专利名称：幽门螺杆菌抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及衍生自猴菇菌的分离物，更具体地，本发明涉及衍生自猴菇菌的、可用作幽门螺杆菌抑制剂的分离物。
背景技术：
自1982年Marshall和Warren从胃炎患者中分离出幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)之后，世界各国的科学家对幽门螺杆菌的生物学特性、致病机理、诊断和治疗进行了广泛的研究，现已确认幽门螺杆菌是慢性胃炎的主要致病因子，与消化性溃疡的发病密切相关，WHO和国际癌研究组织已将其列为第一类致癌因子。
临床上，应用单一抗生素很难根除幽门螺杆菌的感染，因此采用了不同的药物组合，比如以铋剂为基础的二联和三联疗法。虽然这种组合疗法的效果明显，但其应用仍然遇到了一些困难，主要不表现为副作用大；耐药性增加；肠道内有益菌的数量和种类减少，菌群失衡。因此，寻找治疗简单、安全无副作用、治愈率高的药物是医药研究者孜孜以求的目标，幽门螺杆菌感染的治疗也趋于多元化。
猴菇菌(Hericium erinaceum，He)也称为猴菇菌，可用来治疗慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌等疾病已得到广泛的认可，上海市中药制药三厂的猴菇菌片已在临床应用多年。虽然众多的报道认为猴菇菌中含有多糖、生物碱、萜类等生物活性成分，但这些成分对幽门螺杆菌是否有抑制作用尚未见报道。
因此，本领域迫切需要开发衍生自猴菇菌的、对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
发明内容
本发明人经过多年深入研究，对猴菇菌中抗幽门螺杆菌的成分进行了提取分离，获得了有效抑制幽门螺杆菌生长的分离物，并研制成幽门螺杆菌抑制剂。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种分离物，它包括猴菇菌子实体碱醇提取物经薄层层析分离到的Rf值在0.15-0.6之间的组分。
在一优选例中，所述的分离物选自下组物质(1)猴菇菌子实体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，Rf值为0.50±0.05；(2)FrIII-4和5，Rf值为0.4±0.05和0.45±0.05(3)FrIII-6和7，Rf值分别为0.30±0.05，0.20±0.05；或它们的混合物。
在另一优选例中，所述的分离物是猴菇菌子实体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，其分子式为C34H52O7。
在另一优选例中，所述的分离物的结构式为 在本发明的第二方面，提供了一种获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的方法，它包括步骤(a)将猴菇菌子实体和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小时；(b)过滤得到滤渣；(c)向滤渣加入碱性乙醇，回流提取5-50小时；(d)过滤得到滤液；(e)浓缩滤液；(f)用酸酸化滤液至pH为2-4；(g)放置5-100小时，过滤获得沉淀。
在一优选例中，碱性乙醇的pH为8-10，体积为滤渣的5-20倍或更多，较佳地为滤渣的10-15倍。
在另一优选例中，在步骤(c)中回流条件是回流提取3-8次，每次2-6小时。
在另一优选例中，步骤(f)中，用2-8N盐酸酸化至pH 2.5-3.5。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(h)对沉淀进行硅胶柱层析，从而获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
在本发明的第三方面，提供了一种幽门螺杆菌抑制剂，它含有本发明上述的分离物。
图1是本发明获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的流程图。
图2是检测CagA基因的电泳图。其中各泳道分别是1-阴性对照；2-阳性对照；3-分子量标准；4-沪东97；5-P44；6-12908。
图3显示了本发明的分离物对幽门螺杆菌的抑制作用。
具体实施例方式
如本文所用，Rf值指各成分在薄层层析板上斑点的位置，称作比移值。其计算公式如下Rf＝展开后，起始线至斑点中心的距离/展开后，起始线至溶剂前沿的距离可用于本发明原料没有特别限制，只要是猴菇菌即可。较佳地为固体培养的猴菇菌子实体。
在本发明的分离方法(参见图1)中，首先将猴菇菌子实体(宜为粉碎形式)与一定量的水混合。水的体积没有特别限制，通常为猴菇菌子实体体积的5-20倍或更多，较佳地为10-15倍。
然后，将水的混合物在90-100℃(较佳地95-100℃)回流提取。回流时间特别特别限制，通常为5小时以上，较佳地为5-100小时。可以分段进行，例如回流提取3-8次，每次2-6小时(更佳地3-5小时)。
回流处理过的混合物，经过滤后得到滤渣。
接着，向滤渣加入碱性乙醇，进行回流提取。碱性乙醇的pH为8-10，浓度越高越好，例如99.9％，体积为滤渣的5-20倍或更多，较佳地为10-15倍。回流时间特别特别限制，通常为5小时以上，较佳地为5-100小时。可以分段进行，例如回流提取3-8次，每次2-6小时(更佳地3-5小时)。
对回流处理过的混合物进行过滤，得到滤液。再用常规方法，例如真空浓缩滤液。通常至少浓缩为原体积的1/2以上。
接着，用酸酸化滤液。其中，采用的酸没有特别限制，可以是盐酸，硫酸等无机酸或乙酸等有机酸，较佳地是盐酸，其浓度通常2-8N。通常将pH调节为2-4，较佳地pH 2.5-3.5即可。
最后，放置一段时间(通常为5小时以上，例如5-100小时)，对产生的沉淀进行过滤即可获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
在另一优选例中，还可获得的分离物进一步地进行硅胶柱层析，获得对幽门螺杆菌有抑制作用的级分FrIII3-7。
本发明的分离物可用作幽门螺杆菌抑制剂，抑制幽门螺杆菌的生长。因此，可作为药物活性成分用于药物组合物，例如治疗胃病的药物组合物。此外，还可作为添加剂用于食品或保健品。在本发明的抑制剂中，可以添加各种常规的载体、赋形剂、稀释剂、添加剂、香料、防腐剂等物质，只要它们不干扰本发明分离物的抑制幽门螺杆菌的活性。此外，还可与治疗胃病等消化性溃疡或改善肠胃的物质联用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的提取和纯化以固体培养的猴菇菌子实体为原料，按图1所示的流程进行提取。其中，粉碎后的子实体和10倍水的混合物在是100℃下回流3小时，共5次；滤渣与12倍碱性乙醇溶液(pH10)的混合物回流3小时，共5次；滤渣与10倍酸性乙醇(pH3-5)溶液的混合物回流3小时，共5次。
制得组分FrI、FrII、FrIII和FrIV。各组分的提取率见表1。
表1 100g猴菇菌子实体或菌丝体中各组分的提取率
实施例2对组分FrIII的进一步分离A.薄层层析(TLC)及结果分别以下述系统为展开剂，以硫酸∶甲醇(1∶1)为显色剂，进行薄层层析。
系统1—正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)系统2—正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚(1∶1∶1)系统3—氯仿∶乙醚∶乙酸乙酯(9∶1∶1)系统4—甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)结果表明，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂时效果最好。在猴菇菌子实体乙醇提取物中有10个左右的斑点。
B.硅胶柱层析条件及结果硅胶200-300目洗脱剂∶氯仿∶甲醇＝9∶1，8∶2，1∶1展开剂∶甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5流速快速分离，400ml/15分钟每管体积15ml上样量22g(FrIII)。
经一次硅胶柱层析后得到FrIII-1～2混合物(氯仿∶甲醇＝9∶1)1.15g，FrIII-3～5混合物(氯仿∶甲醇＝8∶2)2.24g，FrIII-6～7混合物(氯仿∶甲醇＝1∶1)12.5g。将FrIII-3～5混合物再次硅胶柱层析(正己烷-乙酸乙酯体系，洗脱程序正己烷100％20ml→90％20ml→80％20ml→70％20ml→60％20ml→50％20ml；减压层析法，保持流速约1.2ml/min；每5ml分管收集，显色剂同上)，得到FrIII-3(80％正己烷部分，1.09g)和FrIII-4～5的混合物0.86g。
实施例3对各组分或级分的定性鉴定(1)FrI和FrII利用蒽酮硫酸显色的方法。上述沉淀取少量，溶于去离子水中，取1ml溶液，加入4ml蒽酮硫酸试剂(1g蒽酮溶于500ml的浓硫酸中)，煮沸10分钟，呈蓝绿色，证明含有多糖。
(2)FrIIIA.利用醋酐-硫酸反应(Liebermann-Burchard反应)取实施例1中的浓缩液各1ml蒸干，加醋酐1ml溶解，后滴加浓硫酸2滴，呈黄色→紫红色→墨绿色转变，说明含有皂甙和三萜类。
B.利用TLC按实施例2中所述的方法进行TLC，结果表明，子实体中FrIII组份中有5个斑点的Rf值在0.15～0.60之间，另外有2个斑点的Rf值在0.60～0.70之间。在实验中观察到FrIII-3～5(Rf＝0.56～0.40)先显亮红色，然后变为紫色；FrIII-6～7(Rf＝0.40～0.17)则由橙色变为紫色，这表明这些级份中都可能含有萜酸，且具不饱和特性，否则呈黄色并逐渐褪色。
FrIII-3，FrIII-4，FrIII-5，FrIII-6，FrIII-7的Rf值分别为0.50±0.05；0.4±0.05，0.45±0.05，0.30±0.05，0.20±0.05。
C.光谱分析(i)紫外光谱FrIII-3的最大吸收(λmax)在254nm；FrIII-4～5的最大吸收(λmax)在246nm、FrIII-6～7在223nm左右。
(ii)红外光谱FrIII-3～7在3000～3500cm-1的有强吸收峰表明含有羟基；2400cm-1处的弱吸收峰表明是三萜酸；在1740cm-1～1760cm-1没有出现五元环酮的特征吸收，表明C15位无羰基。1200～1400cm-1的两个吸收峰(1305cm-1，1400cm-1)是多氢菲环的特征吸收，是四环三萜最为有力的证明。
(iii)核磁共振对FrIII-3和FrIII-4～5进行了13CNMR分析，数据如表2和3所示表2 FrIII-3的13CNMR数据
表3FrIII-4和FrIII-5的13CNMR采集到的主要数据
D.质谱分析经ESI-MS检测到FrIII-3的分子离子峰(m/z)比较明显在572(M+)，570(M+-2H)，535(M+-2H2O)。因此推测FrIII-3的分子式为C34H52O7，其可能的分子结构如下 (3)FrIV利用1％三氯化铝显色反应。取组分FrIV溶液1ml，滴加1％三氯化铝溶液，呈黄色反应，证明含有黄酮类物质。
实施例4各组分和级分的抑菌效果检测(一)材料实验材料1、培养基营养琼脂，改良布氏琼脂，巧克力琼脂，蛋黄琼脂2、新鲜脱纤维马血、羊血3、混合抗生素万古霉素(Vancumycin)，多粘菌素B(Polymyxin B)，黄胺增效剂(TMP)4、实验菌株幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)三株，编号为12908(常用的标准株)，沪东97，F44(临床分离菌株)(二)、结果与讨论1、幽门螺杆菌培养采用不同培养基，不同培养方式和不同厌气条件进行培养。
表4不同培养基对幽门螺杆菌生长的影响
-不生长。+，++，+++生长能力依次递增。下同表5不同培养方式对幽门螺杆菌生长的影响
由表4、表5可以看出在布氏琼脂、巧克力琼脂上，以及在三气(5％O2，10％CO2，85％N2)条件下幽门螺杆菌生长良好；这说明幽门螺杆菌是一种专性微需氧菌，在大气中和绝对厌氧环境中均不能生长。
2、幽门螺杆菌鉴定按常规方法进行包括形态特征、生化反应和PCR分型的鉴定。结果如下表6幽门螺杆菌的鉴定
+阳性；-阴性虽然幽门螺杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应，但幽门螺杆菌均能产生尿素酶(Urease)、触酶(Catalase)和氧化酶(Oxidase)。因此以它们作为幽门螺杆菌生化鉴定依据，但这些酶的测定对幽门螺杆菌的分型毫无帮助。而研究认为在幽门螺杆菌菌株中，含有毒素相关蛋白基因(Cytotoxin associated gene A，CagA)的菌株(I型菌)具有较强的毒性，与十二指肠溃疡及胃癌的发生密切相关。因此对三株幽门螺杆菌的CagA基因进行了PCR检测，有一株(沪东97)具有CagA基因，其电泳见图2。然后，主要以沪东97为实验菌，对猴菇菌提取物进行了抑菌作用实验。
3、猴菇菌提取物对幽门螺杆菌的抑制作用用不同浓度或稀释度的各组份，通过常规的滤纸扩散法测抑菌圈大小和倍比稀释培养法进行药敏实验。
表7猴菇菌提取物对幽门螺杆菌的抑制作用
+，有活性；-，无活性。
提取物浓度FrI，FrII，FrIII，FrIV各为10mg/ml。
由实验结果可以看出，FrIII对幽门螺杆菌具有抑制作用。测其最低抑菌浓度(MIC)，实验结果见表8和图3。
表8FrIII组分的MIC
*1∶1的浓度为10mg/ml。
由表8中可以看出，FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7的最低抑菌浓度分别为1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml和1.25mg/ml，而FrIII-1～2则无活性。
图3为FrIII对幽门螺杆菌(沪东97)的抑菌圈，直径为11mm。
此外，FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7对12908和P44有同样的抑制作用。
实施例5幽门螺杆菌抑制剂的制备1、提取猴菇菌子实体6kg，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏0.25kg(FrI)，备用。滤渣加入240L碱性无水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到1.5L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到63g沉淀(FrIII)，备用。
2、配制产品配方淀粉 64％FrI(多糖)10％FrIII5％大豆蛋白 12％橘粉 9％将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
实施例6幽门螺杆菌抑制剂的制备1、提取猴菇菌子实体1kg，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏45g(FrI)，备用。滤渣加入25L碱性无水乙醇(pH10)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到0.25L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到12g沉淀(FrIII)，备用。
2、配制产品配方淀粉 64％FrI(多糖) 15％
FrIII8％大豆蛋白 8％橘粉 5％将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种分离物，其特征在于，它包括猴菇菌子实体碱醇提取物经薄层层析分离到的Rf值在0.15-0.6之间的组分。
2.如权利要求1所述的分离物，其特征在于，它选自下组物质(1)猴菇菌子实体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，Rf值为0.50±0.05；(2)FrIII-4和5，Rf值为0.4±0.05和0.45±0.05(3)FrIII-6和7，Rf值分别为0.30±0.05，0.20±0.05；或它们的混合物。
3.如权利要求2所述的分离物，其特征在于，它是猴菇菌子实体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，其分子式为C34H52O7。
4.如权利要求3所述的分离物，其特征在于，其结构式为
5.一种获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将猴菇菌子实体和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小时；(b)过滤得到滤渣；(c)向滤渣加入碱性乙醇，回流提取5-50小时；(d)过滤得到滤液；(e)浓缩滤液；(f)用酸酸化滤液至pH为2-4；(g)放置5-100小时，过滤获得沉淀。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，碱性乙醇的pH为8-10，体积为滤渣的5-20倍。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中回流条件是回流提取3-8次，每次2-6小时。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(f)中，用2-8N盐酸酸化至pH2.5-3.5。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤(h)对沉淀进行硅胶柱层析，从而获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
10.一种幽门螺杆菌抑制剂，其特征在于，它含有权利要求1所述的分离物。
全文摘要
本发明提供了一种衍生自猴菇菌的、可用作幽门螺杆菌抑制剂的分离物，它包括猴菇菌子实体碱醇提取物中经薄层层析分离到的Rf值在0.15－0.6之间的组分。本发明还提供了获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的方法，以及含所述分离物的幽门螺杆菌抑制剂。本发明的分离物和抑制剂可有效地抑制幽门螺杆菌的生长。
文档编号A61K31/575GK1440978SQ0211090
公开日2003年9月10日 申请日期2002年2月27日 优先权日2002年2月27日
发明者李平作, 谢松, 赵国屏, 陈常庆 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心