专利名称：片剂形式的灭活的霍乱弧菌疫苗的制作方法
技术领域：
本发明具有疫苗学领域的应用，特别是一种用于霍乱感染的口服疫苗。
本发明公开了一种新的疫苗配方和它的治疗性的应用。更具体地说，本发明提出了对霍乱孤菌发生反应，能以片剂形式口服的由灭活疫苗配方的组成。
霍乱是一种传染病，它最显著的症状是以急剧和大量地排出液体粪便为特征的急性腹泻。腹泻可以很严重，如果病人没有受到足够的医疗重视，甚至可以在症状开始后5小时之内致死。它经口从被污染的食品或液体获得。到目前，已经报道了7种导致提高的发病率和死亡率指标的传染病。在导致很差的卫生条件的不发达地区或受自然灾害、战争或其它破坏性事件影响区域居住的群体中，感染最常见，具有目的地的并因此而受影响的旅行者也容易受到感染(CDC/NCID.Organización Panamericana de la Salud.Métodos de laboratoriopara el diagnóstico de Vibrio cholerae.EnPrograma especialde publicaciones.Ed.Washington，D.C.，Estados Unidos 1994)。
尽管用抗菌素和盐水合物治疗是有效的，仍然需要全面和协调的医药处理对这种疾病的急剧效应作出反应。另一方面，已经表明该感染诱导与血清中的杀孤菌抗体的存在相关的特异的免疫防护，作为人体保护的指标(Glass，R.I.，Svennerholm，A.M.，Stoll，B.J.，Khan，M.R.，Hossain，K.M.，Huq，M.I.，Holmgren，J.1983.Protectionagainst cholera in breast-fed children by antibodies in breastmilk.N.Engl.J.Med.3081389-1392 and Jer tborn，M.，Svennerholm，A.M.，Holmgren，J.1993.Evaluation of differentimmunization schedules for oral B subunit vaccine in Swedishvolunteers.Vaccine.10130-2)。这已经导致来源于完整的灭活细胞或者来自活减毒细胞的不同种类的霍乱疫苗的开发。由于其短期的活性(3到6个月)和低水平(30到60％)的保护，以及它们导致红斑、局部的疼痛、硬化、发烧和cephalia的高水平的反应性，非肠道使用的来源于用苯酚灭活的完整的细胞的疫苗已经从市场除去(OMS.1991.Reunión sobre la vacuna contra el cólera.Informe final.Washington，D.C.)。
在用胆汁灭活的整个细胞中(胆汁菌苗)发现了一种选择。该口服疫苗提供中等的防护水平，还没有在工业上开发(Svennerholm，A.M.and Holmgren，J.1986.Oral combined B subunit-whole cellcholera vaccine.In J.Holmgren A.Lindberg and R.Mollby(ed).Development of vaccines and drugs against diarrhea.11th NovelConference，Stockholm，1985.Student litteratur，Lund，Sweden.p.33-43)。
已经表明用加热和甲醛灭活的与霍乱菌毒素B亚单位(B-WC)结合的整个细胞在给药后3年提供中等的保护水平(60％)(Holmgren，J.，Svennerholm，A.，M.，Lonroth，I.，Fall-Persson，M.，Markham，B.and Lundback，H.1977.Development of improved choleravaccine based on subunit toxoid.Nature 269602-604)；但是由于需要获得和纯化霍乱毒素的B亚单位，该疫苗的生产十分昂贵和复杂(Tayot，J.L.，Holmgren，J.，Svennerholm，L.，Lindblad，M.，Tardy，M.1981.Receptor-specific large scale purification ofcholera toxin on silica beads derivatized with lyso-GMIgaglioside.Eur.J.Biochem.113249-258)。
上述的选择的一种变体采用通过重组方法获得的霍乱菌毒素的B亚单位(rB-WC)，证明是可靠的，但是在给药后3年仍然提供了仅仅60％的保护水平，并且它包括繁琐的制备过程。该疫苗在两个多层封套中制备，一个含粉末形式的盐混合物，另一个含冻干的霍乱孤菌菌株。当给药时，第一个必须在水中重新悬浮，第二个悬浮在盐溶液和水中；然后必须口服含盐溶液，接着在15分钟后按照同样的方式服用包含菌株的悬浮液(Sánchez，J.L.，Holmgren，J.1989.Recombinant system for overexpression of cholera toxin BSubunit in Vibrio cholerae as basis for vaccine development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86481-485)。
另一种类似于最后一种的最新的疫苗来源于灭活的完整的细胞，用569B菌株(El Tor，Inaba)代替了霍乱弧菌Cairo 50菌株(Classic，Ogawa)。它提供一种给药后直到8到10个月的可接受的水平的保护(66％)。它是一种不同的血清型和生物类型的霍乱孤菌菌株的混合物，在含有悬浮菌株的瓶子中和含有盐混合物的封套中制备(Trach，D.D.，Clemens，J.D.，Ke，N.T.，Thuy，H.T.，Son，N.D.，Canh，D.G.，Hang，P.V.D，Rao，M.R.1997.Field trial of a locally produced，killed，oral cholera vaccine in Vietnam.Lancet.349231-235)。作为上述的疫苗，它的应用要求盐混合物溶于水并且口服，而且包含细胞株的瓶子的内容物在15分钟后给药，导致需要时间以及技术人员的缓慢的和慎重的过程，并且过程更加昂贵。
以CVD103菌株为基础的CVD103 HgR疫苗，为了区分流行株，补充了另外插入菌株中的耐汞基因，该疫苗包括安全的给药方法并在志愿者中实施的试验中导致良好水平的保护，但是它必须高剂量给药以获得实质性的免疫原性反应(OMS.1991.Reunión sobre la vacunacontra el cólera.Informe final.Washington，D.C.and Holmgren，J.，and Svennerholm，A.M.1999.Vaccines against DiarrhealDiseases.In Perlmann，P.and Wigzell，H.[ed].Vaccines.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York.p290-328)。这种菌株的生产需要完全封闭的系统(Cryz，S.J.and Gluck，R.，1997.Large-Scale production of live attenuated bacterial and viralvaccines.In New Generation Vaccine.Second Edition.Ed.Levine，M.M.，Woodrow，G.C.，Kaper，J.B.and Cobon，G.S.Library ofCongress.Cataloguing in Publication Data.New York.P1153-1163)，它按照与上述疫苗相同的方式制备，在给药时间方面表现出同样的困难。
基于638菌株的活减毒疫苗来源于C7258流行株，处理后去除CTXφ毒性噬菌体，在编码血凝素蛋白酶的hap基因中包括疫苗标记celA，证明应用时间是可靠的，并导致充分的免疫应答(Benítez，J.A.，García L.，Silva A.，García，H.，Fando，R.，Cedré，B.，Pérez，A.，Campos，J.，Rodríguez，B.，Pérez，J.L.，Balmaseda，T.，Pérez，O.，Ramírez，M.，Ledbn，T.，Díaz，M.，Bravo，L.and Sierra，G.1999.Preliminary assessment of the safety and immunogenicityof a new CTXφ-negative，haemaglutinin/protease-defective ElTor strain as a cholera vaccine candidate.Infect.Immun.67539-545)。然而，由于制备过程与上述的疫苗类似，它表现出与前面考虑的疫苗相关的所有的困难。
以减毒霍乱弧菌菌株为基础的疫苗利用诸如Peru-3、Bah-3和Bang-3的菌株，尽管提供了免疫原性反应，却被证明具有无法接受的反应原性(Taylor，D.N，Killen，K.P.，Hack，D.C＞，Kenner，J.R.，Coster，T.S.，Beatle，D.T.，Ezzell，J.，Hyman，T.，Tropa，A.，Sjogrem，M.H.，Friedlander，A.，Mekalanos，J.J.，Sadoff，J.C.1994.Development of a live，oral，attenuated vaccine againstEl Tor cholera.J.Infect.Dis.1701518-1523)。
该疫苗以Peru-3菌株为基础，采用了Peru15菌株，具有安全的应用方法并在志愿者中实施的试验中产生了良好的保护水平(Kener，J.R.，Coster，T.S.，Taylor，D.N.，Troffa，A.F.，Barrera-Oro，M.，Hyman，T.，Adams，J.M.，Beattie，D.T.，Killeen，K.P.，Spriggs，D.R.，Mekalanos，J.J.，Sadoff，J.C.1995.Peru-15，animproved and attenuated oral vaccine candidate for Vibriocholerae 01.J.Infect.Dis.721126-1129)。然而还没有进行临床研究，且疫苗表现出与上述疫苗同样的难点。
本发明由新的疫苗配方组成，包括灭活的完整霍乱孤菌细胞、凝集素、润滑剂、包衣物质、填充和崩解物质，用于最后制备为片剂形式的制剂，保持它的不同的组分在稳定条件下，并防止它们互相干扰。
令人惊奇地发现，生产的成品和抗原性以及免疫原性效果与组成配方的活性复合物的灭活细胞所提供的效果是相似的。
本发明提供了一种由属于血清型0139、或血清型01以及典型的ElTor、Ogawa或Inaba bio和血清型的灭活的霍乱弧菌菌株细胞组成的疫苗，采用野生型或减毒株。这里给出的疫苗制剂含有灭活的霍乱弧菌细胞，优选每一片剂有109-1011的灭活细菌。它可以含有凝集素聚烯吡酮、明胶、羧甲基纤维素，其浓度相对于片剂的总质量必须为1-5％；润滑剂羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、胶体二氧化硅和滑石，采用的浓度相对片剂的总质量在0.25-1.5％；包衣物质纤维素乙酰基邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二乙酯纤维素、浓度为10％的硝基纤维素(lacquer)，以及二氧化钛，采用的浓度相对片剂的总质量在1-2％；填充物质乳糖和玉米淀粉，其浓度相对片剂的总质量为65-80％，以及崩解物质croscaramelose钠、玉米淀粉和微晶纤维素，采用的浓度相对片剂的总质量为5-15％。
迄今为止最新技术的疫苗学方法仍没有本发明的片剂配方的先例。应该指出本配方最先在抵抗化学和物理应激的制剂中将合成化合物与生物材料，特别是细胞组合，该技术的应用没有影响它的活性复合物的主要的免疫特性。
本发明的目标将通过下列实施例描述实施例1在对霍乱弧菌的LPS的鉴定中采用的ELISA测试的过程中对该片剂中的赋形剂的可能干扰的研究。
本实施例研究了灭活细胞及其混合物，包括每一不同的赋形剂以及单独的赋形剂溶液。采用灭活的细胞作为阳性对照组。采用的赋形剂是羧甲基淀粉钠、croscaramelose钠、聚烯吡酮、滑石、硬脂酸镁、二氧化钛、胶体二氧化硅、玉米淀粉和乳糖。
ELISA技术由下列步骤组成
1.用溶于PBS的100μL/孔的细胞混合物-赋形剂覆盖聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc，丹麦)，在湿润的容器中4℃孵育过夜。
2.在酶联免疫试验的每一步骤之间用0.05％的吐温20水溶液洗涤平板。
3.用PBS中的1％浓度的150μL/孔脱脂乳封闭平板。在湿润室中在37℃孵育1小时。
4.加入100μL/孔的抗LPS单克隆抗体。
5.加入100μL/孔的从小鼠中提取的抗IgG抗体，与在含0.05％吐温20和1％脱脂奶的PBS中稀释的VI型辣根过氧化物酶缀合(Sig maChemical Co.Saint Louis MO)，在湿润的室中室温孵育2小时。
6.用在含有0.01％的H2O2的0.1M pH值为4.5的柠檬酸盐缓冲液中的浓度为0.4mg/mL的100μL/孔的邻苯二胺溶液(Sigma ChemicalCo.Saint Louis MO)建立反应。
7.施加底物30分钟后采用50μL/孔的2.5M的H2SO4溶液终止反应，在微板读码器(reader)492nm波长处读板。
结果显示，在采用的赋型剂和分析过程的成分之间没有干扰发生，如
图1所示，其中赋型剂与灭活细胞的混合表现出与单独的灭活细胞相似的值，而未混合的赋型剂呈现显著降低的值。
实施例2确定在赋型剂和疫苗活性复合体之间可能的干扰。
采用ELISA技术确定含有灭活霍乱弧菌细胞悬液和采用的不同赋型剂的的混合物的抗原性(如实施例1中所述)，将混合物分为相同的2部分，并将1部分在4℃孵育，另1部分在28℃孵育。在起始时间和孵育30天后进行研究。本实施例中采用的赋型剂是乳糖、淀粉、羧甲基淀粉钠、croscaramelose、聚烯吡酮、滑石、硬脂酸镁和二氧化钛。结果显示，灭活细胞的脂多糖的抗原性不受不同赋型剂的存在的影响。在4℃和28℃进行的实验中ELISA值在30天的孵育期间一直都维持不变(图2)。
实施例3疫苗的抗原性。
通过ELISA抑制实验确定疫苗的抗原性，目的是检测片剂中的霍乱弧菌的脂多糖(LPS)。
采用片剂的溶液，霍乱弧菌的LPS Ogawa、霍乱弧菌的LPS 0139、El Tor和Ogawa菌株的活霍乱孤菌细胞的悬浮液，以及灭活细胞的悬液作为实验样本。
ELISA测试包括下列步骤用溶于磷酸缓冲液(PBS)的100μL/孔的浓度为25μg/mL的霍乱弧菌的LPS Ogawa覆盖聚苯乙烯板(Maxisorp，Nunc，丹麦)，在湿润的室中4℃孵育过夜。
在酶联免疫试验的每一步骤之间用0.05％的吐温20水溶液洗涤平板。
用PBS中的1％浓度的150μL/孔脱脂乳封闭平板，在湿润室中37℃孵育1小时。
加入100μL预先在室温下孵育1小时的溶液中的样本，样本和抗LPS Ogawa单克隆抗体的浓度比例分别为1∶2，溶解于PBS 0.05％Tween20中，终浓度为25ug/ml，在湿润室中室温孵育2小时。
加入100μL/孔的种特异性抗IgG抗体，抗体与在0.05％吐温20和1％脱脂奶的PBS稀释的VI型辣根过氧化物酶(Sigma Chemical Co.Saint Louis MO)缀合。在湿润的室中室温孵育2小时。
用在含有0.01％的H2O2的0.1M pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中的0.4mg/mL浓度的100μL/孔的邻苯二胺溶液(Sigma Chemical Co.SaintLouis)建立反应。
30分钟后终止反应。加入底物后用50μL/孔的2.5M的H2SO4溶液，在Titerkek Multiskan Plus micro平板读码器(FlowLaboratories，USA)中492nm波长处读板。
结果显示了采用片剂悬浮液时高水平的抑制，与从采用了活细胞、灭活细胞和LPS Ogawa中获得的值相似。在涉及LPS 0139的情形下没有观察到抑制(图3)。这证明灭活细胞的抗原活性在最终的片剂配方中仍然不受影响。
实施例4疫苗的免疫原性通过用待测样本的十二指肠内接种兔研究疫苗的免疫原性。采用ELISA和杀弧菌技术评估血清抗体的动力学。利用含有片剂配方的悬浮液，以及E1 Tor和Ogawa菌株的霍乱弧菌灭活细胞作为待检测样本。
进行腹壁部分切除术暴露十二指肠和用5mL的重悬浮片剂接种十二指肠内腔，采用疫苗菌株的灭活培养物或盐溶液。采用ELISA和杀弧菌技术评估抗体的血清动力学。
确定IgG抗脂多糖抗体的动力学的ELISA技术1.用25μg/mL的纯LPS覆盖Nunc或Maxisorp 96孔的聚苯乙烯板，在4℃温育过夜或37℃孵育2小时。
2.用浓度为0.05％的吐温20水溶液洗涤3次。
3.用150μL/孔的PBS中的2％浓度的脱脂乳37℃封闭1小时。
4.洗涤3次。
5.制备PBS吐温0.05％中的待测血清的连续的溶液，室温下孵育2小时。
6.同前一样洗涤3次。
7.加入用1％ PBS-T中的牛奶稀释的缀合抗IgG-HRP，室温孵育1小时。
8.洗涤6次。
9.用在pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中的1mg/mL浓度的邻苯二胺溶液和30％浓度的H2O2建立反应。
10.在492nm波长处阅读吸光度。
检测杀菌抗体的杀弧菌技术采用平底的消毒平板。
1.在首先的孔中加入50μL的待测血清，在其余的孔中加入25μL的盐水溶液。
2.制备系列溶液，并移出最后的25μL。
3.加入25μL的补体细菌(complement-bacteria)混合物(每板2.5ml)，并在37℃孵育1小时。
4.加入BHI培养基(每100ml的培养基采用125μL的溴化甲醇紫(Bromcresol purple)和10ml的葡萄糖，必须从培养基中除去10ml的葡萄糖)。
5.将平板人工均质化，并在37℃孵育3小时。
6.滴度定义为能够阻止细菌生长的血清的最大的稀释度，通过培养基中颜色改变的缺乏而确定。
制备补体-细菌的混合物1.将保存的霍乱弧菌菌株铺于2楔状板或平板的BHI琼脂中，并在37℃的温度下与未铺菌的板一同孵育18到24小时的任意时间。
2.取平板中分离的菌落，或取其中的一些在楔状板中加热的，置于预先加热的楔状板中，将其在37℃孵育4小时。
3.用pH值为7的消毒盐溶液洗涤楔状板中发现的生长物，并调节洗涤液的D.O＝0.9-0.95。
4.将调节的灭活细胞稀释为1∶10的比例。
5.制备补体-细菌混合物，其中-将补体(豚鼠或人血清，不含杀孤菌抗体)稀释为与冷消毒盐溶液1∶5的比例。
-混合等体积的灭活细胞和稀释的补体。
结果显示采用ELISA技术评估的片剂制剂和灭活细胞(图4A)以及杀弧菌抗体(图4B)的诱导兔抗脂多糖抗体的免疫原性能力没有差别。实施例1、2和3显示本发明的片剂制剂在模型动物中的抗原性和免疫原性与加入制剂之前的灭活细胞本身相同，这在最终的片剂制剂中抗原的存在和它的诱导杀弧菌抗体的能力中都显示出来。
本技术方案的优点本技术方案优于以前的疫苗配方，因为它是高度免疫原性的产品(在其诱导抗脂多糖和杀弧菌抗体的能力方面)，可以容易地施用，不涉及活的、通常操作的疫苗的潜在危险性，也不涉及先前的灭活疫苗产品施用中的困难。
附图的简要说明图1.片剂赋形剂的可能的干扰的研究，采用ELISA技术评估霍乱弧菌的LPS。从C01到C09赋形剂与灭活细胞的混合物。C10到C18单独的赋形剂。C19单独的灭活细胞。
每个样本中采用的赋形剂C01和C10淀粉；C02和C11羧甲基淀粉钠；C03和C12croscaramelose；C04和C13聚烯吡酮；C05和C14滑石；C06和C15硬脂酸镁；C07和C16二氧化钛；C08和C17二氧化硅；C09和C18淀粉1500；C19灭活细胞。
图2.确定赋形剂对疫苗的活性复合物的抗原性的可能的影响。该图代表孵育30天的样本的ELISA检测的平均结果数值的相对于在起始时间检测的同一样本的ELISA检测的结果值的百分比。在4℃孵育(图2A)以及在26-28℃的温度孵育(图2B)。本实施例中评估的赋形剂为1.-乳糖、2.-淀粉、3.-羧甲基淀粉钠、4.-Croscaramelose、5.-聚烯吡酮、6.-滑石、7.-硬脂酸镁、8.-二氧化钛、9.-灭活细胞。
图3.通过ELISA单克隆抗体抗-LPS抑制试验确定最终的片剂制剂的霍乱弧菌脂多糖(LPS)的抗原性。
图4.用灭活细胞或疫苗的片剂制剂接种的兔的血清滴度。通过ELISA检测霍乱弧菌01、Ogawa的抗脂多糖滴度，列于图4A。杀弧菌滴度列于图4B。
权利要求
1.用于霍乱的疫苗组合物，由下列成分组成a.霍乱弧菌(Vibrio cholera)灭活细胞b.凝集素c.润滑剂d.包衣物质e.填充物质f.崩解物质。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，灭活细胞由霍乱弧菌减毒菌株组成。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，灭活细胞属于血清型0139。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，灭活细胞属于血清型01。
5.如权利要求4所述的疫苗组合物，具有El Tor或Classic型细胞。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物，灭活细胞属于Ogawa或Inaba血清型。
7.如权利要求2所述的疫苗组合物，灭活细胞由由霍乱弧菌的野生菌株组成。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，灭活细胞属于血清型0139。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，灭活细胞属于血清型01。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，具有El Tor或Classic生物型细胞。
11.如权利要求10所述的疫苗组合物，具有Ogawa或Inaba血清型细胞。
12. 如权利要求1到11所述的疫苗组合物，每一片含有5×109-1011的细胞。
13.如权利要求1所述的疫苗组合物，以聚烯吡酮、明胶或羧甲基纤维素作为凝集素。
14.如权利要求13所述的疫苗组合物，其中凝集素的浓度为片剂总质量的1-5％。
15.如权利要求1所述的疫苗组合物，以羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、二氧化硅或滑石作为润滑剂。
16.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中润滑剂的浓度为片剂总质量的0.25-1.5％。
17.如权利要求1所述的疫苗组合物，以纤维素乙酰基邻苯二甲酸酯(acetophtalate)、邻苯二甲酸二乙酯纤维素、10％硝基纤维素(lacquer)或二氧化钛作为包衣物质。
18.权利要求17所述的疫苗组合物，其中包衣物质的浓度为片剂总质量的1-2％。
19.权利要求1所述的疫苗组合物，以乳糖或玉米淀粉作为填充物质。
20.权利要求19所述的疫苗组合物，其中填充物质的浓度为片剂总质量的65-80％。
21.权利要求1所述的疫苗组合物，以croscaramelose钠、玉米淀粉和微晶纤维素作为崩解物质。
22.权利要求21所述的疫苗组合物，其中崩解物质的浓度为片剂总质量的1-6％。
全文摘要
本发明涉及疫苗领域，特别是口服霍乱疫苗。本发明的目的是制备等剂形成的灭活的完整细胞霍乱弧菌疫苗。本发明描述了该疫苗制剂。
文档编号A61K9/28GK1791426SQ200480013503
公开日2006年6月21日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月20日
发明者A·塔拉韦拉科罗内尔, G·阿内洛佩斯, J·L·卡斯塔尼奥费尔南德斯, E·乌里巴里埃尔南德斯, Y·皮诺纳瓦罗, H·M·加西亚桑谢斯, T·巴尔马塞达佩雷斯, B·塞德雷马雷罗, L·加西亚伊米亚, J·L·佩雷基尼奥伊, C·托雷斯苏亚雷斯 申请人:血清疫苗研究生产中心芬雷学院