦入右下角，小心用力撬起大玻璃，使之与凝胶分离，并取下大玻璃；将带有凝胶的小玻璃小心放入固定液中固定20分钟，放入dH2O洗涤二次，每次2分钟，转入染色液中，染色30分钟；用dH2O洗涤10秒钟，转入冲洗液中(10℃)，冲洗5-10分钟；转入固定剂中固定5-6分钟；最后，用dH2O洗涤2-5分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于结果观察为将染色后的凝胶玻璃板放在荧光灯下，观察经PCR扩增的DNA染色带谱；呈现阳性反应的样品为不育系种子，阴性反应的样品为其它混杂种子；呈现双阳性反应的样品为杂交种子，单阳性反应和阴性反应的样品为其它混杂种子。
全文摘要
一种快速、准确鉴定杂交水稻不育系种子和杂交种子纯度的方法。包括种子处理,DNA样品制备,聚合酶链反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色和结果观察方法。本发明的种子纯度鉴定方法与现有的种子纯度鉴定方法相比具有时间短,速度快,准确度高,成本低等优点。
文档编号C12Q1/68GK1226375SQ99103138
公开日1999年8月25日 申请日期1999年3月23日 优先权日1999年3月23日
发明者刘小川 申请人:中国水稻研究所