一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法
【专利摘要】本发明属于生物化学领域，尤其涉及一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法，包括：利用过氧化物酶-氧化酶反应体系氧化芝麻菜苷制备4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；利用黑芥子酶水解4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷制备莱菔硫烷。本发明克服了现有制备方法原料成本高，莱菔硫烷产率低，工艺复杂，难以实现大规模生产的缺点，采用廉价易得的芝麻菜种子、花、茎或叶为原料，原料成本为使用西兰花为原料时的1/6，最终得到莱菔硫烷的产量为使用西兰花为原料时的4倍，产品纯度高，成本低廉，工艺简单，产率高，非常适合于大规模工业化生产。
【专利说明】一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，尤其涉及一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，随着人们生活水平的提高，癌症的发病率显著提高，严重影响了人类生命健 康。大量食用蔬菜水果，能够显著抑制或减慢癌症的发生。蔬菜水果中含有大量的活性成 分，如番茄中的番茄红素，大豆中的大豆异黄酮，水果中的鞣花酸及十字花科蔬菜中的异硫 氰酸酯，吲哚类物质，均被证实具有突出的防癌抗癌作用。
[0003] 莱菔硫烧（sulforaphane, 4-甲基-亚硫酰基丁基异硫氰酸酯）是目前公认的防 癌和抗癌效果最好的天然产物之一，是自然界存在的诱导II型解毒酶能力最强的诱导物。 天然莱菔硫烷为R型，不具有任何细胞毒性，能够抑制肺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌 及大肠癌等癌细胞的形成，提高组织谷胱甘肽的水平，诱导细胞合成II型解毒酶。
[0004] 目前莱菔硫烷的制备方法主要有化学合成和天然产物提取。化学法采用立体手 性合成的方法，实验复杂，反应步骤多，副产物多，毒性大，产率低，原料成本高，分离难等缺 点，难以实现大规模生产。
[0005] 天然产物提取方法首先提取西兰花种子等十字花科植物中的4-甲基-R-亚硫酰 基丁基硫代葡萄糖苷（R-glucoraphanin)，然后利用黑芥子酶水解4-甲基-R-亚硫酰基丁 基硫代葡萄糖苷（R -glucoraphanin)得到R-莱菔硫烧（R-sulforaphane，4-甲基-R-亚硫 酰基丁基异硫氰酸酯），但由于西兰花种子成本高，且4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖 苷含量低，得到的莱菔硫烷产品少，只能实验室规模生产。申请号为200910037363. 1的中 国发明专利申请公开了一种从西兰花芽苗菜中提取多功能莱菔硫烷的方法，该方法需考虑 芽苗菜的生长时间，对芽苗菜进行预处理，工艺复杂，产率低，成本较高。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法，以解决上述问 题。本发明的实施例提供了一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)制备4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷：
[0008] 将每克芝麻菜苷溶解于50ml的磷酸盐缓冲液中，pH值为5-7,加入过氧化物酶和 氧化酶，其中，过氧化物酶与芝麻菜苷的摩尔比为I :2000-10000,氧化酶与过氧化物酶的 摩尔比为1 密封通入氧气，控制温度19-35°C，搅拌，15分钟后，加入氧化酶的相应 底物，底物与芝麻菜苷的摩尔比为10-100: 1，再次通入氧气，密封，搅拌反应2-5小时，得到 4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；
[0009] 2)用黑芥子酶水解步骤1)中得到的4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷制备 莱菔硫烷。
[0010] 进一步，步骤1)中pH值为7,过氧化物酶与芝麻菜苷的摩尔比为1 :10000,氧化酶 与过氧化物酶的摩尔比为1 :4,底物与芝麻菜苷的摩尔比为60:1，控制温度为28°C，反应时 间为4小时。
[0011] 进一步，步骤1)中的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶、氯过氧化物酶、木质素过 氧化物酶、乳过氧化物酶中的一种。
[0012] 进一步，步骤1)中的氧化酶包括葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、超氧化物歧化酶 尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶或L- α -羟基酸氧化酶中的一种。
[0013] 与现有技术相比本发明的有益效果是：克服了现有制备方法原料成本高，莱菔硫 烷产率低，工艺复杂，难以实现大规模生产的缺点，采用廉价易得的芝麻菜种子、花、茎或叶 为原料，原料成本为使用西兰花为原料时的1/6,最终得到莱菔硫烷的产量为使用西兰花为 原料时的4倍，产品纯度可达98 %，对映选择性可达99 %，成本低廉，工艺简单，产率高，非 常适合于大规模工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是本发明一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法的流程图；
[0015] 图2是本发明实施例1利用分析型高效液相色谱测定莱菔硫烷纯度的分析图；
[0016] 图3是本发明实施例1利用质谱对产品进行鉴定的鉴定图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并 不用于限定发明。
[0018] 参图1至图3所示，图1是本发明一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法的流程 图；图2是本发明实施例1利用分析型高效液相色谱测定莱菔硫烷纯度的分析图；图3是本 发明实施例1利用质谱对产品进行鉴定的鉴定图。
[0019] 本发明的实施方式提供了一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法，包括如下步 骤：
[0020] 步骤S101，利用过氧化物酶-氧化酶反应体系氧化芝麻菜苷制备4-甲基-R-亚硫 酰基丁基硫代葡萄糖苷：
[0021] 将每克芝麻菜苷溶解于50ml的磷酸盐缓冲液中，pH值为5-7(可以为5.5、 6或6. 5)，加入过氧化物酶和氧化酶，其中，过氧化物酶与芝麻菜苷的摩尔比为1 : 2000-10000(可以为 I :2000、1 :3000、1 :4000、1:5000、1 :6000、1 :7000、1 :8000 或 1 : 9000)，氧化酶与过氧化物酶的摩尔比为I :1-10(可以为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或 1:9)，密封通入氧气（lmL/min)，控制温度 19-35°C (可以为 20°C、22°C、24°C、26°C、28°C、 30°C、32°C或34°C )，搅拌，15分钟后，加入氧化酶的相应底物，底物与芝麻菜苷的摩尔比 为 10-100:1(可以为 20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1 或 90:1)，再次通入氧气，密 封，搅拌反应2-5小时（可以为2. 5小时、3小时、3. 5小时、4小时或4. 5小时），得到4-甲 基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。
[0022] 步骤SlOl中采用过氧化物酶（如辣根过氧化物酶、氯过氧化物酶、木质素过氧化 物酶、乳过氧化物酶）催化芝麻菜苷氧化为4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。过 氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，过氧化物酶催化氧化反应需要以过 氧化氢为氧化剂，但是过氧化物酶对过氧化氢浓度极其敏感，高浓度的过氧化氢会将其氧 化成没有催化活性的中间态。氧化酶属氧化还原酶类，能够在有分子氧的条件下将相应底 物氧化，并生成过氧化氢，步骤SlOl中采用多种氧化酶（如葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、 超氧化物歧化酶尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶或L- α -羟基酸氧化酶） 与其相应的底物反应，在反应体系中均匀、稳定、缓慢地原位生成过氧化氢（通过该氧化物 酶-氧化酶反应体系，过氧化氢的浓度不会造成局部浓度过高，且更易于控制，过氧化氢的 分散性更好），进而氧化芝麻菜苷生成4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷。
[0023] 步骤S102,用黑芥子酶水解步骤SlOl中得到的4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡 萄糖苷制备莱菔硫烷。具体制备过程如下：
[0024] 用黑芥子酶（可采用市售黑芥子酶，起始每克芝麻菜苷加入5mg黑芥子酶）水 解步骤1)中得到的4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，水解时间为60分钟，pH值 采用PH值缓冲液调至6-7 (pH值缓冲液可选用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，醋酸缓冲液， Na2HP04-NaH2P04缓冲液，K2HP04-KH2P04缓冲液中的一种），温度30°C，水解后离心上清液 用SP850树脂柱纯化（SP850大孔吸附树脂柱），柱体积为上样液体积的1/5,用3倍柱体积 的去离子水和3倍柱体积体积分数5%的乙醇溶液洗杂质，用5倍柱体积的体积分数85% 乙醇洗产品，旋蒸去除溶剂后，用二氯甲烷萃取3次，旋干后进行冷冻干燥处理，得到高纯 度的R-莱菔硫烷。
[0025] 4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷经黑芥子酶水解生成R-莱菔硫烷的具体 反应原理如下：
[0026]
【权利要求】
1. 一种利用芝麻菜苷制备莱菔硫烷的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 制备4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷： 将每克芝麻菜苷溶解于50ml的磷酸盐缓冲液中，pH值为5-7,加入过氧化物酶和氧化 酶，其中，所述过氧化物酶与所述芝麻菜苷的摩尔比为1 =2000-10000,所述氧化酶与所述 过氧化物酶的摩尔比为1:1-10,密封通入氧气，控制温度19_35°C，搅拌，15分钟后，加入 所述氧化酶的相应底物，所述底物与所述芝麻菜苷的摩尔比为10-100:1，再次通入氧气，密 封，搅拌反应2-5小时，得到4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷； 2) 用黑芥子酶水解步骤1)中得到的4-甲基-R-亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷制备莱菔 硫烧。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述pH值为7,所述过氧化酶 与所述芝麻菜苷的摩尔比为1 :1〇〇〇〇,所述氧化酶与所述过氧化物酶的摩尔比为1 :4,所述 底物与所述芝麻菜苷的摩尔比为60:1，控制温度为28°C，反应时间为4小时。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的过氧化物酶包括辣 根过氧化物酶、氯过氧化物酶、木质素过氧化物酶、乳过氧化物酶中的一种。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的氧化酶包括葡萄糖 氧化酶、胆固醇氧化酶、超氧化物歧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶 或L-a -羟基酸氧化酶中的一种。
【文档编号】C12P11/00GK104388487SQ201410740534
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】梁浩, 周筱, 袁其朋, 程立, 田飞豹 申请人:北京化工大学