冷却至约 55°C。加入针对变体B的195mg磷脂酶的一部分52g胰蛋白酶以开始第二次水解。pH保持 在7. 4约3小时，然后通过热失活酶来终止反应。最后，加入9kg麦芽糖糊精、13kg脂肪混 合物及I. 4kg矿物质和维生素并均化。对最终混合物进行进一步的UHT处理、均化、无菌灌 装或灭菌，以生产在环境温度下储存稳定的该组合物无菌液态形式，或者喷雾干燥以生产 该组合物的粉末。
[0217] 实施例2-测试夺体的比较
[0218] 使用实施例1中所述的方法生产了四个不同变体。
[0219] A.通过实施例1所述的方法生产的参考变体，使用内源磷脂酶活性相对较低的胰 蛋白酶制剂。
[0220] B.通过采用每克胰蛋白酶加入3 μ g磷脂酶IOL (胰磷脂酶A2,来自诺维信公司 (Novozymes)，10000IU/ml)，相当于每克胰蛋白酶约3mg或11单位，加至第二水解步骤来生 产变体。
[0221] C.按照与A相同的方式生产的变体，但是加入1. 2%高淀粉酶淀粉和0. 03% k-角 叉菜胶（kappa-carrageenan)作为稳定剂。
[0222] D.按照与A相同的方式生产的变体，但是使用内源磷脂酶活性相对较高的胰蛋白 酶制剂。
[0223] 变体B :每克胰蛋白酶3yg的磷脂酶IOL(胰磷脂酶A2,来自诺维信公司 (Novozymes)，10000IU/ml)，相当于每克胰蛋白酶约3mg或30单位，被加至第二水解步骤。 这对应于存在于含有约I. 5g蛋白质等同物的100g最终配方中的每40mg磷脂27yg或270 毫单位。蛋白质等同物意指蛋白质类、肽类和氨基酸类。液态乳清意指部分脱矿质的液态 乳清蛋白浓缩物，含有约30-35 %的干物质。
[0224] 相比于已知方法发现根据本发明实施方案的方法通常会导致通过HPLC检测的溶 血卵磷脂的大量增加。
[0225] 通过HPLC检测的卵磷脂转化率从24% (变体A)增加到81 % (变体B)。所得的 均化程度从75 % (变体A)增加到92 % (变体B)。均化程度如图3所示。
[0226] 分析了变体A-D的均化程度、沉降值和脂肪粒度体积加权平均[4, 3]，结果示于下 表4中。
[0227] 均化程度通过比较离心（1600Xg 15min，取样品中间部分）前后配方中的脂肪浓 度来测量，以百分比表示。该值越高，产品的乳液品质/稳定性越好。该方法用于预测产品 储存过程中脂肪乳液的分离（称为"乳液分层"）。
[0228] 沉降值表示测定均化程度后，位于离心管底部的样品的干燥固体份数。一般来讲， 理想的是该值应较低。
[0229] 粒度体积加权平均[4, 3]基于通过激光衍射的粒度测定。基于体积的粒度等于与 给定颗粒体积相同的球体的直径。其等于2*(3*体积（颗粒）/4/ρ?Γ(1/3)。在该产品基 质中，假设主要涉及脂肪颗粒/聚集体。
[0230] 一般来讲，粒度值越低，乳液稳定性越好。
[0231] 表 4
[0232]
[0233] 卵磷脂转化率示于图4和表5中，以未水解的卵磷脂相对于溶血卵磷脂来展示。溶 血卵磷脂是指使用磷脂酶A2裂解卵磷脂的产物之一。为了得到好的乳液稳定性，内源性卵 磷脂的转化应该较高。因此，未水解的卵磷脂浓度应该低，而磷脂酶转化卵磷脂的产物如溶 血卵磷脂的浓度应该高。
[0234] 卵磷脂转化率通过Lyso-L(溶血卵磷脂LPE&LPC)除以内源性-L(未水解的卵磷 月旨，除SPH以外，PI、PE、PC的总和）与Lyso-L之和的百分比来计算。
[0235] 表 5
[0237] 未对C进行分析，因为该变体的磷脂组成预计与A的磷脂组成类似。
[0238] 对变体A-D进行进一步分析，结果示于图1、图2和图3。
[0239] 图1示出了变体A-D，其中变体A、C和D显示强乳清形成和乳液向上分层，而B仅 显示轻微乳液分层。
[0240] 图2示出了相同变体A-D的显微图片，其中B表现出最小脂肪滴，无显著脂肪滴聚 集，随后是D，具有一些稍微较大的脂肪滴，最后是A和C，二者均显示较大的脂肪滴，其中局 部脂肪滴聚集。
[0241] 图3表示表2中所示产品的均化程度值的概览图。对于可接受的乳液储存稳定性 值，优选地为至少75%。
[0242] 实施例3-肠道产品一通讨分批水解制诰的营养组合物一产品具有话度的蛋白质 水解度
[0243] 针对由于疾病而无法进食任何食物或足够食物的患者，或可能食欲下降、难以吞 咽，或进行了某些类型干扰饮食的手术的患者，按照本发明的方法生产了用于肠道营养或 管饲的营养组合物。
[0244] 使用液态乳清或者将乳清粉末溶于60°C水中以形成溶液。通过添加碱溶液将pH 调节至7. 4,进行水解反应。将混合物的温度调节至约55°C，并加入0. 6%商用胰蛋白酶制 剂（基于蛋白质底物蛋白酶量）以催化混合物中蛋白质的水解。通过添加碱溶液将PH调 节至7. 4进行水解反应，并维持该pH值至少30分钟。约4小时后，水解反应结束，并对酶 进行热失活。加入脂肪、均化，再加入另外的成分如矿物质、痕量元素、碳水化合物和维生素 以形成最终的水解组合物。将最终混合物进行进一步的UHT处理、均化、无菌灌装和灭菌以 生产该组合物的液态形式，或者喷雾干燥以生产该组合物的粉末形式。
[0245] 所述磷脂酶的量可以是胰蛋白酶制剂的一部分，作为内源性胰磷脂酶A2,或者在 加入蛋白酶之前添加。任选地，可在方法中后面的步骤添加磷脂酶；但要在使酶失活的最后 一步之前添加。
[0246] 在该实施例中，磷脂酶是胰蛋白酶制剂的一部分，作为内源性胰磷脂酶A2。
[0247] 表6-肠道营养配方的抝化稈度
[0249] 表6示出了根据实施例3的肠道营养配方的均化程度。
[0250] 实施例4-通讨连续水解制诰的营养组合物一产品具有中等至低的蛋白质水解度
[0251] 按照本发明的方法生产了易于消化的营养组合物。
[0252] 使用液态乳清或者将乳清粉末溶于60°C水中以形成溶液。通过添加碱溶液将pH 调节至7. 8,进行水解反应。将混合物的温度调节至约55°C，向产物流中连续加入约1%的 商用微生物酶制剂（基于蛋白质底物的蛋白酶量）并在约50°C至约65°C保持约10分钟， 同时流过保温管以水解混合物中的蛋白质。微生物酶制剂基于枯草芽孢杆菌，例如来自诺 维信公司（Novozymes)的Alcalase。与胰蛋白酶的6. OAU/g相比，该酶制剂的蛋白水解活 性为约2. 4AU/g。
[0253] 通过加热处理对酶进行热失活，终止该酶反应。加入脂肪、均化，再加入另外的成 分如矿物质、痕量元素、碳水化合物和维生素以形成最终的水解组合物。将最终混合物进行 进一步的UHT处理、均化、无菌灌装和灭菌以生产组合物的液态形式，或者喷雾干燥以生产 组合物的粉末形式。
[0254] 所述磷脂酶的量可以是酶制剂的一部分，或者在加入蛋白酶之后添加。任选地，可 在方法中后面的步骤添加磷脂酶；但要在使酶失活的最后一步之前添加。
[0255] 实施例5
[0256] 如实施例1所述制备营养组合物，不同的是蛋白质水解使用微生物蛋白酶进行。
[0257] 实施例6
[0258] 如实施例3所述制备营养组合物，不同的是蛋白质水解使用胰蛋白酶样内肽酶和 胰凝乳蛋白酶样内肽酶的混合物来进行，其中所述胰蛋白酶样内肽酶来自尖孢镰刀菌或白 色库茨涅尔氏菌，所述胰凝乳蛋白酶样内肽酶来自Nocardiopsis sp.或金龟子绿僵菌。
[0259] 实施例7
[0260] 如实施例4所述制备营养组合物，不同的是蛋白质水解使用胰蛋白酶样内肽酶和 胰凝乳蛋白酶样内肽酶的混合物来进行，其中所述胰蛋白酶样内肽酶来自尖孢镰刀菌或白 色库茨涅尔氏菌，所述胰凝乳蛋白酶样内肽酶来自Nocardiopsis sp.或金龟子绿僵菌。
【主权项】
1. 一种制备含有水解蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供配料混合物，所述配料混合物包含至少一种蛋白质和乳卵磷脂； b) 添加至少一种磷脂酶并且进行乳卵磷脂的转化； c) 进行所述蛋白质的水解。2. 根据权利要求1所述的方法，其中蛋白质水解与乳卵磷脂的转化同时进行。3. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是乳清蛋白浓缩物或乳清 蛋白级份。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳卵磷脂是内源乳卵磷脂。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种磷脂酶是磷脂酶A1和/ 或磷脂酶A2。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤： d) 添加油； e) 干燥。7. -种蛋白质组合物，所述蛋白质组合物含有能够根据权利要求1至6中任一项所述 的方法获得的水解蛋白质。8. -种制备营养产品的方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供根据权利要求7所述的蛋白质组合物； b) 添加一种或多种营养物质。9. 一种能够根据权利要求8所述的方法获得的营养产品。10. 根据权利要求9所述的营养产品，其特征在于存在于所述营养产品中的仅有的乳 化剂源自乳卵磷脂。11. 根据权利要求9至10中任一项所述的营养产品，其中所述组合物为乳液，优选地为 水包油乳液。12. 根据权利要求9至11中任一项所述的营养产品，其中所述组合物为肠道组合物或 口服组合物。13. 根据权利要求9至12中任一项所述的营养产品，其中所述组合物为低变应原性的 营养产品，如低变应原性的婴幼儿配方或低变应原性的保健营养配方。14. 根据权利要求9至13中任一项所述的营养产品，其中卵磷脂的转化率为至少 20%〇15. 根据权利要求7所述的蛋白质组合物在制备营养产品中的用途。
【专利摘要】本发明提供了制备蛋白质组合物的方法，所述方法包括使用磷脂酶对乳卵磷脂进行酶改性。然后将所述蛋白质组合物包含到营养产品中，以提高最终营养产品的乳液品质和热稳定性。
【IPC分类】A23L33/00, A23J7/00, A23L33/10, A23J3/34, A23J3/08, A23L33/19
【公开号】CN105338835
【申请号】CN201480035756
【发明人】M·布劳恩
【申请人】雀巢产品技术援助有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年6月27日
【公告号】CA2912755A1, EP3013159A1, US20160150805, WO2014207247A1