专利名称：微生物发酵正烷烃生产长链α，W-二羧酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵正烷烃生产长链α，W-二羧酸，尤其是发酵正十五烷，高产十五碳二羧酸的方法。
长链二羧酸是合成香料，尼成工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂等的重要原料。十二个碳以上的长链二羧酸，自然界中不存在，化工上也还没有经济可行的合成方法，因此利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下，转化石油中的正烷烃，生产长链二羧酸早已引起科学家们的重视和深入研究。
十五碳二羧酸是合成名贵香料环十五酮和麝香酮(即3-甲基-环十五酮)的重要原料，后者是天然麝香的主要成分之一。以人工合成的麝香酮代替稀罕难得的天然麝香，配制多种中成药，临床应用试验表明，疗效与天然麝香一样显著。
正十五烷也是微生物容易同化的一种烷烃，因此形成和积累十五碳二羧酸，特别是高产十五碳二羧酸比较困难。
在专利文献中，虽有有关利用微生物从正烷烃发酵生产长链二羧酸的方法，但还没有有关从正十五烷发酵生产十五碳二羧酸，特别是高产十五碳二羧酸的方法。在US4339536中，只有生产十二碳和十三碳二羧酸的实施例，而且产酸水平不高，只达到45g/L;而在US4624920中，只有在50ml和500ml摇瓶生产十四碳和十六碳二羧酸的实施例，且产酸水平太低，每升发酵液只有3mg;申请号为87105445和89102548的中国专利申请，主要是有关生产十六碳和十七碳二羧酸的方法，在16L罐上，产酸量分别为120g/L和133g/L。
日本植树南海男等人报道过用一株热带假丝酵母突变株M2030从正十五烷生产十五碳二羧酸，在3升罐上，产酸达到90g/L左右;上海沈永强等人报道过用一株热带假丝酵母N-15的高浓度静止细胞(菌浓为15×108个/毫升)转化正十五烷为十五碳二羧酸时达到109g/L，(《植物生理学报》1980.Vol.6，No1)。但实验室发酵试验时，发酵8天，DC15的产量只达到77.2g/L。其他有关发酵生产十五碳二羧酸的报道都只有40-50g/L。因此用微生物发酵高产出地生产DC15是一个仍需解决的问题，本发明的目的是提供一种生产C11-C17单一长链二羧酸和混合长链二羧酸的方法，特别是高产出地生产DC15的方法。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)88-93，1980)为出发菌株，通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C11-C17的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十五烷，高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母NP-6-126(以下简称NP-6-126)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0206。
NP-6-126的生理特性如下一、糖类的发酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。
二、同化，葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糖醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三、生长素的需要生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸十，肌醇十，对氨基苯甲酸十。
四、其它硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛级-，油脂酶-。
形态特征奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长;在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝;而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭园细胞。
本发明的种子培养基(1)、10个巴林糖度的麦芽汗加2%琼脂制成的固体斜面;(2)、10个巴林的麦芽汁液体培养基;(3)烷烃种子培养基包含KH2PO46-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蜡或正十五烷40-70ml/L，自来水配制，自然pH。
培养种子的过程为取一接种环NP-6-126酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7ml培养基，放成斜面)，于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有500ml培养基的5000ml三角瓶中，于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。
用本发明的NP-6-126菌株生产长链二羧酸，特别是十五碳二羧酸的具体方法是把发酵种子接入pH5.5-9.0，最好为6.5-7.5的含有15-45%(V/V)的C11-C19的正烷烃和85-55%(v/v)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为碱金属磷酸盐6-14g/L，最好为7-10g/L，氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好为3-5g/L，玉米浆0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L，最好为1.0-2.0g/L，硝酸盐5-15g/L，最好为6-12g/L，二甲基亚砜10-20ml，消泡剂400-1200ppm以及一些其他公知的营养源，在pH6.5-7.5下将上述混合物在25-35℃，最好在27-31℃通气发酵48-170小时，每隔6-8小时用NaOH溶液调一次pH值，pH值控制在7.5-8.5之间。然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时，混合液中正烷烃含量为10-20%(v/v)，以后在适当时间补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%(v/v)为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4、NaH2PO4，K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。
发酵结束后，加入适量的水，加碱至pH10-12，加热至85-90℃，进行破乳分层，上层为残油，回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤或离心，合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至60-70℃，加HCl或H2SO4至pH4-5进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，用空气吹干，60℃烘干，得白色十五碳二羧酸结晶。
用本发明的NP-6-126菌株和发酵方法，可生产C11-C19的各种单一和混合二羧酸。其中在2.5吨罐上，从正十五烷发酵生产十五碳二羧酸，发酵6天，产酸量高达170-180g/L，后处理总收率达到80%，纯度达到96%左右。
实例一(1)、取一接种环NP-6-126菌种，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。
(2)、取上述菌种一支，接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中于30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时。烷烃种子培养基中KH2PO48g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖5g/l，尿素3g/l，重蜡50ml/l，自来水配制，pH5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述种子液，在200转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次pH至7.5-8.0。发酵培养基含KH2PO48g/l，酵母膏2g/l，玉米浆1g/l，氯化钠1.5g/l，尿素1g/l，正十五烷200ml/l，泡敌500ppm，KNO36g/l，自来水配制，pH7.5，在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后，用HCl调pH至3，用100ml乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二羧酸含量。结果DC11产量为53.6g/l，经气相色谱分析，DC11纯度为98.11%。
实例2按照实例1的方法，只是正烷烃用nC15，结果DC15的产量为73.5g/l，纯度为96.31%。
实例3按照实例1的方法，只是正烷烃用nC17，结果DC17的产量为53.9g/l，纯度为98.2%。
实例4种子培养基和培养方法同实例1，发酵培养基为KH2PO48g/l，NaCl lg/L，酵母膏2g/l，玉米浆1g/L，KNO39g/l，二甲基亚砜6ml/l，泡敌600ppm，尿素1.2g/L，正十五烷200ml/l，自来水配制，pH7.5。把1.5L培养两天，镜检无杂菌的NP-6-126菌株种液接入装有8L发酵培养基，经121℃灭菌30分钟的16L自动控制罐中，在29℃，800转/分，罐压1Kg/cm2，通气量1∶1，24小时后pH控制在7.5，发酵165小时，DC15的产量达到130.1g/L。
实例5种子培养基和培养方法同实例一，发酵培养基同实例二。把培养两天，经镜检无杂菌的400L，NP-6-126种液接入装有1500L发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的2500L发酵罐中，29℃，200转/分，罐压0.8Kg/cm2，通气量1∶0.8，开始时，正十五烷300L，24小时后，每隔8-6小时，用NaOH溶液调一次pH至7.5，从第三天开始，每天补加正十五烷120L，共3次，发酵6天(144小时)，发酵清液中十五碳二羧酸含量为178g/L。发酵结束后，加入一倍体积自来水，加热至90℃，加碱调pH至10，冷却降温至50℃后，放入分层罐中静量分层一天，放出上层残油，共60L，下层菌层通过压滤、除去菌体，滤清液与中层清液合并，加入0.7%活性炭，90℃脱色15分钟，压滤除去活性炭，脱色滤清液打入酸化罐中，加水至DC15浓度为4%，加热至70℃，加入浓HCl酸化至pH4，冷却降温至30℃左右，板框压滤，空气吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC15229Kg，后处理总收率85.76%，纯度为96.5%。
权利要求
1.一种利用微生物发酵生产C11-C17长链α，W-二羧酸的方法，其特征在于它包括在以C11-C17的正烷烃为基质的培养基中，用热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，即CGMCC NO.0206发酵然后回收所形成的二羧酸。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所说的C11-C17的α，W-二羧酸为十五碳二羧酸，所说的正烷烃为正十五烷。
3.热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126，即CGMCC NO.0206菌株。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物发酵生产长链α，W-二羧酸的方法，特别是高产十五碳二羧酸(DC
文档编号C12P7/46GK1092108SQ9410059
公开日1994年9月14日 申请日期1994年1月28日 优先权日1994年1月28日
发明者陈远童, 刘挺, 庞月川, 郝秀珍 申请人:中国科学院微生物研究所