专利名称：一组金刚烷胺类衍生物及其合成方法和作为神经元损伤保护剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及金刚烷胺类化合物的N-烃基单取代、N-烃基双取代和N-酰化衍生物的结构、合成方法以及在神经损伤保护作用方面的应用，它对今后研究和开发所说化合物在神经退化性疾病方面的防治作用奠定了基础。
背景技术：
研究证明，70％的脑细胞是以谷氨酸为神经递质进行快速信号传导的。受谷氨酸激活的神经突触受体为N-甲基-D-天冬氨酸型(NMDA)谷氨酸受体。NMDA受体的过度兴奋导致神经突触内Ca2+浓度过高，信号传导背景噪音增加，以致学习或记忆发生时的信息变化不明显或难以识别，表现为痴呆(McBrain CJ et al，Physiol.Rev 74723-760，1994)。老年痴呆、HUNTINGTON病、萎缩性脊髓炎和AIDS性痴呆等慢性脑神经性疾病都与脑细胞谷氨酸的分泌长时间浓度过高使得NMDA受体长时间过度兴奋有关。此外，在脑缺血、缺氧时，谷氨酸的分泌也急剧增加，NMDA受体的急剧过度兴奋，是脑手术后脑细胞丢失和导致多种脑疾病的主要原因。
金刚烷胺类化合物是NMDA受体的小分子、可逆性拮抗剂，能有效抑制NMDA受体的过度兴奋，具有保护皮质神经使其不受损伤的作用(Rogawski MAet al，Amino Acids.19133-149，2000)。其中，盐酸3，5-二甲基金刚烷胺(M1) 在临床上被用于治疗帕金森氏病、老年痴呆、AIDS痴呆、术后脑恢复等多种疾病(李艳萍等，中国临床药理学杂志19461-463，2003)。与此同时，还具有外周神经毒解毒作用，如视网膜神经元保护及耐低氧作用等。
文献对含有金刚烷基的数十个系列化合物进行的NMDA受体拮抗作用的动物实验结果显示单氨基化合物如金刚烷胺(Ad)、3，5-二甲基金刚烷胺虽显示了能够阻断NMDA受体的作用，但是当剂量增加到最低有效剂量的2-8倍时急性毒性就明显增强，而双氨基化合物则在有效性和安全性方面均优于单氨基化合物。由此，本发明以金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺为先导物，进行N-取代衍生物的合成，以筛选神经保护活性更强的化合物。另一方面，基于神经细胞保护作用的机理，要求所用化合物应能通过血脑屏障，并在脑中保持一定的浓度，即具有一定的脂溶性。本发明合成了金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺的酰胺衍生物，以期达到提高脑部靶向性的目的。
即本发明的目的是通过对金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺的胺基部分进行结构修饰和改造，以期提供活性更高或具有更好脑部神经组织选择性、降低对周边神经的副作用的新型神经原损伤保护剂。本发明合成了金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺的胺基被不同的烃基或酰基取代的衍生物，研究了所合成化合物在体外对谷氨酸引起的神经毒性的抑制作用。本发明所涉及的化合物及其神经损伤保护作用的研究，迄今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明以金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺为先导化合物，进行了N-烃基单取代、N-烃基双取代和N-酰化衍生物合成及神经损伤保护作用的研究。体外活性研究结果表明，本发明化合物对谷氨酸引起的神经损伤均表现出抑制活性的功效，为今后研究与开发所说化合物在神经退化性疾病方面的防治作用奠定了基础。
本发明的首要方面是提供了式(I)的化合物
其中，R1＝CH3或H；R2＝CH3、H或R1；R3＝H或含3-8个碳原子的连状或环状羟基取代烃基；R4＝H、烃基取代羰氧酰基、含3-8个碳原子的连状或环状羟基取代烃基或樟脑酰基。
本发明的优选化合物，具体用下式代表， Ad1R1＝R2＝R3＝H；R4＝CO2CH3Ad2R1＝R2＝R3＝H；R4＝CO2CH(CH3)2Ad3R1＝R2＝R3＝H；R4＝(-)-camphanylM1-1R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CO2CH3M1-2R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CO2CH(CH3)2M1-3R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝(-)-camphanylM1-4R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CH2CHOHCH3M1-5R1＝R2＝CH3；R3＝R4＝CH2CH2OH其中的化合物用代号Ad1Ad2Ad3M1-1M1-2M1-3M1-4M1-5表示，其中的英文camphanyl代表莰基。
本发明还提供了本发明化合物的制备方法。本发明化合物的制备可以采用以下方法以式(II)为起始原料(金刚烷胺R1＝R2＝H；3，5-二甲基金刚烷胺R1＝R2＝CH3)，在非质子性溶媒中，于碱性试剂(如三乙胺、吡啶等)存在下，与烷基取代环氧乙烷或烷氧羰基氯或樟脑酰氯等缩合反应，得到式(I)所示的N-取代衍生物。起始原料金刚烷胺从ACROS公司购买得到，3，5-二甲基金刚烷胺参考专利US P 3,391,142方法合成得到。试剂烷基取代环氧乙烷和烷氧羰基氯从南京天尊化学服务中心购买得到，樟脑酰氯从ACROS公司购买得到。合成路线如下
本发明化合物的合成路线本发明还提供了本发明化合物在制备保护神经元损伤药物的应用。
谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，正常生理情况下通过受体介导对突触兴奋性的传导起调节作用。在病理状态下或出现应激性损伤时，谷氨酸过度释放会造成神经元的损伤，导致神经传递功能减弱甚至丧失。因而，在检测所说化合物的神经元保护活性时，本发明使用了谷氨酸损伤模型，通过测定MTT代谢率和LDH漏出率来反映所合成化合物对谷氨酸损伤的人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，从细胞水平评价化合物对谷氨酸损伤神经细胞的保护作用，并通过量效曲线比较化合物的作用强弱和效能。
本发明的还提供药物组合物，本发明的药物组合物可以含有治疗有效量的本发明式(I)化合物，必要时可以加入一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物，可以是任何适合服用的剂型，本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。
本发明的化合物和药物组合物可用于制备因谷氨酸过度释放引起的神经元损伤保护药物。
发明效果体外细胞模型试验结果表明，所有试验化合物均可在某个或某些浓度条件下使损伤的神经细胞SY5Y的生长恢复到正常水平，且效果均优于先导化合物金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺。其中，M1-3和Ad3在5μM浓度下即可使MTT代谢率恢复到正常水平，并且能在较大的浓度范围内维持稳定水平，这一作用特点符合药物筛选的安全性评价标准。本发明选择了对照药M1和样品M1-3进行了谷氨酸损伤神经细胞LDH漏出率影响试验。结果表明，M1和M1-3对由谷氨酸损伤引起的神经细胞LDH漏出有明显抑制作用。Western-blotting测定神经细胞营养蛋白p-CREB的表达结果，谷氨酸可使神经细胞中p-CREB蛋白含量明显降低，而化合物M1-3和M1可明显抑制由谷氨酸引起的p-CREB表达量的降低。从蛋白代谢角度再次验证了本发明化合物对神经损伤的保护活性。
图1 为3，5-二甲基金刚烷胺及其N-取代衍生物对神经细胞MTT代谢率的影响关系曲线其中，M1为3，5-二甲基金刚烷胺；M1-1至M1-4为其N-取代衍生物。
图2 为金刚烷胺及其N-取代衍生物对神经细胞MTT代谢率的影响关系曲线其中，Ad为金刚烷胺；Ad1至Ad3为其N-取代衍生物。
图3 为M1和M1-3对神经细胞LDH漏出率影响试验结果其中，Glu为谷氨酸(500μM)组；Glu+M1-3为谷氨酸(500μM)+M1-3(30Mμ)组；Glu+M1为谷氨酸(500μM)+M1(20μM)。
图4 为神经细胞p-CREB表达Western-blotting电泳结果图其中，Glu为谷氨酸(500μM)组；Control为空白对照组；Glu+M1-3为谷氨酸(500μM)+M1-3(30Mμ)组；Glu+M1为谷氨酸(500μM)+M1(20μM)。
具体实施例方式以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1. 1-甲氧酰基-3，5-二甲基金刚烷胺(M1-1)的合成将三乙胺(0.24ml，1.7mmol)加入M1(300mg，1.67mmol)的THF溶液中，搅拌10分钟后，冰水浴及N2保护下，向混合液中滴加入甲氧酰氯(1.67mmol)，室温搅拌3小时。过滤反应液，THF冲洗不溶物，合并滤液，加入硅胶2克，搅拌40分钟，蒸去溶剂后转移到硅胶柱上，洗脱剂(haxane∶EA＝25∶1)冲洗，浓缩洗脱液后得到酰胺0.37g，收率为93％。结构鉴别数据如下
M1-11HNMR(ppm，CDCl3)0.82(s，6H，2CH3)，1.07(s，2H，4-CH2)，1.2-1.5(m，J＝12，4H，7，9-2CH2)，1.5-1.6(s，4H，2，6-2CH2)，1.75(d，J＝2.4，2H，10-CH2)，2.08-2.10(m，1H，8-CH)，3.6(s，3H，-OCH3)，4.58(s，-NH).
FAB-MS[2M++1]475.3，[M++1]238.2，mp38-40℃。
实施例2.N-甲氧酰基金刚烷胺(Ad1)的合成用与实施例1类似方法，合成得到N-甲氧酰基金刚烷胺(Ad1)，收率为89％。
结构鉴别数据如下Ad11HNMR(ppm，CDCl3)1.66(m，6H，3CH2)，1.9(m，6H，3CH2)，2.09(m，3H)，3.6(s，3H，OCH3).
FAB-MS[M++1]210.1，mp90℃(晶型改变)、112℃(熔化).
实施例3.N-异丙氧酰基-3，5-二甲基金刚烷胺(M1-2)的合成用与实施例1类似方法，合成得到M1-2，收率79％。结构鉴别数据如下M1-21HNMR(ppm，CDCl3)0.82(s，6H，2CH3)，1.07(d，J＝1.8Hz，CH2)，1.2(m，6H，2CH3)，1.1-1.4(m，6H，3CH2)，1.6(m，4H，2CH2)，1.76(s，2H，CH2)，2.08-2.10(m，1H，CH)，4.42(s，-NH)，4.83(m，1H，CH)。
FAB-MS[M++1]266.1。
实施例4.N-异丙氧酰基金刚烷胺(Ad2)的合成与实施例1类似方法，合成得到N-甲氧酰基金刚烷胺(Ad2)，收率为89％。结构鉴别数据如下Ad21HNMR(ppm，CDCl3)1.2(m，6H，2CH3)，1.6-1.7(m，6H)，1.9(m，6H，3CH2)，2.09(s，3H)，4.83(m，1H)。
FAB-MS[M++1]238.2，mp95~115℃(分解)。
实施例5.N-樟脑酰基-3，5-二甲基金刚烷胺(M1-3)的合成冰水浴冷却条件下，向含有三乙胺(1.7mmol)及M1(1.3mmol)的6ml THF溶液中加樟脑酰氯(1.36mmol)的THF加毕，氮气保护下室温搅拌3小时，过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱分离.得到M1-30.4g.
M1-31HNMR(ppm，CDCl3)0.82(s，6H，3CH2)，0.9(s，3H，CH3)，1.1(d，6H，2CH3)，1.18(d，2H，CH2)，1.2-1.4(m，4H，2CH2)，1.63(m，6H)，1.8-2.0(m，4H)，2.5(m，1H)。
FAB-MS[M++1]360.3，mp118-120℃。
实施例6.N-樟脑酰基金刚烷胺(Ad3)用与实施例5类似方法，合成得到N-樟脑酰基金刚烷胺(Ad3)，收率为90％。
结构鉴别数据如下Ad31HNMR(ppm，CDCl3)0.9(s，3H，CH3)，1.1(d，6H，2CH3)，1.64(m，8H)，1.85(m，2H)，2.0(s，6H)，2.1(s，3H)。
FAB-MS[M++1]332.2，mp145℃(分解)。
实施例7.N-(2-羟基-1-丙基)氨基-3，5-二甲基-金刚烷(M1-4)的合成向M1(350mg，1.95mmol)的THF溶液中加入1，2-环氧丙烷(230mg，4.0mmol)搅拌均匀后，室温密闭搅拌，TLC跟踪反应，每隔4小时加入环氧丙烷(0.11g，1.95mmol)至原料消失。减压蒸干反应液，残余物加入氯仿溶解，依次用氢氧化钠、水、硫酸钠水溶液洗涤，有机层经硫酸镁干燥后硅胶柱分离纯化得到无色油状产物0.31g。收率67％。结构鉴别数据如下1H-NMR(CDCL3，ppm)0.8(s，6H，2CH3)，1-1.5(m，16H)，2.3(dd，1H)，2.7(dd，1H)，2.1(s，-NH)，2.4(s，-OH)3.6(m，1H)。
FAB-MS238(M++1)。
实施例8.N-二(2-羟基乙基)氨基-3，5-二甲基-金刚烷(M1-5)的合成方法同实施例7，加入过量反应试剂为环氧乙烷，最终得到双取代产物。结构鉴别数据如下1H-NMR(DMSO，ppm)0.8(s，6H，2CH3)，1.04(s，2H，CH2)，1.2(m，8H，4CH2)，1.4(d，2H)，2.05(m，1H，CH)，2.58(m，4H，N(CH2)2)，3.26(m，4H，2CH2OH)，4.38(s，OH)。
FAB-MS268(M++1)。
实施例9.神经细胞谷氨酸损伤保护活性试验材料人神经母细胞瘤株SY5Y由瑞典卡罗琳斯卡研究所提供。谷氨酸(L-glutamic acid)Sigma产品，20H0797；MTTSigma产品；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒北京化工厂产品，编号020623；NT-3抗体、NF抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗由北京中山化学试剂公司生产；丙烯酰胺、DAB均为Sigma产品；Tris为Promager产品；蛋白测定试剂(1×1 Bio-Rad protein Assay，1-800-424-6723)为Bio-Rad产品。
细胞培养条件MEM(Gibco BRL，41 500-067)培养基中加入体积分数为10％的胎牛血清(Hyclone，SH 30 070 03)15mmol·L-1HEPES(DNN company)，青霉素1×105IU·L-1、链霉素1×105IU·L-1，0.05CO2，37℃，每周换液2次，传代1次。
仪器北京六一仪器厂DYY-型28A稳压稳流电泳仪和DYY-型转移电泳仪。
方法(1)MTT代谢率测定 将SY5Y细胞以密度为每毫升1×103个细胞接种于96孔板(Costar产品)，3d后分为对照组、谷氨酸组(500μmol·L-1)和化合物分别为5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、30μmol·L-1、40μmol·L-1、50μmol·L-1、60μmol·L-1加谷氨酸500μmol·L-1组，每组8孔。接种后4每孔加MTT(5g·l-1)20μl，37℃孵育4H，吸出培养液，每孔加200μl DMSO，振摇10min，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。
细胞计数 将SY5Y细胞以密度为每毫升1×103个细胞接种于是24孔板，3d后分为对照组500谷氨酸组和不同浓度化合物加谷氨酸组，每组8孔。接种后d4、d5、d6对各组进行细胞计数。
(2)乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定将SY5Y细胞以密度为每毫升1×103个细胞接种于24孔板，3d后分为对照组、谷氨酸组和化合物加谷氨酸组，每组8孔，接种后4d留取各组细胞培养液，LDH测定试剂盒所示方法(比色法)，测定450nm处光密度值。
SDS聚丙烯酰胺凝胶转移电泳(Western Blot)提取并检测蛋白含量 冰浴中提取对照组，谷氨酸组，加样谷氨酸组SY5Y细胞蛋白。应用蛋白测定试剂检测蛋白含量，以控制投料量。积层胶5％，分离胶12％，一抗为NT-3和NF，二抗由辣根过氧化物酶标记，显色剂为DAB。灌胶，聚集，加入电泳液；上样；跑胶；转膜；洗膜；封闭；加一抗；洗膜；加二抗；洗膜；曝光；显影；定影；记录marker各条带位置。统计学处理应用SPSS软件做T检验统计。
测定结果(1)MTT代谢率测定结果MTT为噻唑蓝，被培养的细胞摄取后，通过线粒体代谢生成甲赞(formazan)，故线粒体活力越旺盛，甲赞生成越多，光密度值也越高，通过测定MTT代谢率，可反映细胞生存情况。所测样品中，衍生物均比相对先导药物的保护作用强，且都能使细胞MTT代谢率恢复到正常水平甚至在一定浓度下表现出较正常水平还要好的作用。各化合物量效关系比较于图1和图2，各化合物的OD峰值及相应浓度数量比较于表1。
表1、各化合物OD峰值及相应浓度数量比较
sample M1M1-1M1-2M1-3M1-4Ad Ad1Ad2Ad3controlvalue 1 111 11 1 1 1ODbase0.92 0.91 0.87 0.930.96 0.92 0.92 0.95 0.96valuepeak0.97 0.99 1.03 1.121.03 1.03 1.229 1.279 1.086valuepeak20 50 30 5 40 10 45 45 5con.μM由图1、图2和表1可以看出，所有试验化合物均可在某个或某些浓度条件下使神经细胞SY5Y的生长恢复到正常水平，且效果均优于对照药美金刚胺和金刚烷胺。其中，M1-3和Ad3在5μM浓度下即可使MTT代谢率恢复到正常水平，并且能在较大的浓度范围内维持稳定水平，这一作用特点符合药物筛选的安全性评价标准。
(2)LDH漏出率测定结果试验化合物对LDH漏出率的影响测定结果如表2和图3所示。
表2、M1和M1-3对LDH漏出率的影响比较对照组 Glu Glu+M1Glu+M1-3n22 21 24 24317.1818± 403.4762± 161.0000±164.5417±LDH132.30219 206.55644#↑ 65.62608*↓ 52.28515**↓与对照组相比#P＜0.027，*P＜0，**P＜0结果显示谷氨酸损伤组(Glu组)的LDH漏出率为403.4762±206.55644U，明显高于对照组(317.1818±132.30219U)，P＜0.027；加样组Glu+M1(161.0000±65.62608U)和Glu+M1-3(164.5417±52.28515U)的LDH漏出率值明显低于谷氨酸组(P＜0)甚至对照组。
(3)对p-CREB蛋白的影响p-CREB蛋白为神经细胞的营养蛋白，Western-blotting结果显示(图4)，谷氨酸组细胞中p-CREB蛋白含量较Control对照组明显降低，加药组(M1-3及M1)较谷氨酸组显著升高，接近正常值。即化合物M1-3和M1可明显抑制由谷氨酸引起的p-CREB表达量的减少。从蛋白代谢角度再次证明本发明化合物对神经损伤的保护活性。
谷氨酸损伤的神经细胞保护作用试验结论证明，本发明化合物均较对照药金刚烷胺和3，5-二甲基金刚烷胺的作用明显增强，但考虑到前面述及的可逆性作用的需要，综合有效性和安全性两方面，本发明认为，M1-3和Ad3可能最具研究开发价值。
权利要求
1.一组金刚烷胺类衍生物，其化学结构如式(I)所示 其中，R1＝CH3或H；R2＝CH3、H或R1；R3＝H或含3～8个碳原子的链状或环状羟基取代烃基；R4＝H、烃基取代羰氧酰基、含3～8个碳原子的链状或环状羟基取代烃基或樟脑酰基。
2.如权利要求1所述的衍生物，它是指以下化合物 Ad1R1＝R2＝R3＝H；R4＝CO2CH3Ad2R1＝R2＝R3＝H；R4＝CO2CH(CH3)2Ad3R1＝R2＝R3＝H；R4＝(-)-camphanylM1-1R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CO2CH3M1-2R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CO2CH(CH3)2M1-3R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝(-)-camphanylM1-4R1＝R2＝CH3；R3＝H；R4＝CH2CHOHCH3M1-5R1＝R2＝CH3；R3＝R4＝CH2CH2OH
3.一种制备如权利要求1所述衍生物的方法，其特征是以式(II)为起始原料其中R1＝R2＝H；或R1＝R2＝CH3，在非质子性溶媒中，于碱性试剂存在下，与烷基取代环氧乙烷或烷氧羰基氯或樟脑酰氯等缩合反应，得到式(I)所示的N-取代衍生物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其中非质子性溶媒是指四氢呋喃。
5.如权利要求3所述的制备方法，其中碱性试剂是指三乙胺或吡啶。
6.一种以权利要求1所述衍生物为有效成分的药物组合物。
7.如权利要求6所述的组合物，必要时可以加入药学上可接受的一种或多种载体。
8.权利要求6所述的组合物，是指适合药用的任何制剂形式。
9.权利要求1所述金刚烷胺类衍生物在制备保护神经元损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一组金刚烷胺类衍生物及其合成方法和作为神经元损伤保护剂的应用，所述金刚烷胺类衍生物是金刚烷胺类化合物的N－烃基单取代、N－烃基双取代和N－酰化衍生物的结构、合成方法以及在神经损伤保护作用方面的应用，体外试验结果表明，所有试验化合物均可在某个或某些浓度条件下使损伤的神经细胞SY5Y的生长恢复到正常水平，且效果均优于先导化合物金刚烷胺和3，5－二甲基金刚烷胺。
文档编号A61P25/00GK1634859SQ20041008680
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者李卓荣, 李艳萍, 刘宗英 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所