酶法生产乳果低聚糖的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶法生产乳果低聚糖，包括以下步骤：将氯酚节杆菌 SK33.001 接入种子培养基中，于30℃下培养 12h ；种子液接种量为1%，发酵培养基中发酵 0.8-2h 生产果聚糖蔗糖酶 ；向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及50mg/L Zn2+催化转化得到含有低聚乳果糖的酶反应液；脱色；浓缩，即得低聚乳果糖糖浆。本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、作用条件温和、易掌握，产物纯度高，生产周期短，大大提高了酶法生产乳果低聚糖的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
【专利说明】酶法生产乳果低聚糖
[0001](一)
【技术领域】
本发明涉及乳果糖，具体涉及酶法生产乳果低聚糖。
[0002](二)
【背景技术】
乳果低聚糖是功能性低聚糖中的一种，低甜度，低热量，难以被人体消化，具有促进双歧杆菌增殖，抑制致病菌产生、抗龋齿、调整肠道功能、降血脂、降胆固醇、促进矿物质吸收等生理功能。随着人们生活水平的提高，功能保健食品对人们健康所起的作用越来越受到重视，功能性低聚糖因具有独特的生理功能而成为重要的功能性食品基料，已引起全世界广泛的关注。我国自1996年开始低聚糖的生成，2000年总产量越3万吨，他们替代了或部分替代蔗糖而广泛应用于乳制品、饮料、糖果等各类食品中。
[0003]酶法合成是工业化生产低聚乳果糖的主要途径。酶法合成主要有两种方法:一是利用半乳糖苷转移酶将乳糖分解产生的β_半乳糖基转移至蔗糖中葡萄糖的C4羟基上，如β-半乳糖苷酶；二是利用果糖基转移酶将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖还原性末端的Cl轻基上,适合的酶类有果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase )和β -呋喃果糖苷酶(β-fructofuransidase)。酶法合成低聚乳果糖的产率低、反应时间长一直是制约酶法合成低聚乳果糖发展的中药难题。
[0004]2014年10月01，公布的一株产果聚糖蔗糖酶的菌株和用该酶生产低
聚乳果糖的方法中，公开了一种氯酹节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013387。
[0005]用所述的微生物氯酚节杆菌SK33.001发酵生产果聚糖蔗糖酶的方法，步骤为:
(1)种子培养
种子培养基:牛肉膏I?10g/L，蛋白胨I?5g/L，NaCl I?5g/L，ρΗ7.0，去离子水配制；
种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于25?30°C、160?240rpm的振荡条件下培养12?24h ；
(2)发酵培养
发酵培养基:蔗糖5?50g/L，乳糖5~50g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏I?20g/L,蛋白胨I?10g/L,磷酸氢二钾I?5g/L,硫酸镁0.1?lg/L, pH 6.5?
7.5,去离子水配制；
发酵条件:种子液接种量为0.01%-1%，在25?30°C、搅拌速度为200?500rpm、空气流量为5?30m3/(L*h)的条件下在发酵培养基中发酵12?84h生产果聚糖蔗糖酶；
(3)发酵后处理通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液，将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉。其能够将蔗糖、乳糖转化为低聚乳果糖，且低聚乳果糖转化率高达35%以上，但是其转化率仍需要提高。
[0006](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种酶法生产乳果低聚糖，操作方便，过程易于控制，反应时间短，产物纯度高，有利于工业化生产。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种酶法生产乳果低聚糖，其特殊之处在于:包括以下步骤:
(1)种子培养
种子培养基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去离子水配制；
种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30°C、160?240rpm,的振荡条件下培养12h ；
(2)发酵培养
发酵培养基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏15-17g/L，蛋白胨 2-4g/L，磷酸氢二钾 5g/L，硫酸镁 0.5-lg/L，氯化钙 0.lg/L，Zn2+80mg/L , FeCl30.4g/L ,pH 6.5?7.5,去离子水配制；
发酵条件:种子液接种量为1%，在30°C、搅拌速度为450-500rpm、空气流量为20m3/(L.h)的条件下在发酵培养基中发酵0.8-2h生产果聚糖蔗糖酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用4倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶转化生产低聚乳果糖的酶反应液
向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化转化，转化反应条件为:底物总糖质量浓度范围为54%，酶对底物的用量为200U/g，pH 4.5?8.0，转化反应温度为50°C，转化反应时间0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液；
(5)脱色
在低聚乳果糖的酶反应液中加入重量比12%，孔径小于30nm的活性炭，在90°C下充分搅拌，震荡吸附10-20min，然后离心、过滤得到脱色、澄清的脱色液；
(6)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为96%，即得低聚乳果糖糖浆。
[0008]本发明的有益效果:本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、作用条件温和、易掌握，产物纯度高，生产周期短，大大提高了酶法生产乳果低聚糖的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
[0009](四)【具体实施方式】实施例1
(1)种子培养
种子培养基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去离子水配制；
种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30°C、160?240rpm,的振荡条件下培养12h ；
(2)发酵培养
发酵培养基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏15g/L，蛋白胨 2g/L，磷酸氢二钾 5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙 0.lg/L，Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L，pH 6.5?7.5,去离子水配制；
发酵条件:种子液接种量为1%，在30°C、搅拌速度为450-500rpm、空气流量为20m3/(L.h)的条件下在发酵培养基中发酵Ih生产果聚糖蔗糖酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用4倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶转化生产低聚乳果糖的酶反应液
向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化转化，转化反应条件为:底物总糖质量浓度范围为54%，酶对底物的用量为200U/g，pH 4.5?8.0，转化反应温度为50°C，转化反应时间0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液；
(5)脱色
在低聚乳果糖的酶反应液中加入重量比12%，孔径小于30nm的活性炭，在90°C下充分搅拌，震荡吸附10-20min，然后离心、过滤得到脱色、澄清的脱色液；
(6)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为96%，即得低聚乳果糖糖浆。
[0010]实施例2
(1)种子培养
种子培养基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去离子水配制；
种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30°C、160?240rpm,的振荡条件下培养12h ；
(2)发酵培养
发酵培养基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏17g/L，蛋白胨 4g/L，磷酸氢二钾 5g/L，硫酸镁 0.5-lg/L，氯化钙 0.lg/L，Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L,pH 6.5?7.5,去离子水配制；
发酵条件:种子液接种量为1%，在30°C、搅拌速度为450-500rpm、空气流量为20m3/(L-h)的条件下在发酵培养基中发酵2h生产果聚糖蔗糖酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用4倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶转化生产低聚乳果糖的酶反应液
向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化转化，转化反应条件为:底物总糖质量浓度范围为54%，酶对底物的用量为200U/g，pH 4.5?8.0，转化反应温度为50°C，转化反应时间0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液；
(5)脱色
在低聚乳果糖的酶反应液中加入重量比12%，孔径小于30nm的活性炭，在90°C下充分搅拌，震荡吸附10-20min，然后离心、过滤得到脱色、澄清的脱色液； (6)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为96%，即得低聚乳果糖糖浆。
[0011]实施例3
(1)种子培养
种子培养基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去离子水配制；
种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30°C、160?240rpm,的振荡条件下培养12h ；
(2)发酵培养
发酵培养基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏16g/L，蛋白胨 3g/L，磷酸氢二钾 5g/L，硫酸镁 0.5-lg/L，氯化钙 0.lg/L, Zn2+80mg/L ,FeCl3 0.4g/L,pH 6.5?7.5,去离子水配制；
发酵条件:种子液接种量为1%，在30°C、搅拌速度为450-500rpm、空气流量为20m3/(L.h)的条件下在发酵培养基中发酵0.Sh生产果聚糖蔗糖酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用4倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉；
(4)果聚糖蔗糖酶转化生产低聚乳果糖的酶反应液
向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化转化，转化反应条件为:底物总糖质量浓度范围为54%，酶对底物的用量为200U/g，pH 4.5?
8.0，转化反应温度为50°C，转化反应时间0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液；
(5)脱色
在低聚乳果糖的酶反应液中加入重量比12%，孔径小于30nm的活性炭，在90°C下充分搅拌，震荡吸附10-20min，然后离心、过滤得到脱色、澄清的脱色液；
(6)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为96%，即得低聚乳果糖糖浆。
【权利要求】
1.一种酶法生产乳果低聚糖，其特征在于:包括以下步骤: (1)种子培养 种子培养基:牛肉膏7g/L，蛋白胨4g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，去离子水配制； 种子培养条件:将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30°C、160?240rpm,的振荡条件下培养12h ； (2)发酵培养 发酵培养基:蔗糖27g/L，乳糖27g/L，控制蔗糖:乳糖质量比1: 1，酵母膏15-17g/L，蛋白胨 2-4g/L，磷酸氢二钾 5g/L，硫酸镁 0.5-lg/L，氯化钙 0.lg/L，Zn2+80mg/L , FeCl30.4g/L ,pH 6.5?7.5,去离子水配制； 发酵条件:种子液接种量为1%，在30°C、搅拌速度为450-500rpm、空气流量为20m3/(L.h)的条件下在发酵培养基中发酵0.8-2h生产果聚糖蔗糖酶； (3)发酵后处理 通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用4倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉； (4)果聚糖蔗糖酶转化生产低聚乳果糖的酶反应液 向质量浓度分别为27%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及，50mg/L Zn2+催化转化，转化反应条件为:底物总糖质量浓度范围为54%，酶对底物的用量为200U/g，pH 4.5?8.0，转化反应温度为50°C，转化反应时间0.4-0.6h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液； (5)脱色 在低聚乳果糖的酶反应液中加入重量比12%，孔径小于30nm的活性炭，在90°C下充分搅拌，震荡吸附10-20min，然后离心、过滤得到脱色、澄清的脱色液； (6)浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为96%，即得低聚乳果糖糖浆。
【文档编号】C12R1/06GK104480164SQ201410726466
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】窦宝德, 窦光朋, 张继红 申请人:山东百龙创园生物科技有限公司