玉米纹枯病抗病基因grmzm2g456997及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米纹枯病抗病相关基因GRMZM2G456997，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。同时还公开了该基因的编码区基因如SEQ ID NO.2所示，以及该序列翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。将GRMZM2G456997基因的超量表达载体转入玉米植株后，GRMZM2G456997基因表达量显著提高的遗传转化玉米对纹枯病菌的抗性明显增强，证明GRMZM2G456997基因在玉米抗纹枯病中发挥重要作用。
【专利说明】玉米纹枯病抗病基因 GRMZM2G456997及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程【技术领域】，具体涉及玉米纹枯病抗病相关基因 其在作物改良提高对纹枯病抗性中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长的过程，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、 细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：（1)病原体成功的在寄主植物内繁 殖，引起相关病症；（2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因 资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两 类：（1)抗病基因，又称R (resistance)基因和（2)抗病相关基因。
[0004] 根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或 间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径（Tang等，1996，Science 274: 2060-2063 ;Baker 等，1997, Science 276: 726-733 ;Jia 等，2000, EMBO J. 19: 4004-4014 ;Dangl 和 Jones，2001，Nature 411: 826-833 ;Nimchuk 等，2001，Curr. Opin. Plant Biol. 4: 288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述 原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵 抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基 因也只有大约40个；（2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限； (3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
[0005] 抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与 合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病 原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异 大规模地鉴定植物抗病相关基因（Maleck等，2000，Nature Genet. 26 :403-410 ;Schenk 等，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science in China 45: 449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗 病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力 开发的基因资源：（1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用， 这类基因是具有持久抗性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原 特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；（3)这类基因的资源丰富。
[0006] 植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研宄者们对这两大类抗病反应给 予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性（Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New York)、质量抗性和数量抗性（Ou 等，1975，Phytopathology 65: 1315-1316)、完全抗性和部分抗性（Parlevliet，1979，Annu. Rev. Phytopathol. I: 203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性）是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或 水平抗性或部分抗性）是由数量性状位点（quantitative trait locus，QTL)调控的抗病 反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久（Roumen，1994, Rice Blast Disease，Zeigler 等编著，CAB International，Cambridge，UK，pp. 245-265)。目前，人们对植物抗病 QTL 的基因本质还不清楚。因此，虽然已经鉴定出了大量抗病QTL，如水稻抗白叶枯病QTL (Li 等，1999, Mol. Gen. Genet. 261:58-63)、抗稻瘟病 QTL (Wang 等，1994, Genetics 136: 1421-1434 ;Chen 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2544-2549)、抗纹枯病 QTL (Li 等，1995,Theor. Appl. Genet. 91: 382-388)和抗病毒病 QTUAlbar 等，1998,Theor. Appl. Genet. 97: 1145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于植物抗病性的改良。
[0007] 近年研宄发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应，提示这些抗病 相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应这一现象 在多种植物中都被观察到，包括水稻（Xiong等，2002,中国科学45: 518-526 ;Ramalingam 等，2003, Mol. Plant-Microbe Interact. 16: 14-24 ;Wen 等，2003, Mol. Gen. Genomics 269: 331-339 ;Chu 等，2004, Mol. Gen. Genomics 271: 111-120)、小麦（Faris 等， 1999，Theor. Appl. Genet. 98 :219_225)、豆类（Geffroy 等，2000，Mol. Plant-Microbe Interact. 13: 287-296)和马铃薯（Trognitz 等，2002，Mol. Plant-Microbe Interact. 15: 587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依 据。
[0008] 玉米和水稻是世界上重要的粮食作物，但纹枯病常常造成其产量和品质的下降， 并且玉米和水稻纹枯病菌可以互相侵染。因此，了解纹枯病的发病机制，有助于利用高效途 径改良玉米和水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。分离 克隆抗病相关基因是对玉米和水稻抗病机理研宄的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗 病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行玉 米和水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规 植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用玉米抗病基因的克隆获得抗病植株成为 亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0009] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况要解决的技术问题，提供了一个从玉米 中分离克隆出的抗病相关基因整编码区段的DNA片段。其基因的序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示，编码序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，编码氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO. 3 所示。
[0010] 该基因仰片段来源于玉米B73,其通过特殊设计的引物扩增玉米B73 cDNA获得，其中所述的引物包括引物1，5< -ATGGAGTACTCGTCTACTAGGG-3'其序列如序列 表SEQ ID NO. 4所示，引物2,5< -CTAGTAGGGTCTCTGTCCGCHV 其序列如序列表SEQ ID NO. 5 所示，之后利用强启动子驱动原理的转基因技术，将因的超量表达载体 转入水稻品种中花11。因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的 抗性明显增强，证明你堪因在水稻抗纹枯病中发挥重要作用。
[0011] 之所以采用上述的方法，主要是由于将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有 助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗性基因，而不会 产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。而抗病相关基因的克隆是克服传统育种 不能植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
[0012] 通过实现本发明的内容，可以达到以下效果： (1) 发明人在国际上首次提供了玉米纹枯病抗病相关基因 GRMZM2G456997,并且成功验 证了其功能； (2) 利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病 害产生抗病反应，获得高抗病植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1是接种纹枯病菌YWK62和YWK196后GRMZM2G456997基因的表达检测； 图2是6----?g量表达Tl代遗传转化植株接种纹枯病菌YWK1967天后结果 示意图； 图3为图2中结果的柱状图。
【具体实施方式】
[0014] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015] 实施例1 因接种纹枯病菌后的表达模式： 为了检测因受纹枯病菌诱导表达模式，利用qRT-PCR检测了这个基 因接种病原菌后的表达，所用引物为引物3,5< -TGATTAGGTTTCTTGTGAACCTACTCA-3'其序 列如序列表SEQ ID NO. 6所示，引物4,5< -CACCCCACACAGAACATACACAT-3'其序列如序列 表SEQ ID NO. 7所示。如图1所示，图1是接种纹枯病菌YWK62和YWK196后仰怒麗如必你没7 基因的表达检测；结果表明，接种纹枯病菌后你9冷皮诱导表达，在接种8h后表 达达到峰值随后逐渐降低；说明，你9堪因能够受YWK196和YWK62的诱导，说明 堪因参与了玉米对纹枯病的抗性反应。
[0016] 实施例2 分离克隆GRMZM2G456997基因： 发明人根据数据库GRMZM2G456997基因序列设计引物（引物1， 5 ' -ATGGAGTACTCGTCTACTAGGG-3 '其序列如序列表 SEQ ID NO. 4 所示，引物 2， 5 ' -CTAGTAGGGTCTCTGTCCGC-3 '其序列如序列表SEQ ID NO. 5所示）用来获得 GRMZM2G456997基因。提取玉米B73 RNA并通过反转录获得cDNA，以cDNA作为模板，进行 PCR扩增； 反应程序如下：预变性94°C 5 min，变性94°C 40 s，退火54°C 40 s，延伸72°C 1.5 min，反应35个循环，后延伸72°C 7 min; 结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连 接至载体pGEM-T中（Promega公司），转化E. coli DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒， 测序由华大基因完成，获得长度为504bp的GRMZM2G456997片段，具有序列表SEQ ID NO. 2 的DNA序列。
[0017] 实施例3 GRMZM2G456997基因的功能验证： 将上述纯化的cDNA片段通过TA克隆连入超量表达载体pCXUN，热激转化E. coli DH5 α感受态细胞后对重组子进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的 片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比 对，连入的片段为全长cDNA并且没有碱基突变和缺失，证明GRMZM2G456997超量表达载体 pCXUN: :GRMZM2G456997 构建成功。
[0018] 采用农杆菌介导的遗传转化方法（Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，2005， Plant Cell R印.23 :540-547)将超量表达载体导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株被命名 为pCXUN : :GRMZM2G456997。本发明共获得独立转化植株14株，其中阳性植株为8株。 分别对Tl代3个转基因株系pCXUN: :GRMZM2G456997-2、4、8的10个单株进行玉米纹枯 病菌的接种鉴定。结果表明，接种纹枯病菌YWK196 7天后，超量表达GRMZM2G456997的 转基因植株与野生型相比平均病斑缩短了 I. 32cm、l. 21cm和2. 36cm (表1，图2)，说明 GRMZM2G456997参与了水稻对纹枯病的抗性反应。图2中，超量表达Tl代遗传转化植株 (pCXUN : :GRMZM2G456997-2、4和8)接种纹枯病菌YWK196 7天后形成的病斑明显比水稻 品种中花11 (对照）的短；中花11为遗传转化受体材料。
[0019] 表I GRMZM2G456997超量表达植株接种YWK196 7天后的病斑长度
【权利要求】
1. 一种玉米纹枯病抗病相关基因仰其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种蛋白质，是由序列表中SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3. -种编码权利要求2所述蛋白质的基因，基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一种重组表达载体，其特征在于，该载体包含有权利要求3中的基因。
5. 权利要求3所述的蛋白质或者权利要求4所述基因在培育抗纹枯病玉米中的应用。
6. 权利要求1所述的因或权利要求3所述的编码区的基因在增加玉 米对纹枯病抗性中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK104498507SQ201410819547
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】储昭辉, 丁新华 申请人:安徽拜森生物科技有限公司