Cns氯化物调节及其用途的制作方法

专利名称：Cns氯化物调节及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中枢神经系统(CNS)神经细胞中的阴离子水平调节，尤其是涉及CNS细胞内氯化物水平的调节及其在治疗、预防、诊断和预测疼痛中的用途。
背景技术：
针对疼痛治疗的新的改良方法和活性剂的需求是目前医学上的一个重要的焦点。急性疼痛，例如，与受伤或疾病有关的疼痛，可能是严重的且对患者的康复有关键的影响。而更多的关注是慢性疼痛，它影响着相当大比例的人群，不仅引起显著的不适，还导致了自卑、沮丧、愤怒，还干扰了或完全妨碍了患者一般的日常活动。
尽管在此领域内已进行了许多研究，但对伤害感受觉中涉及的许多机制和途径仍然了解甚微。正如在多种刺激的感觉的情况中，痛觉与神经元兴奋性的改变相关。
在某些情况中，离子协同运输被认为在某些刺激的处理中发挥了作用。例如，Howard等(28)已证实了通过定向缺失编码KCC3输出子(exporter)的Slcl2a6基因而产生的小鼠展示出胼胝体发育不全，包括运动缺陷、外周神经病以及感觉运动门控缺陷。据Sung等(29)报道，与野生型和杂合的(NKCC1+/-)小鼠相比，编码NKCC1协同转运蛋白的Slcl2a2基因被破坏的小鼠对热刺激的敏感性大大降低。
目前仍需要更好的解释痛觉中所涉及的机制，从而提供有关这方面治疗性干预的新方法。
发明概述本发明涉及疼痛以及治疗、预防、诊断和预测所述疼痛的方法。本发明还涉及与神经疼痛和CNS功能异常相关的疼痛。本发明另外还涉及降低中枢神经系统(CNS)神经细胞细胞内氯化物水平的方法。
一方面，本发明提供了在受试者中治疗或预防疼痛的方法，该方法包括降低该受试者中枢神经系统(CNS)神经细胞的细胞内氯化物水平。在一个实施方案中，所述方法包括调节CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达，从而降低氯化物水平。在另一实施方案中，氯化物转运蛋白是KCC2，所述方法包括提高KCC2的活性或表达。在又一实施方案中，CNS神经细胞是脊髓神经细胞。在另一实施方案中，疼痛的信号源于外周神经系统(PNS)细胞或CNS神经细胞跨突触的感觉纤维。在另一实施方案中，疼痛是神经性疼痛(neuropathic pain)，而在进一步的实施方案中，所述神经性疼痛是与神经或神经束损伤相关的疼痛或选自躯体和内脏疼痛。在另一实施方案中，疼痛选自慢性炎症疼痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛(fibromyalgia)、背痛、癌症相关疼痛、消化类疾病相关性疼痛、克罗恩氏病相关疼痛、自身免疫病相关疼痛、内分泌病相关疼痛、糖尿病性神经病相关疼痛、幻肢疼痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关疼痛、I型和II型复合性区域疼痛综合症(complex regional pain syndrome type I and II)、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛以及周期性急性痛。
在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用能降低CNS细胞内氯化物水平的化合物。在另一实施方案中，所述化合物能调节CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，在再一个实施方案中，所述化合物能提高KCC2的活性或表达。在另一实施方案中，所述化合物是TrkB的抑制剂，诸如K-252a或抗TrkB抗体。在另一实施方案中，所述化合物是依赖AMP的激酶(PKA)的抑制物(如H-89)。在另一实施方案中，所述化合物是钙调蛋白依赖性激酶(CAM激酶)的抑制物，更具体而言，是KN-93。在一个实施方案中，KCC2包含与选自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供了用于治疗或预防受试者疼痛的组合物，所述组合物包括能降低CNS神经细胞内氯化物水平的化合物和可药用载体。在一个实施方案中，所述化合物能调节CNS神经细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，更进一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表达。
本发明的另一方面还提供了商业包装，其包括本文所述组合物及其用于治疗或预防疼痛的用法说明书。
本发明的另一方面提供了商业包装，其含有能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物及其用于治疗或预防疼痛的用法说明书。在一个实施方案中，所述化合物能调节所述CNS神经细胞中的氯化物转运蛋白的活性或表达。在另一实施方案中，该氯化物转运蛋白是KCC2，且更进一步的是，该化合物能提高所述KCC2的活性或表达。
本发明的另一方面提供了本文所述组合物在治疗或预防疼痛以及/或者制备用于治疗或预防疼痛的药物中的用途。
本发明的又一方面提供了将能降低CNS神经细胞细胞内氯化物水平的化合物用于治疗或预防疼痛以及/或者用于制备治疗或预防疼痛的药物的用途。在一个实施方案中，所述化合物能调节所述CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，且更进一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表达。在另一实施方案中，所述化合物是TrkB的抑制剂，且更进一步的是，它选自K-252a或抗TrkB抗体。在另一实施方案中，所述化合物是依赖cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更具体而言，它是H-89。在另一实施方案中，所述化合物是钙调蛋白依赖性激酶的抑制物，更具体而言，它是KN-93。
本发明的另一方面提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括将受试化合物与CNS来源的细胞接触；测定在受试化合物存在的条件下细胞内氯化物水平是否下降；其中所述下降表明受试化合物可用于治疗或预防疼痛。
本发明的另一方面提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括将受试化合物与表达氯化物转运蛋白的CNS来源的细胞接触；测定在受试化合物存在的条件下该氯化物转运蛋白的活性或表达是否受到如此调节使得细胞内氯化物水平下降；其中所述调节表明受试化合物可用于治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，氯化物转运蛋白是KCC2，此外，该方法包括确定在所述受试化合物存在的条件下所述KCC2的表达或活性是否提高以及该调节是增强。在另一实施方案中，通过测量以下参数来确定KCC2的活性钾转运、氯化物转运、细胞内氯化物水平和阴离子逆转电位。在另一实施方案中，疼痛包括慢性炎症疼痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关疼痛、消化系统疾病相关疼痛、克罗恩氏病相关疼痛、自身免疫病相关疼痛、内分泌病相关疼痛、糖尿病性神经病相关疼痛、幻肢疼痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关疼痛、I型和II型复合性区域疼痛综合症、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛以及周期性急性痛。
本发明的另一方面提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括将受试化合物与CNS来源的细胞接触，该细胞包含了具有通常与氯化物转运蛋白基因相关的转录调节元件的第一种核酸，它与含有能编码报道蛋白的报道基因的第二种核酸有效连接；确定在受试化合物存在的条件下报道基因是否表达或报道蛋白的活性是否被调节；其中报道基因表达或报道蛋白活性的调节表明受试化合物可用于治疗或预防疼痛。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，且在受试化合物存在的条件下所述报道基因表达或报道蛋白活性提高。
本发明的一方面提供了用于减轻受试者中伤害感受的方法，该方法包括减少受试者CNS神经细胞内的细胞内氯化物。在一个实施方案中，该方法包括调节CNS神经细胞内的氯化物转运蛋白活性或表达。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，此外，该方法包括提高KCC2的活性或表达。在另一实施方案中，该方法进一步包括用能增加KCC2活性或表达的化合物接触CNS神经细胞。在另一实施方案中，所述化合物是TrkB的抑制物，而且更进一步的是，它选自K-252a和抗-TrkB抗体。在另一实施方案中，该化合物是依赖cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更进一步的说，是H-89。在另一实施方案中，该化合物是钙调蛋白依赖性激酶抑制物，更进一步的说，是KN-93。在另一实施方案中，KCC2包含与选自SEQ IDNO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供了用于在经历疼痛的受试者中诊断或预测与CNS功能异常相关的疼痛的方法，该方法包括确定相对于相应的对照氯化物水平而言，被测试的CNS细胞内氯化物水平是否增加，其中增加表明该受试者正在经历与CNS功能异常相关的疼痛。在一个实施方案中，该方法进一步包括确定相对于对照转运蛋白活性或表达而言，CNS氯化物转运蛋白的活性或表达是否被调节。在另一实施方案中，所述氯化物转运蛋白是KCC2，而且，该方法包括确定KCC2的活性或表达相对于对照活性或表达而言是否降低了。在另一实施方案中，对照的细胞内氯化物水平选自已确定的标准、在较早时间测定的该受试者中相应细胞内氯化物水平、在该受试者伤害感受较轻或基本上无疼痛时测定的相应细胞内氯化物水平以及在伤害感受较轻或基本上无疼痛的对照受试者中测定的相应细胞内氯化物水平。在另一实施方案中，对照的活性或表达选自KCC2活性或表达的已确定的标准、在较早时间测定的该受试者中相应的KCC2活性或表达水平、当该受试者伤害感受较轻或基本上无疼痛时测定的相应KCC2活性或表达水平以及在伤害感受较轻或基本上无疼痛的对照受试者中测定的相应KCC2活性或表达水平。在另一实施方案中，通过测量以下参数确定KCC2的活性钾转运、氯化物转运、细胞内氯化物水平和阴离子逆转电位。在另一实施方案中，通过对受试者施用指示氯化物水平的指示剂化合物使其与受试者的CNS神经细胞接触并评估与该指示剂化合物相关的体内信号来确定细胞内的氯化物水平。在另一实施方案中，与CNS功能异常相关的疼痛是神经性疼痛。在另一实施方案中，指示剂化合物是放射性核素，更具体而言，可选自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。在另一实施方案中，通过成像技术评估体内信号。在另一实施方案中，所述体内信号是指示剂化合物的滞留指标。在另一实施方案中，所述成像技术选自单光子发射计算机层析X射线照相术、正电子发射层析X射线照相术和磁共振成像。在另一实施方案中，指示剂化合物指示KCC2表达，更具体而言，指示剂化合物是针对KCC2的抗体。
本发明再一方面提供了处理受试者中与CNS功能异常相关的疼痛的方法，该方法包括依照本文所说方法诊断或预测受试者中与CNS功能异常相关的疼痛并降低受试者CNS细胞中的细胞内氯化物水平。
在一个实施方案中，上述受试者是哺乳动物，在更进一步的实施方案中，上述受试者是人。
附图简述

图1外周神经损伤(PNI)诱导同侧表面背角(SDH)中片层I(LI)神经元内阴离子剧降。a)坐骨神经的慢性收缩损伤(n＝23)，但不是假手术(n＝11)，造成对大鼠后爪机械刺激的伤害性消除的阈值50％显著下降(p＜0.01)。b)从首次用于实验的(Δ)和PNI(o)大鼠LI神经元记录的E阴离子范围。实心符号＝平均E阴离子±SEM。c)显示出E阴离子对PNI响应偏移的所有类型LI神经元(即具有时相性的(P)、单峰(SS)和强直性(T)峰的特性[19])。比例尺(scale bar)是50mV(y)、150ms(x)。d)响应各种Vm下所应用的GABA的首次用于实验的(▲)和PNI(●)大鼠LI神经元中测量到的平均峰电流。水平标准误差线代表记录移液器偏移量时神经元之间的差异。插图来自某一神经元的典型轨迹。比例尺是0.6nA(y)、1.0s(x)。
图2在L1神经元中经PNI后从仅GlyR(受体)转换成混合的GABAAR-和GlyR-介导的微型突触后电流(mPSCs)。a)来自首次用于实验的大鼠LI神经元的向外(左边)和向内(右边)微型突触后事件原始轨迹。所有向外的mPSCs均被马钱子碱所消除，而所有向内的mPSCs(在马钱子碱和荷包牡丹碱的存在下记录)均被GluR拮抗物CNQX消除。HP-保持电压。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。b)记录自PNI大鼠LI神经元的向内(左)和向外(右)微型突触后活动的原始轨迹。与在首次用于实验的大鼠中不同，同时需要有马钱子碱和荷包牡丹碱才能阻止所有向外的mPSCs。向内的mPSCs仍然对CNQX非常敏感。比例尺是20pA(y)、300ms(x)。c)左图-记录自PNI大鼠LI神经元的叠加的单个mPSCs。仅GlyR和仅GABAAR以及混合GABAAR/Glyr-介导的类型可通过它们对马钱子碱和/或荷包牡丹碱的灵敏度而清楚地鉴别。右图-记录自PNI大鼠LI神经元的大于100的GlyR-和GABAAR-介导mPSCs的平均值。比例尺是15pA(y)，20ms(x)。d)从首次用于实验的(N；对于GlyR而言n＝10；对于GluR而言n＝5)和PNI(P；对于GlyR而言n＝9；对于GluR而言n＝8)LI神经元记录的mPSCs平均峰电导。P(B)显示了0mV时在荷包牡丹碱存在条件下记录的PNI大鼠神经元(n＝12)中GlyR介导的mPSC。e)首次用于实验的大鼠(n＝6)中GlyR介导的mPSC携带的净电荷，PNI大鼠[PNI(Bic)；n＝4]中用荷包牡丹碱分离的GlyR介导的mPSC所携带的净电荷，以及PNI大鼠LI神经元(PNI；n＝12)中混合GABAAR/GlyR-介导mPSCs所携带的净电荷。f)描述首次用于实验的LI神经元中仅GlyR mPSC事件间间隔(I.E.I.)和PNI大鼠LI神经元[PNI(Bic)]中荷包牡丹碱分离的仅GlyR mPSC事件间间隔之间差异的累积概率图，均在E阴离子＝0mV的条件下记录。GABAAR介导的mPSCs(PNI)的加入补偿了仅GlyR mPSC频率的减少。插图-PNI对GluR介导的mPSC的频率无影响。
图3与PNI同侧的SDH片层I神经元中PNI-诱导的KCC2下调导致了GlyR/GABAAR-介导的兴奋。a)短暂的GABA应用(每次加压30ms)引起来自PNI大鼠fura-2-am(Ca2+指示剂)负荷切片的LI神经元中[Ca2+]i的河豚毒素(TTX)和荷包牡丹碱敏感性提高。b)应用KC1但不应用GABA(每次最长施压250ms)不会引起首次用于实验的大鼠LI神经元内[Ca2+]i的改变。在存在KCC2特异拮抗剂DIOA的情况下，GABA的应用不会引起首次用于实验的大鼠LI神经元内[Ca2+]i的升高。比例尺为0.02(y)、10s(x)。c)展示出GABA-引起的[Ca2+]i增加的LI神经元的百分数。该比例该PNI大鼠中(x2矫正值＝3.91)以及首次用于实验的大鼠中存在DIOA情况下(x2矫正值＝4.43)显著较高。d)证实外源GABA能在薄层I神经元内反复引起动作电位的代表性轨迹。上方的比例尺是5mV(y)，200ms(x)。下方的比例尺是30mV(y)，4s(x)。插图-响应去极化脉冲证实其为单峰值神经元(19)。比例尺为20mV(y)，300ms(x)。e)类似地，主要刺激(focal stimuli)(在存在谷氨酸盐受体阻断剂的情况下)引起荷包牡丹碱敏感性单突触去极化突触后电位，其会引起PNI大鼠片层I神经元中动作电位。比例尺是5mV(y)，250ms(x)。插图-响应去极化脉冲证实其为相位神经元(19)。比例尺为20mV(y)，300ms(x)。f)左图-免疫印迹显示KCC2水平在腰部SDH平躺的PNI位点同侧(Ipsi)但不是对侧(Con)有所下降。右图-从如左图(参照Con归一化lpsi)的免疫印迹(n＝4)测量的KCC2蛋白(对肌动蛋白归一化)的平均强度(±SEM)。
图4选择性封闭或击倒(knock down)SDH中的突触后KCC2输出子显著降低了伤害感受阈值。a)鞘内注射DIOA(n＝5)或载体(n＝3)后触觉伤害感受消退阈值作为时间的函数。b)鞘内注射DIOA(n＝3)或载体(n＝3)后热伤害感受消退潜伏期作为时间的函数。消退时，大鼠还经常舔它们的爪子，表明有伤害感受。c)在DIOA存在或缺失条件下用CsCl(氯化铯)移液器(用于在0mV时夹住E阴离子)记录的LI神经元内自发的mPSC。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。d)累积概率图(n＝4个神经元X50mPSCs)，其证实DIOA既不会影响突触事件峰电导(p＞0.5)，也不会影响GABA所引起的反应(n＝5；p＞0.5，插图)并因而不作用于GlyR也不作用于GABAAR。G峰＝峰电导。e)与接受合成的寡脱氧核苷酸的大鼠(n＝7)相比，局部腰椎(鞘内)施用KCC2反义寡脱氧核苷酸(各12小时)导致首次用于实验的大鼠(n＝8)中触觉伤害感受消退阈值的显著降低。插图，经反义(AS，12小时或36小时)或合成的(S，36小时)寡脱氧核苷酸处理后脊髓KCC2蛋白质水平(用免疫印迹测量)下降。f)与SDH相比，在首次用于实验的大鼠背根神经节(DRG)中KCC2免疫反应性缺乏。g)电子显微镜照片显示在SDH树突(D)而不在突触小结(B)中KCC2的选择性表达(定量细节参阅图6)。箭头指向突触。比例尺为0.2μm。
图5体内突触状况的计算机模拟证实了片层I神经元的感受性以E阴离子偏移的函数发生。a)左图-利用模型神经元(参阅实施例)进行的计算机模拟论证GlyR-和GABAAR介导的PSC[PNI(GlyR+GABAAR)]的PNI诱导的改变怎样以GluR介导的PSC频率的函数影响LI神经元输出发放频率的。此外还显示了在只考虑GlyR-介导的[PNI(仅GlyR)]或GABAAR-介导的[PNI(仅GABAAR)]突触事件的影响时PNI后LI神经元中的结果。右图-显示了与左图相同的数据，按照发放频率比率表达，计算为以特定数据集除以无抑制数据集(即，数据集的发放频率等价于无抑制)。尽管正常超极化GlyR介导的PSCs(在首次用于实验的大鼠中平均E阴离子＝-72.8mV)对输出发放频率(fout)具有净抑制作用，但是去极化GlyR-介导的PSCs(在PNI大鼠中平均E阴离子＝-49.0mV)则与无抑制作用的预期结果相比fout增加，证明了净兴奋作用。由于GABAAR-介导的PSC携带电荷增加而掺入GABAAR组分时，此刺激作用更占优势。b)左图-不同E阴离子值(超出我们研究中所观察的范围)对PNI后LI神经元发放频率的影响。右图-以发放频率比率表示的与左图同样的数据(如上)。
图6KCC2输出子的表达局限于背角神经元而非感觉纤维。尽管KCC2水平低于通过免疫印迹从DRG检测的水平(图4f)，但我们证实了KCC2是否会优先从细胞体穿梭至初级神经末端的中央末端。a)电镜照片显示了在背角片层I的树突(D)上存在KCC2。此外还显示了片层I神经元胞体(S)上的膜界定免疫金染色(箭头)。相比，在所检测的任一随机选择的突触图(n＝171)中均未观察到KCC2免疫染色。b)在明确相应于初级神经末端的中央末端(A-和C-纤维[34，35])的片层I和II(I类CI，左图；II类CII，右图；箭头指示了兴奋突触；D树突)中突触神经纤维球的中心小结(n＝42个随机选定的中心小结)内也缺乏KCC2免疫反应性。比例尺a2μm；b0.5μm(左图)，0.2μm(右图)。
图7从首次用于实验的和PNI大鼠的片层I神经元记录的多种处理对阴离子(碳酸氢盐和氯化物)逆转电位(E阴离子)的影响。
图8鞘内施用受体酪氨酸激酶抑制剂K-252a(6nM)导致触觉伤害感受消退阈值的提高。
图9人KCC2的DNA(SEQ ID NO1)和多肽(SEQ ID NO2)序列。
图10小鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO3)和(SEQ ID NO4)序列。
图11大鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO5)和多肽(SEQ ID NO6)序列。
图12从采集自灌注了BDNF、NGF或常用的人造脑脊髓液的首次用于实验的大鼠的切片中从片层I神经元测量的阴离子(氯化物和碳酸氢盐)逆转电位(E阴离子)的比较(ACSF；图中的“对照”)。PNI-外周神经损伤。
图13含片层I神经元的切片中测量的E阴离子比较，所述神经元采集自通过水浴应用(bath application)用针对TrkB(P/TrkBIgG)、H-89(P/H89)、K-252a(P/K252a)和KN-93(P/KN93)的抗体处理的PNI大鼠。PNI-外周神经损伤。
图14用转导BDNF(■)的腺病毒处理的大鼠和用转导绿色荧光蛋白(○)的腺病毒处理的大鼠的触觉刺激的伤害感受阈值之间的比较。
图15用人重组NGF(10μg/天x×天)(■)和用盐水载体(○)处理的大鼠的触觉刺激的伤害感受阈值之间的比较。
图16用中和性抗-TrkB抗体(抗-TrkB-IgG 12μg/2hrs×3)(■)处理的大鼠和只用载体处理的大鼠(○)的触觉刺激的伤害感受阈值之间的比较。
图17用PKA抑制剂H-89(380nmol)处理的大鼠(■)和只用载体处理的大鼠(○)的机械刺激的伤害感受阈值之间的比较。
发明详述本文所述是外周神经损伤后去抑制的新机制。它涉及表面背角(SDH)片层(lamina)I神经元中阴离子体内稳态的跨突触破坏，这是主要的脊髓伤害感受输出途径之一(7)。此处显示了由此产生的跨膜阴离子梯度变化通常导致抑制性阴离子突触电流兴奋，基本上升高了片层I神经元的净兴奋性。正如此处所显示的，外周神经损伤是通过信号跨突触传递导致中枢神经系统(CNS)神经元中细胞内氯化物水平升高而被感知。此外，此处所述研究证实了降低CNS神经氯化物水平可逆转此现象，正如通过完整大鼠中脊髓KCC2输出子的局部阻断或击倒显著降低了伤害感受阈值所显示的，证明已报道过的片层I神经元中阴离子体内稳态的破坏足以引起神经性疼痛。
因此，本文描述的实验通过研究外周神经损伤后的下游事件研究了伤害感受觉的机制。同样的，本文还证明了所述事件是跨突触传递的，例如，通过外周神经系统(PNS细胞或感觉纤维)传递至中枢神经系统(CNS)，在一个实施方案中，传递至脊髓神经元。此处进一步的研究证明了伤害感受信号的传递和疼痛的感觉最终受到CNS组织中细胞内氯化物水平调节的影响(例如，受诸如氯化钾协同转运蛋白KCC2的氯化物转运蛋白调节)。KCC2(参阅综述(37))是已在大鼠、小鼠和人中鉴定的氯化钾协同转运蛋白(对于人KCC可参阅2003年2月6日公布的Mount等人的美国专利申请序号20030027983)。小鼠中KCC2基因的纯合和杂合破坏的研究揭示癫痫发作表型，提示KCC2在癫痫症中的可能作用(38)。KCC2在CNS功能中的准确作用尚未完全了解。
申请人在此证明了CNS细胞或组织中细胞内氯化物水平(如，根据诸如KCC2等氯化物转运蛋白的活性/表达)与伤害感受觉之间的相关性。正如以下实施例中所证明的，外周神经损伤(PNI)导致了CNS神经元(例如，脊髓，例如表面背角(SDH)片层I(L1)神经元)的兴奋过度或敏化。这样的兴奋过度是跨突触发生的(即，在受损外周神经元的下游)，这是在本文申请人的研究之前未描述的现象。这样的兴奋过度导致伤害感受阈值的降低。
正如此处所显示的，上文提及的兴奋过度与SDH中细胞内氯化物水平的提高相关(例如，氯化物转运蛋白[诸如KCC2]的调节[例如，减少])。在这点上KCC2的作用通过将KCC2阻断剂DIOA或KCC2反义寡核苷酸施用于脊髓组织发现二者均导致疼痛灵敏度阈值迅速降低来证实。因此，KCC2活性和/或表达的降低，如果导致了CNS神经元氯化物水平提高，就可能导致疼痛灵敏度阈值的降低，而且，相反的，KCC2活性和/或表达的增加或诱导，如果导致CNS神经元氯化物减少，就可能导致疼痛灵敏度阈值提高，从而起到了预防和治疗疼痛的作用。另一方面，据报道，在某些病理生理条件下，例如，当[K+]o升高时，KCC2可能在神经元中积聚Cl-，从而提高神经元的兴奋性(42)。在这样的情况下，可预想KCC2对CNS神经元氯化物具有相反作用，从而导致CNS神经元氯化物的增加并又降低了伤害感受阈值并提高了疼痛的敏感性。同样的，KCC2的活性和/或表达的调节可能取决于氯化物离子流动的方向性，促进或减轻疼痛感受。
因此，第一方面，本发明涉及治疗疼痛的方法和材料，所述方法和材料基于CNS细胞内氯化物水平的调节以及氯化物转运蛋白(例如KCC2氯化钾协同转运蛋白)活性和/或表达的进一步调节。用于此处时，“氯化物转运蛋白”被定义为细胞膜结合的多肽/蛋白质或它们的复合体，所述转运蛋白能实现氯化物阴离子穿过细胞膜。“输出(输出子)”指从细胞内向细胞外的净穿过，“输入(输入子)”指从细胞外向细胞内的净穿过。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过降低例如CNS神经细胞等细胞的细胞内氯化物水平来治疗疼痛的方法。在另一实施方案中，氯化物转运蛋白(例如，KCC2)的调节剂可用于降低细胞内的氯化物水平。在一个实施方案中，本发明涉及以全身或局部应用降低CNS神经细胞中氯化物细胞内水平的化合物或药物作为减轻疼痛的方法。为了达到此效果，上述化合物或药物可调节CNS神经元中氯化物转运蛋白(如，KCC2协同转运蛋白)的功能或表达。在另一实施方案中，所述化合物或药物可增加氯化物转运蛋白或KCC2的表达或活性。
在一个实施方案中，其中细胞内氯化物水平正被调节的CNS神经细胞可定位于表面背角或脊髓。此外，所述细胞还可是外围神经细胞或感觉纤维跨突触的，疼痛信号来源于所述外围神经细胞或感觉纤维。
在一个实施方案中，本发明还涉及急性和慢性疼痛的治疗，更具体而言涉及神经性疼痛的治疗。“神经性疼痛”(neuropathic pain)用于此处时指与神经损伤(例如，在神经挤压、横断或压缩后或疾病导致的神经衰退后)相关的慢性疼痛。在一个实施方案中，神经性疼痛是与神经或管道损伤相关的。在另一实施方案中，神经性疼痛是与内脏和/或躯体疼痛相关的。本发明还涉及降低CNS神经元氯化物的水平(例如，通过调节氯化物转运蛋白[诸如KCC2]活性和/或表达)以减轻伤害感受。“伤害感受”用于此处指疼痛的感觉成分。疼痛可能是多种刺激的结果，所述刺激包括但不局限于，压力、损伤、热刺激或化学(例如，离子的)刺激。在实施方案中，所述疼痛可能与许多疾病相关，诸如慢性炎症疼痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关疼痛、消化系统疾病相关疼痛、克罗恩氏病相关疼痛、自身免疫病相关疼痛、内分泌病相关疼痛、糖尿病性神经病相关疼痛、幻肢疼痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关疼痛、I型和II型复合性区域疼痛综合症、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛和/或周期性急性痛。本发明还涉及用于评估与CNS功能异常相关性疼痛的诊断和预测方法。在一个实施方案中，所述诊断/预测可在本文所述治疗方法之前或在治疗方案期间进行，以便进一步表征疼痛的特性或其发展，从而提供信息，其可用于，例如，根据从此类诊断/预测得到的结果选择此类疼痛的治疗方案。用于此处时，“与CNS功能异常相关的疼痛”涉及CNS组织中离子(例如，阴离子)体内稳态改变所引起的伤害感受。在一个实施方案中，所述阴离子是氯离子。在另一实施方案中，所述改变是CNS细胞中细胞内氯化物水平的提高。在另一实施方案中，当受试者经受CNS功能异常相关性疼痛时，氯化物转运蛋白的活性或表达可被调节(例如，KCC2活性或表达可被调节[例如，下降])。
“KCC2”用于此处指表达于神经元的特定类型氯化钾协同转运蛋白。在实施方案中，KCC2包含SEQ ID NOs2(人KCC2；参阅图9)、4(小鼠KCC2；参阅图10)或6(大鼠KCC2；还参阅图11)的多肽的序列、它们的片段或基本上与它们相同的序列。在另一实施方案中，KCC2由能编码SEQ ID NO2、4或6的多肽或其片段的核酸序列或与它们基本上相同的序列或根据杂交标准相关的序列编码(见下文)。在另一实施方案中，此类核酸序列包含SEQ ID NO1(人KCC2DNA；参阅图9)、3(小鼠KCC2DNA；参阅图10)或5(大鼠KCC2DNA；参阅图11)、其片段或基本上与其相同的序列或根据杂交标准相关的序列(见下文)。
“氯化物转运(蛋白)活性”用于此处指通过细胞膜转运氯化物。这样的转运活性可用本领域已知的多种方法通过直接或间接的方式测量，其例子在本文中描述。“KCC2活性”用于此处指与KCC2相关的任何可检测表型。在一个实施方案中，KCC2活性包括，但不局限于钾运输、氯化物运输，它们可用例如膜片钳方法、氯化物/钾敏感染料(参阅例如Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，第九版，2002，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)电极等使用例如，逆转电位测量评估出入细胞内和/或外的钾和/或氯化物水平(直接或间接)来测定。此外，KCC2活性还可影响神经细胞的阴离子逆转电位(E阴离子)。阴离子逆转电位可用，例如，短杆菌肽穿孔的膜片钳记录来测定。
“氯化物转运蛋白表达”(例如，KCC2表达)涉及氯化物转运蛋白转录物(例如，KCC2转录物)或氯化物转运蛋白多肽或蛋白质(例如，KCC2多肽或蛋白质)的产生。因此，在实施方案中，氯化物转运蛋白的表达(例如，KCC2的表达)可通过直接评估蛋白质水平(例如，通过免疫组织化学和/或蛋白质印迹分析)确定或利用例如逆转录酶聚合酶链式反应[RT-PCR]方法、基于微阵列的方法或RNA印迹分析等测定编码氯化物转运蛋白的核酸的水平(例如，氯化物转运蛋白编码核酸，如氯化物转运蛋白mRNA水平)。
能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物可，例如，调节氯化物转运蛋白活性和表达(例如，KCC2活性和表达)。在实施方案中，氯化物转运蛋白活性或表达(例如，KCC2活性或表达)可增加。在一个实施方案中，这些化合物可以以使其接触CNS组织或CNS细胞的方式施用。可应用的化合物包括，但不局限于，直接或间接改变蛋白质活性的化合物以及调节所述蛋白质产量和/或稳定性(例如，在转录、翻译、成熟、翻译后修饰、磷酸化和降解水平)的化合物。
一类所述化合物是通过调节KCC2上一个或多个位点起作用的化合物。据报道，克隆KCC2(20)时，KCC2不包含与PKA共有的磷酸化位点，但包含5个与PKC共有的磷酸化位点(Thr34、Ser728、Thr787、Ser940和Ser1034)。对酪氨酸蛋白磷酸化鉴定的一个共有位点(Tyr1081)在羧基末端。此酪氨酸激酶共有磷酸化作用位点不存在于KCC1或KCC4同种型中，但保留于KCC3蛋白质中(21)。同样的，能上调或增加KCC2活性的化合物包括，但不局限于，蛋白质激酶抑制物(例如，N-乙基马来酰亚胺(23-25)、星形胞菌素(29)和诸如K-252a的受体酪氨酸激酶抑制剂)；针对某些激酶或KCC2上激酶磷酸化位点产生的抗体或抗体片段；或者较直接(例如，能竞争KCC2上磷酸化位点的寡肽)或较不直接(例如，调节激酶活性和或表达的化合物)干扰KCC2磷酸化的化合物。在一个实施方案中，所述化合物可在介导磷酸化的信号途径水平发挥作用并最终影响KCC2的磷酸化。在另一实施方案中，可调节TrkB以影响KCC2磷酸化并最终调节KCC2活性。因而，在一个实施方案中，抑制TrkB活性的化合物可，例如，应用于这一方面。这样的化合物可包括，但不局限于，K-252a(可购自Calbiochem)或针对TrkB的中和抗体(抗-TrkB抗体[例如IgG](可购自BD Transduction Laboratories)。另一实施方案中，依赖cAMP的激酶或PKA的调节，例如抑制可用于调节KCC2的磷酸化并最终用于治疗或预防疼痛。例如，PKA抑制剂H-89(可购自EMD Biosciences)可用于这方面。在另一实施方案中，钙调蛋白依赖性激酶(CAM激酶，例如II和IV)的调节，例如抑制可通过调节KCC2的活性(例如磷酸化)减轻或预防受试者的疼痛。能抑制所述激酶的化合物包括，但不局限于，KN-93(可购自EMD Biosciences)。在另一实施方案中，TrkB途径的其它成员，例如磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或磷脂酰胆碱特异的磷脂酶C，例如，磷脂酶Cγ(PLCγ)的调节剂，例如抑制剂，可用于降低CNS神经细胞中的细胞内氯化物水平。这样的化合物包括，但不局限于，三环癸-9-基-黄原酸、1-O-十八烷基-2-O-甲基-消旋-甘油基-3-磷酸胆碱、硫酸新霉素、四氢氯酸精胺、1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-1H-吡咯-2，5-二酮或1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-2，5-吡咯烷二酮。
此外，KCC2表达的调节还可起因于调节KCC2表达的转录因子的调节(例如，通过磷酸化介导的)。在另一方面，本发明提供了在受试者或动物中治疗疼痛或预防/减轻伤害感受的方法，其包括调节，在实施方案中减少或降低CNS神经元或组织中的细胞内氯化物水平。在一个实施方案中，细胞内氯化物水平的所述降低是通过调节，例如降低受试者CNS神经元或组织中氯化物转运蛋白(如，KCC2)的活性或表达来完成的。在另一实施方案中，受试者是脊椎动物。在又一实施方案中，受试者是哺乳动物，在更进一步的实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，CNS组织是脊髓组织，神经细胞是脊髓神经细胞。
因此，本发明提供了治疗疼痛的方法，其包括对受试者施用能调节，在某些实施方案中，降低或减少CNS组织(如，CNS神经细胞)中细胞内氯化物水平。在一个实施方案中，所述调节作用，例如氯化物转运蛋白(例如KCC2)活性和/或表达的增加导致了受试者中细胞内氯化物水平的降低。在一个实施方案中，所述CNS组织是脊髓，而所述神经细胞是脊髓神经细胞。
在一个实施方案中，KCC2包含与SEQ ID NO2、4、6所提出序列或其片段基本上相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，KCC2可由与能够编码SEQ ID NO2、4、6或其片段的核苷酸序列基本上相同的核酸，诸如与SEQ ID NO1、3、5中提出的序列或其片段基本上相同的序列编码。
如上所提及的，保持活性的KCC2的同源物、变体和/或片段也可用于本发明的方法中。同源物包括与KCC2的氨基酸序列基本上相同、与KCC2共有显著的结构和功能同源性的蛋白质序列。变体包括，但不局限于，通过任何修饰以及/或者氨基酸替换、缺失或添加而与KCC2不同的蛋白质或肽。修饰可以在包括多肽主链(即氨基酸序列)、氨基酸侧链和氨基或羧基末端在内的任何部位发生。这样的替换、缺失或添加可能涉及一个或多个氨基酸。片段包括KCC2的片段或部分或者KCC2同源物或变体的片段或部分。
至于增加或上调细胞中KCC2的表达，可使用将编码KCC2的核酸引入细胞中的多种方法，其实例描述如下。诸如下文讨论的基因治疗等方法可用于这一方面。编码KCC2的核酸的例子包括能编码SEQ ID NO2、4或6的多肽的核酸(例如SEQ ID NO1、3和5的核酸)或与它们基本上相同的核酸。所述方法还可包括通过例如移植或引入包含所述KCC2编码核酸的神经细胞或其前体(例如，干细胞)对某一区域或神经组织(例如CNS组织)施用包含所述KCC2编码核酸的细胞。此外，所述方法可能需要对受试者施用能调节，例如上调或增加KCC2表达的化合物。这样的化合物可用例如下文所述筛选方法鉴别和表征。这种化合物可进一步作为含所述化合物和药学可接受载体的组合物提供。在一个实施方案中，所述组合物被配制或改装以便施用于CNS。这样的化合物或组合物可以配备使用说明书的商业包装提供。
“同源性”和“同源的”指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较比对序列中各位置而确定。核酸之间或氨基酸序列之间的同源程度是在序列所共有位置处相同的或匹配的核苷酸或氨基酸数目的函数。当此术语用于此处时，如果两个序列基本上相同且序列的功能活性是保守的，则认为该核酸序列是与另一序列“同源的”(用于此处时，术语“同源的”并不意味着进化相关的)。当两个核酸序列进行最佳序列比对(允许缺口)时，如果它们共有至少大约50％的序列相似性或同一性，或者如果所述序列共有限定的功能基元，则认为这两个核酸序列是基本上相同的。在备选的实施方案中，最佳比对的基本上相同序列的序列相似性可以是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于此处时，序列之间给定的同源性百分数指示了任选比对序列中的序列同一性程度。“非相关”或“非同源的”序列与SEQ ID NO1至6中任一个共有少于40％的同一性，尽管优选少于大约25％的同一性。
基本上互补的核酸是其中一分子的“互补物”基本上与另一分子相同的核酸。用于同一性序列比较的最适序列比对可用多种算法进行，所述算法为诸如局部同源性算法(Smith和Waterman，1981，Adv.Appl Math2482)、同源性比对算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443)、相似性搜索方法(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)和这些算法的计算机实现(诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin遗传学软件包中，GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列同一性也可用BLAST算法确定，参阅Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(用已公布的默认设置)。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)获得(通过互联网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法包括首先通过识别查询序列中与数据库序列中同样长度序列进行比对时匹配或满足某些正值阈值得分T的长度W的短字确定高得分序列对(HSPs)。T指临近字得分阈值。最初的邻近字采样数作为起始搜寻的种子以发现更长的HSPs。只要累积比对得分增加，字采样数就沿着各序列的两个方向延伸。当遇到以下参数时，字采集点在各方向的延伸暂停累积比对得分从其获得的最大值下降量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积比对得分达到0或之下；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序可使用默认值序列长度(W)11、BLOSUM62得分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)比对(B)50、期望值(E)10(或1或0.1或0.01或0.001或0.0001)、M＝5、N＝4以及两条链的比较。利用BLAST算法进行的两个序列之间统计学相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然存在匹配的可能性的指征。在本发明的备选实施方案中，如果在被检测序列比较中最小总和概率小于大约1，优选小于大约0.1，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，则认为核苷酸或氨基酸序列基本上相同。
两个核酸序列基本上互补的另一指征是两序列在适度严格或优选严格的条件下相互杂交。在适度严格的条件下与滤膜结合序列的杂交可进行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中65℃进行杂交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃漂洗(参阅Ausubel等(编辑)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.以及John Wiley & Sons，Inc.，New York，2.10.3)。或者，在严格条件下与滤膜结合序列的杂交可进行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA于65℃进行杂交，并在0.1×SSC/0.1％SDS于68℃漂洗(参阅Ausubel等(编辑)，1989，同上文)。杂交条件可依照已知方法根据目的序列而改变(参阅Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes，第一部分，第二章，″Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，纽约)。通常，严格条件选定为，在限定的离子强度和pH条件下较热解链温度低约5℃。
在另一方面，本发明还提供了减轻受试者中伤害感受的方法。在一个实施方案中，该方法包括调节，例如降低受试者细胞(例如，CNS细胞)中的细胞内氯化物水平。在另一实施方案中，所述方法还包括调节，例如增加氯化物转运蛋白活性或表达，如，KCC2活性或表达。在另一实施方案中，所述方法还包括使CNS神经细胞与能调节氯化物转运蛋白活性的化合物接触。所述化合物包括，但不局限于，TrkB抑制剂(诸如K-252a或抗-TrkB抗体)、PKA抑制剂(诸如H-89)或CAM激酶抑制剂(诸如KN-93)。
本发明另外还提供了预防和/或治疗疼痛的组合物，其包含与药学可接受载体混合的能调节(例如，降低)细胞内氯化物水平的化合物。在一个实施方案中，这样的组合物可调节，例如增加或上调氯化物转运蛋白活性，例如，KCC2活性和/或表达。在一个实施方案中，这样的组合物适合或适应施用于CNS神经细胞或组织，诸如脊髓组织或细胞。在另一实施方案中，这样的组合物可以是KCC2表达或活性的诱导剂。用于此处时，“诱导剂”是直接或间接上调或增强KCC2基因的表达、KCC2mRNA的稳定性、KCC2mRNA的翻译、KCC2多肽的成熟、转运(例如，KCC2多肽对细胞膜的再循环)或KCC2多肽的转运蛋白活性的化合物。在一个实施方案中，“诱导剂”也可以下调或抑制KCC2抑制剂。
本发明另外提供了能调节(例如，降低)细胞内氯化物水平以治疗或预防疼痛的上述组合物或上述化合物的用途。本发明还提供了能调节(例如，降低)细胞内氯化物水平的上述组合物或上述化合物的用途，用于制备治疗或预防疼痛的药物。在一个实施方案中，所述化合物或组合物调节，例如增加或上调氯化物转运蛋白(如，KCC2)活性和/或表达。在另一实施方案中，所述化合物或组合物可包括TrkB抑制剂(诸如K-252a或抗-TrkB抗体)、PKA抑制剂(诸如H-89)或CAM激酶抑制剂(诸如KN-93)。在另一实施方案中，所述药物可配制成施用于受试者的CNS组织，例如CNS细胞。此外，所述化合物可以是，例如，KCC2表达或活性的诱导剂。
本发明还提供了商业包装，其含有能调节(例如，降低)细胞内氯化物水平的化合物或上述组合物以及用于治疗或预防疼痛的说明书。在一个实施方案中，所述化合物可调节(例如，增加或上调)氯化物转运蛋白或KCC2活性和/或表达。
在多个实施方案中，能调节(例如降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物可在治疗上用于治疗疼痛的制剂或药物中。所述化合物可，例如，调节(例如增加或上调)氯化物转运蛋白(例如，KCC2)的活性和/或表达。本发明还提供了相应的医学治疗方法，其中将能调节(在某些实施方案中降低)细胞内氯化物水平的化合物的治疗剂量以药学可接受的剂型施用。因此，本发明还提供了治疗组合物，其含有能调节(在某些实施方案中降低)细胞内氯化物水平的化合物以及药学可接受的赋形剂或载体。所述治疗组合物在生理上可接受的pH条件下可溶于水性溶液。
在一个实施方案中，施用本发明的化合物使其与CNS组织或CNS神经元接触。用于此处时，“中枢神经系统”或CNS是包括脑和脊髓(例如，在腰部区域)在内的神经系统的一部分。相反，“外周神经系统”或PNS是除了脑和脊髓之外的神经系统部分。在一个实施方案中，CNS组织是表面背角，在更进一步的实施方案中，CNS组织是片层I神经元。同样的，在实施方案中，可通过直接颅内或鞘内注射或注射入脑脊髓液中施用本发明的化合物以体内处理CNS细胞。或者，所述化合物可以以能穿越血脑屏障和进入CNS的形式全身(例如，静脉内或经口)施用。“神经的”和“神经元的”可互换用于此处，均涉及神经元和神经系统。
本发明还提供了药物组合物(药物)，其含有能调节(在一个实施方案中降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物。在一个实施方案中，这样的组合物包含足以治疗或减轻疼痛的治疗或预防有效量化合物以及药学可接受载体。“治疗有效量”指实现预期治疗效果，诸如减轻疼痛必须的以剂量和时限有效的量。能调节(在某些实施方案中降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物的治疗有效量可根据以下因素而变化诸如个体的疾病状态、年龄、性别、体重、和化合物在该个体中引起预期反应的能力。可调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也是治疗有益效果超过该化合物的任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”指实现诸如预防或抑制疼痛发作或疼痛严重程度增加等预期预防效果必须的以剂量和时限有效的量。预防有效量可按上述确定治疗有效量的方法确定。对于任何具体的受试者而言，可根据个体需要以及施用组合物或者监督组合物施用的人员的专业推断随时间调节特定剂量方案。
用于此处时，“药学可接受载体”或“赋形剂”包括生理上相容的任一和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。在一个实施方案中，载体适于肠胃外施用。或者，载体可适于静脉内、腹膜内、肌内、颅内、鞘内、舌下或经口施用。药学可接受载体包括无菌水性溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。将所述介质和活性剂用于药学活性物质是本领域众所周知的。除非任一常规介质或活性剂与活性化合物不相容，否则它们均可预期用于本发明药物组合物中。辅助的活性化合物也可掺入所述组合物中。
治疗组合物通常必须在制备和贮存条件下是无菌和稳定的。所述组合物可配制成溶液剂、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。所述载体可以是溶剂或分散介质，它们包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等等)及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，对于分散剂和使用表面活性剂的情况下通过保持所需的颗粒大小可以保持适当的流动性。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇，诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包含例如单硬脂酸盐和明胶等延迟吸收的活性剂可导致可注射组合物的吸收延长。此外，能调节(在一个实施方案中增加或上调)KCC2活性和/或表达的化合物可以以定时释放制剂的形式施用，例如，以包含缓释聚合物的组合物施用。活性化合物可与保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合体，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。制备所述制剂的许多方法是已受专利权保护或通常对于本领域技术人员而言是已知的。
通过将必需量活性化合物(例如，能调节，在一个实施方案中降低CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物)与上文列举的一种成分或多种成分的组合掺入适当溶剂中，然后无菌过滤制备无菌的可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和上面列举的所需的其它组分的无菌赋形剂中制备分散物。在用于无菌可注射溶液制备的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干，它产生了活性成分粉末及其来自先前无菌过滤溶液的任何附加预期成分。依照本发明的另一方面，能调节(在一个实施方案中降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物可与一种或多种增强其溶解度的附加化合物配制在一起。
依照本发明的另一方面，包含能调节(在一个实施方案中降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物的本发明的治疗组合物可以以容器或商业包装的形式提供，所述容器或商业包装还包括所述治疗组合物用于治疗疼痛的说明书。
由于细胞中降低的细胞内氯化物水平与氯化物转运蛋白(KCC2)水平/活性的调节(例如增加)相关，且进一步与本文所述伤害感受减轻相关，所以本发明的另一方面是通过对受试者(例如，CNS组织)施用编码KCC2的核酸分子或其保持KCC2活性的变体或片段来治疗疼痛。合适的施用方法包括基因治疗方法。
可用诸如直接注射DNA、受体介导的DNA吸收、病毒介导的转染或非病毒转染和基于脂质的转染等方法在体内将本发明的核酸转运至细胞，所有这些方法都涉及基因治疗载体的使用。已利用直接注射将裸DNA在体内引入细胞中(参阅，例如Acsadi等(1991)Nature 332815-818；Wolff等(1990)Science 2471465-1468)。可使用在体内将DNA注射入细胞中的递送装置(例如“基因枪”)。这样的装置可通过商业途径获得(例如，来自BioRad)。裸DNA也可通过DNA与阳离子，诸如聚赖氨酸配合而被引入细胞中，所述阳离子可以偶联细胞表面受体的配体(参阅，例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267963-967；和美国专利申请5,166,320)。DNA-配体络合物与受体的结合可通过受体介导的胞吞作用促进DNA的摄取。与破坏核内体的腺病毒衣壳连接，从而将物质释放入胞质中的DNA-配体络合物可用于避免络合物被细胞内溶酶体所降解(参阅，例如Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；.Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。
为了用作基因治疗载体，对缺陷型逆转录病毒进行了很好的表征(综述参阅Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。用于产生重组逆转录病毒以及利用所述病毒在体外或体内感染细胞的方法可参阅文献CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等(编辑)Greene PublishingAssociates，(1989)，第9、10-9、14节，以及其它标准的实验室手册。适当的逆转录病毒的例子包括本领域技术人员众所周知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。适当的包装病毒系的例子包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。逆转录病毒已被用于在体外和/或体内将多种基因引入许多不同类型的细胞中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参阅，例如Eglitis等(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury等(1991)Science2541802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897640-7644；Kay等(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.1504104-4115；美国专利4,868,116；美国专利4,980,286；国际专利申请WO89/07136；国际专利申请WO89/02468；国际专利申请WO89/05345和国际专利申请WO 92/07573)。
为了用作基因治疗载体，可对腺病毒基因组进行处理使其编码和表达本发明的多肽化合物，但在正常溶胞病毒生活周期中的复制能力失活。例子参阅Berkner等(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等(1991)Science252431-434；和Rosenfeld等(1992)Cell 68143-155。来自腺病毒株Ad type5d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的适当腺病毒载体是本领域技术人员众所周知的。重组腺病毒的有利之处在于它们作为有效的基因转运载体不需要分裂细胞，且可用于感染多种的细胞类型，包括呼吸道上皮细胞(Rosenfeld等(1992)见上文)、内皮细胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)、肝细胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902812-2816)和肌细胞(Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺伴随病毒(AAV)可用作基因治疗载体转运DNA达到基因治疗的目的。AAV是天然存在缺陷病毒，其需要另一病毒，诸如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒用于有效复制和再生性生命周期(Muzyczka等Curr.Topicsin Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可用于将DNA整合入非分裂细胞中(参阅例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.621963-1973)。诸如Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5.3251-3260)所述AAV载体可用于将DNA引入细胞中(参阅，例如Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA816466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。慢病毒(Lentiviral)基因治疗载体也适于用于本发明中。
基因治疗的通用方法是本领域所已知的。参阅，例如，Anderson等人的美国专利5,399,346。用于递送遗传物质的生物相容的胶囊可参阅Baetge等人的国际专利申请WO 95/05452。将基因转移入造血细胞的方法先前也有报道(参阅Clapp，D.W.等，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo等，Science 288669-72(2000))。本发明还涉及移植方法，其用于在受试者中引入含有能编码KCC2的核酸的细胞，或在受试者中引入已在体外或先体外后体内用能降低细胞内氯化物水平的化合物处理过的细胞(例如，通过在含有所述化合物的适宜培养基在培养该细胞)。在一个实施方案中，这样的细胞是神经细胞或其前体，例如能发育/分化成神经细胞的干细胞(神经祖细胞)。涉及神经干细胞分离、增殖、表征和/或移植的方法参阅文献，例如，美国专利5,851,832；5,968,829；5,411,883；5,750,376；6,040,180；5,753,506和6,001,654。核酸可存在于如上所述载体中，该载体通过如上所述方法在体外被引入细胞中。在一个实施方案中，所述细胞是自体的且获自所述受试者。在某些实施方案中，所述细胞是异源或异种的。
由于CNS细胞中细胞内氯化物水平和疼痛之间具有相关性，所以能调节(例如降低)CNS细胞中细胞内氯化物水平的化合物可用于预防和治疗疼痛。在一个实施方案中，可用调节(例如增加或上调)氯化物转运蛋白(例如KCC2)活性/表达的化合物降低细胞内氯化物水平并最终预防或治疗疼痛。因此，本发明还涉及用于鉴定和表征能调节细胞内氯化物水平和/或氯化物转运蛋白活性和/或表达的筛选方法。因此，本发明还提供了确定候选化合物是否能调节细胞内氯化物水平并因此用于预防和治疗疼痛的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将CNS来源的细胞接触所述候选化合物并测定在受试化合物存在的条件下细胞内氯化物水平是否下降。细胞内氯化物水平的下降表明受试化合物可用于治疗或预防疼痛。用于此处时，“CNS来源的细胞”是分离或来自CNS组织的细胞，在实施方案中既包括初级神经元培养物，又包括永生的神经元细胞系，以及被接受的体外神经元模型系统(例如，在体外分化成神经元的细胞)。在一个实施方案中，上述细胞具有氯化物转运蛋白或KCC2活性。在另一实施方案中，所述细胞内源性表达氯化物转运蛋白(例如，KCC2)。在又一实施方案中，上述细胞已被基因工程化以表达氯化物转运蛋白基因或KCC2基因。在一个实施方案中，所述细胞可以是含有外来引入氯化物转运蛋白(诸如KCC2)来源的适当宿主细胞。可通过将编码氯化物转运蛋白或KCC2的核酸序列引入宿主细胞并提供所述核酸表达所需的条件来制备这种宿主细胞。在一个实施方案中，这样的核酸是DNA。所述宿主细胞可以是真核的，诸如两栖动物或哺乳动物细胞。在一个实施方案中，这样的宿主细胞是人的细胞。
本发明还提供了用于鉴定或表征对治疗和预防疼痛有效的药物的另一种方法。在一个实施方案中，所述方法包括将CNS来源的细胞接触候选化合物并测定在受试化合物存在的条件下氯化物转运蛋白的活性是否被调节。氯化物转运蛋白活性的调节，例如增加表明受试化合物可用于治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，该氯化物转运蛋白是KCC2。KCC2的活性可通过例如测量钾运输、氯化物运输、细胞内氯化物水平和阴离子逆转电位来确定。
对于一种受试化合物或数种受试化合物或受试化合物文库(例如，组合文库)而言都可应用上述方法。在后一种情况下，也可鉴定和表征化合物组合所产生的协同作用。上述化合物可用于预防和/或治疗疼痛，或可用作先导化合物用于开发和检测具有改良的特异性、功效和/或药理学(例如药物动力学)特性的其它化合物。在一个实施方案中，所述化合物可以是前体药物，其在例如CNS组织(例如，脊髓)等适当的作用位点转换成活性形式。在某些实施方案中，本发明的筛选/检测方法中的一个或多个步骤可以自动化。
如上所述，本发明还涉及用于鉴定和表征能调节(在某些实施方案中增加)氯化物转运蛋白(例如KCC2)基因表达的化合物的方法。这样的方法可包括在受试化合物存在或缺失的条件下检测氯化物转运蛋白(例如KCC2)的基因表达。这样的基因表达可通过检测相应的RNA或蛋白质，或者通过使用适报道构建体来检测，其中所述构建体含有通常与所述氯化物转运蛋白或KCC2基因结合的转录调节元件，所述基因有效连接报道基因。当第一种核酸序列与第二种核酸序列在功能上相关时，第一种核酸序列可以“有效连接”第二种核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。通常，有效连接的DNA序列在读框中是相邻的，且在必要的情况下连接两个蛋白质编码区。不过，由于例如增强子通常在与启动子间隔数千个碱基的情况下仍能发挥作用且内含子序列可能是不同长度的，所以某些多核苷酸元件可以有效连接但不是相邻的。“转录调节元件”是一个指诱导或调节与其有效连接的蛋白质编码序列转录的DNA序列的一般术语，诸如起始和终止信号、增强子和启动子、剪接信号、聚腺苷酸化信号。这种报道基因的表达可在转录或翻译水平上进行测量，例如，通过检测所产生的RNA或蛋白质的量。RNA可通过例如RNA印迹或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分析(参阅，例如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，USA)。蛋白质水平可用亲和试剂(例如，抗体或其片段[方法参阅例如Harlow，E.和Lane，D(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]；结合蛋白质的配体)或通过其它特性(例如在绿色荧光蛋白的情况下是荧光)直接检测，或者通过测量可能使其具有酶活性从而产生可检测产物(例如，具有改变的分光光度特性)或可检测表型(例如细胞生长的变化)的蛋白质活性进行测定。合适的报道基因包括，但不局限于，氯霉素乙酰转移酶、β-D-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白。在一个实施方案中，候选化合物可进一步被检测以确定其是否能调节氯化物转运蛋白介导的过程(例如KCC2介导的过程)或氯化物转运蛋白活性(例如KCC2活性)。在一个实施方案中，这样的氯化物转运蛋白介导的过程是离子转运，例如钾或氯化物转运，通过例如评估钾和/或氯化物水平(例如细胞内的)或通过测量阴离子逆转电位(电生理学)、膜电位来测定，例如下文实施例中所描述的。
本发明还涉及疼痛的诊断和预测。在一个实施方案中，疼痛是由受试者神经系统(例如中枢神经系统)中离子(例如阴离子或氯化物)内稳态的变化所引起的。不被任何具体理论所束缚，从中枢神经系统(CNS)神经元输出钾和氯化物能力的降低可能导致持久的神经元超兴奋性和最终导致疼痛。
本发明由此提供了用于诊断或预测与CNS功能异常相关的疼痛的方法。用于此处时，“CNS功能异常”是CNS中神经元离子内稳态的变化。在一个实施方案中，与所述CNS功能异常相关的疼痛是神经性疼痛。在一个实施方案中，所述方法包括测定CNS神经细胞中的细胞内氯化物水平并将该氯化物水平与相应的对照水平进行比较。在此具体方法中，检测水平相对于对照水平的增加表明受试者正经受CNS功能异常相关性疼痛。在一个实施方案中，所述方法可以包括确定CNS氯化物转运蛋白活性或表达(例如，KCC2活性或表达)相对于对照活性或表达而言是否被调节，例如上调或增加。在另一实施方案中，对照氯化物水平可选自已建立的标准、较早时间测定的受试者中相应的氯化物水平、当受试者经受疼痛较轻(相对于上文提及的当前伤害感受而言)或基本上无疼痛时在所述受试者中测定的相应氯化物水平；或者当对照受试者经受疼痛较轻(相对于上文提及的测试组受试者中当前伤害感受而言)或基本上无疼痛时在对照受试者中测定的相应氯化物水平。在一个实施方案中，经受疼痛较轻或基本上无疼痛的受试者或对照受试者未呈现出明显的中枢或外周神经系统损伤(例如，神经性疼痛)或持续的疼痛。在另一实施方案中，对照活性或表达可选自已KCC2活性或表达的建立的标准、在较早时间测定的受试者中KCC2活性或表达的相应水平、当受试者伤害感受较轻(如上所述)或基本上无疼痛时测定的受试者中KCC2活性或表达的相应水平、或者在所经受伤害感受较轻(如上所述)或基本上无疼痛的对照受试者中测定的KCC2活性或表达的相应水平。在一个实施方案中，KCC2的活性可如上所述测定。
例如，通过对受试者施用能接触该受试者CNS神经细胞的指示剂化合物(诸如指示氯化物水平的化合物)可测定细胞内的氯化物水平。在施用指示剂化合物后，可进行与该指示剂化合物相关的体内信号评估。在一个实施方案中，可以使用指示剂化合物，诸如放射性核素(例如，铊-201(201Tl)、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI或99mTc-HMPAO或它们的氯化物缀合物)或指示KCC2表达的化合物(诸如基于免疫检测的试剂(例如，针对KCC2多肽的抗体、单链抗体或Fab片段))。在另一实施方案中，指示剂化合物通过静脉内注射时可穿过血脑屏障并积累于类似于钾的CNS神经元中，即反应钾水平。在另一实施方案中，所述放射性核素(例如201Tl)的剂量可以是大约100MBq(3mCi)。在另一实施方案中，放射性核素(例如201Tl)可在进行SPECT成像之前15-20分钟注射。注射指示剂化合物后，可采用成像技术评估体内与指示剂化合物相关的信号。这样的成像技术包括，但不局限于，单光子发射计算机层析X射线照相术(SPECT)、正电子发射层析X射线照相术和/或磁共振成像。成像技术可评估指示剂化合物的体内信号，诸如神经钾梯度。图象可通过，例如，用装备有高分辨率(5-7mm)瞄准仪并连接了专用计算机系统的γ照相机获得。在一个实施方案中，可在180°弧获得连续投影图像。在另一实施方案中，神经元的放射性核素(例如201Tl)滞留可表示为滞留指数(RI)。“滞留指数”按本文所述定义为(延时滞留-早期滞留)×100/早期滞留。
在一个实施方案中，“滞留指数”的“滞留”在此定义为在某一时间内被特定组织保留的指示剂化合物(例如，示踪物或放射性核素)的量。在另一实施方案中，在延时滞留之前评估早期滞留。在又一实施方案中，测量CNS组织中滞留指数。
在一个实施方案中，上文提及的诊断/预测方法可与上文提及的治疗/预防方法联合进行，用于预防或治疗受试者中与CNS功能异常相关的疼痛。所述方法因此包括CNS功能异常相关疼痛的诊断或预测，且根据诊断/预测，降低受试者中CNS细胞的细胞内氯化物水平从而预防或治疗疼痛。
尽管本文描述了多种实施方案，但可依照本领域技术人员共有的常规知识在本发明范围内进行许多改变和修饰。这样的修饰包括为了以基本上相同的方式达到相同的效果针对本发明任一方面的已知等价方案的替代。数字范围包括定义该范围的数字。在权利要求中，单词“包含”被用作一个开放的术语，基本上等同于短语“包括，但不局限于”。以下实施例是对本发明各个方面的举例说明，而非限制本文所公开的本发明的广泛方面。在整篇申请中，引用了许多文献以便更完整的描述本发明所属的领域。这些参考文献的公开因此作为参考并入本公开。
实施例实施例1方法神经损伤简而言之，如文献所述(16)通过外科手术在成年雄性Spague-Dawley大鼠的坐骨神经周围植入聚乙烯套(长～2mm，内径0.7mm)。还有一组大鼠也接受假手术。只有显示出机械阈值(在14-17天中)逐渐降低至2.0g或更少的动物才用于进一步的实验。
行为检测如文献所述(17)检测伤害感受消退反射的热和机械阈值。
切片制备如文献所述(9)从成年(大于50天)雄性大鼠制备脊髓旁矢状面切片(300-350μm)。用含以下成分(mM)的人造脑脊髓液(ACSF)不断浇注切片(2-3ml/分钟)126NaCl，2.6NaHCO3，10葡萄糖，2.5KCl，2CaCl2，2MgCl2，1.25NaH2PO4，0.001TTX(通入95％O2-5％CO2，pH～7.4)；当测量GABAA/GlyR-介导的电流时，加入10μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)和40μM D2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV)以阻断快速的谷氨酸能传递。
记录为了进行穿孔膜片钳(perforated patch)记录，在移液器头上吸满含以下成分的溶液(mM)130葡糖酸铯(CsGluc)，5CsCl，2MgCl2，11BAPTA钙螯合剂(缓冲液)，1CaCl2，4ATP，0.4GTP，10HEPES(pH～7.4)。移液器回吸补充了25μg/ml短杆菌肽D(短杆菌肽贮存液是溶于DMSO中10mg/ml)的相同溶液。当接入电阻(access resistance)稳定在25-45MQ之间时选择此方式的记录。为了进行全细胞电压钳记录，使移液器吸满无短杆菌肽D的上述溶液。类似的，用吸了电压钳所用溶液的相同的细胞内溶液进行全细胞电流钳记录，不同之处在于用甲基硫酸钾(KMeSOe)代替CsGluc。为了在0mV夹住E阴离子，在细胞内溶液中用110mM CsCl代替CsGluc。所有E阴离子＝0mV时的全细胞记录都是在Vm＝-60mV且存在GluR阻断剂的条件下进行的。用板式微量移液器(patch micropipette)通过压力喷射局部应用GABA 30-250ms。如文献所述(9)进行数据采集和PSC分析。若非特别指明，所有的测量以平均值±SEM给出。用斯氏t-检验比较平均值的统计学显著性、卡方检验检测相依表以及混合设计ANOVAs(post-hoc-Tukey′s HSD)检测重复测量的统计学显著性。
钙成像如上文关于电生理分析从PNI和首次用于实验的大鼠制备切片。在ACSF中孵育15分钟后，在切片装入溶于HEPES缓冲盐水(+10％DMSO)的10μM Fura-2-AM(荧光测定钙指示剂，AM＝乙酸基甲基)1小时。先用ACSF漂洗切片～15分钟再固定于记录室中，在记录室中继续对切片浇注ACSF(2-3ml/分钟)。用装备了表面荧光光学系统的Zeiss Axioscope荧光检测[Ca2+]i。用与CCD照相机连接的TILL Photonics单色仪获取图像并在清楚的明显神经元细胞体中标出目的区域(用于定量)。
免疫印迹从PNI和首次用于实验的成年大鼠二者的腰膨大制备SDH水平切片(150μm)。通过用特氟隆研杵在含以下成分的缓冲液中匀浆制备组织提取物0.32M蔗糖，0.5mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM二乙胺四乙酸(EDTA)，2.5mM β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂的混合物(CompleteTM，RocheDiagnostics)。收集3,000g(20分钟)和10,000g(30分钟)离心的上清液。将稀释于样品缓冲液中的等量蛋白质(20μg/泳道)在37℃预热30分钟，用SDS-PAGE解析，并电印迹至硝酸纤维素膜上。将膜在溶于TBST缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.05％Tween-20)的5％脱脂干奶中封闭30分钟并在4℃与兔抗KCC2抗体(1∶1000，Upstate Biotechnology)孵育过夜。用TBST漂洗数次后，将膜与过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶2000)一起在室温孵育30分钟。用Super Signal FemtoTM(PierceBiotechnology)检测化学发光条带。用VersaDocTM成像系统(BioRad)捕捉数码图像并用QuantityOneTM软件(BioRad)分析数据。
寡脱氧核糖核苷酸如文献所述(18)设计在所有位置硫代磷酸酯化的KCC2反义和合成的寡脱氧核糖核苷酸反义5′-TCTCCTTGGGATTGCCGTCA-3′(SEQ IDNO7；相对于ATG起始信号+59处)；合成的寡脱氧核糖核苷酸5′-TCTTCTTGAGACTGCAGTCA-3′(SEQ ID NO8)。
鞘内注射至少在药物施用前三天，如文献所述(11)用戊巴比妥钠(65mg/kg)麻醉大鼠并将腰脊椎导管插入鞘内空间。简而言之，在大池处产生一个小开口，将导管插入蛛网膜下空间并从尾部径直前进～8cm至脊髓的腰膨大。从外科手术恢复后，通过鞘内(i.t.)注射利多卡因(2％，30μl)诱导下身麻痹从而证实正确的导管定位。只有对利多卡因呈现出适当的短暂麻痹现象以及无运动缺陷的动物被用于行为试验。在施用药物/载体后，处死动物并解剖它们的脊柱以在视觉上证实导管的正确放置。药物包括DIOA(10-30μg，在0.9％NaCl，10％DMSO中)和寡脱氧核糖核苷酸(每剂2μg，0小时、12小时和24小时各一剂；0.9％NaCl)。如上所述进行行为试验，在接受药物或载体之前，在首次用于实验的大鼠中证实了消退反应的正常(～15g)机械阈值。在所使用的剂量时，根据抓握、直立和放置反射以及行为观察(17)评估发现没有化合物产生运动干扰或镇静。
计算机模拟(参阅图5)所有的模拟都通过NEURON 4.3.1基于(19)利用具有形态学和被动膜(passive membrane)性质的普通脊髓片层I纺锤状神经元的区室模型进行。将最多分叉至第四级且轴突与文献(19)所述相似的树突附着于躯体。基于(30)的快速Na+和延迟的整流器K+电流分别以0.1和0.01S/cm2插入躯体和轴突起始段及节点处，形成尖峰的电压阈值是-49mV。两套抑制性突触随机分布于周围体细胞区(perisomatic region)，而四套兴奋性突触则在更末梢，每一套都通过独立的Poisson方法以文献(31)和(32)外推的速率驱动。
电子显微术(参阅图6)
如文献(35)所述处理组织用于超结构分析。简而言之，先用0.9％NaCl，后用含4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，德国)的固定液从主动脉弓灌注大鼠。灌注后，除去脊髓，解剖冠状阻滞，然后低温保护切下60μm薄的切片并液氮冻融，用磷酸缓冲液漂洗数次后在初次抗血清中孵育。在含2％牛血清白蛋白(BSA)的封闭液中孵育后，将切片在兔抗KCC2(1∶500，UpstateBiotechnology，USA)中4℃孵育48小时。充分洗涤后，将切片在1nm金缀合的抗兔二级抗体(1∶250，Aurion)中4℃孵育12小时，随后银强化(SE-EM，Aurion)。将切片用0.5％OsO4处理(20min)，梯度乙醇中脱水，然后在氧化丙烯中脱水，并包埋于Durcupan ACM(Fluka)中。超切片后(Ultracut UCT，Leica，德国)，用电子显微镜(Philips Tecnai 12，配备了MegaViewTMCCD照相机)检查样本。用电镜分析非连续(间隔＞3μm)超薄切片。随机选择具有突触特征的小结并用片层I和II及白质分析KCC2蛋白质的表达(36)。
鞘内施用K-252a(参阅图8)用25μl含10％DMSO的0.9％NaCl溶液配制K-252a。通过在大池产生一个小的开口并将P10聚乙烯管插入蛛网膜下空间-从尾部径直～8cm至脊髓的腰膨大处，从而完成鞘内导管插入术。
实施例2结果通过长期压缩坐骨神经诱导外周神经病(图1a)。为了检测外周神经损伤(PNI)后的SDH神经元的超兴奋性(致敏)是否与阴离子梯度(阴离子)的变化相关，用穿孔短杆菌肽膜片钳记录检测阴离子逆转电位(E阴离子)。此技术避免了细胞内阴离子浓度的破坏(8)。对外源GABA应用的反应显示来自PNI大鼠片层I(LI)神经元的阴离子逆转电位(E阴离子)是-49.0±2.3mV(范围-40至-62.2mV，n＝9)，相比，来自首次用于实验的大鼠LI神经元的阴离子逆转电位为-72.6±3.5mV(范围-63.0到-79.9mV，n＝5；p＜0.005)(图1b-d)。PNI(-62±4mV，n＝7)和首次用于实验的大鼠LI神经元(-61±2mV，n＝16；p＞0.1)之间的静息膜电位无显著的差异。在快速谷氨酸受体(GluR)阻断剂存在条件下从PNI大鼠LI神经元记录的自发和激发的突触后电流(PSCs)也是内向的(从静止去极化)，它们的平均逆转电位相对于首次用于实验的大鼠片层I神经元中的逆转电位而言提高了16.1mV(n＝6，PNI；n＝4，首次用于实验的)。
然后研究PNI后SDH中突触传递的其它特性是否改变。即使从局部抑制性中间神经元共释放出GABA和甘氨酸，仅甘氨酸受体(GlyR)也能介导首次用于实验的大鼠的LI神经元中的抑制性小型PSCs(mPSCs)(9；图2a)。而在所有来自PNI大鼠的被检测细胞中，GluR-介导的mPSC均未受PNI的影响(图2b)，在GlyR拮抗剂马钱子碱存在的条件下持续出现0mV外向的一群mPSC(最大1μm；n＝4)。这些残留的mPSC是由GABAARs介导的，因为它们被荷包牡丹碱(10μM)所阻断并且与GlyR介导的组分相比呈现出延长的衰减动力学(τD(GABAAR)＝34.0±2.9ms，n＝5相对于τD(GlyR)＝11.3±1.3ms，n＝6；p＜0.01；图2C)。
动力学分析进一步显示出mPSC的36.9±2.3％衰减期遵循双指数函数(dual exponential function)(τD1＝7.5±2.0ms且τD2＝51.3±7.9ms；n＝6；图2c)。这些事件具有GABAAR和GlyR介导的成分，因为马钱子碱或荷包牡丹碱都可导致它们相应成分的消除(n＝4)。因此，与阴离子衰减相并行，PNI引起了LI突触处的再组织，从而暴露出除了GlyR单独介导的mPSC之外由GABAAR单独介导以及混合GABAAR/GlyR-介导的mPSC。此突触组织与不成熟LI-II神经元中观察到的类似(9)。此突触开关的净效果是它产生了一组具有显著较长的衰减动力学的量子突触事件。
为了检查PNI-诱导的GABAAR-介导的对mPSC的贡献，我们分析了峰电导和mPSC的频率。此操作的完成是利用填充了CsCl的移液器夹住来自PNI和首次用于实验的大鼠的LI神经元在0mV的E阴离子以防止由于驱动力改变而导致的mPSC的有偏检测。在来自PNI大鼠的LI神经元中记录到的仅GlyR的mPSC的峰电导明显小于(～1/2)从首次用于实验的大鼠LI神经元记录得到的数据(图2d)。不过，在PNI条件下增加GABAAR-介导的事件部分补偿了仅GlyR时电导的降低。GluR介导的量子事件的峰电导在来自首次用于实验的大鼠和PNI大鼠的LI神经元之间无显著差异(图2d)。
通过对峰电导、动力学和驱动力改变的综合因素分析，在来自PNI大鼠的LI神经元中静息膜电位上GlyR单独介导的mPSC携带的净电荷大约为首次用于实验的大鼠中的1/3(图2e)。不过，在有GABAAR贡献的情况下，PNI大鼠中mPSC所携带的净电荷回升至首次用于实验的大鼠中GlyR介导的水平。此结果显示，尽管大小相当，但是首次用于实验的大鼠LI神经元中超极化电荷只是由GlyR-介导的mPSC携带，而在PNI大鼠LI神经元中，由于GABAAR-介导的mPSC衰减动力学的延长，去极化电荷主要是通过GABAAR转移。
据观察在来自PNI大鼠的LI神经元记录到的仅GlyR mPSC的频率(0.13±0.04Hz，n＝5)显著低于首次用于实验的大鼠LI神经元在仅GlyR的mPSC频率(0.18±0.04Hz，n＝6；p＜0.05；图2f)。不过，如同峰电导一样，GABAAR-介导的mPSC的加入补偿了PNI-导致的频率减小(0.22±0.10Hz，n＝4，对于所有GABAAR和/或GlyR-介导的事件组合而言，p＞0.5)。相反，分离自PNI大鼠的LI神经元中的GluR介导的事件频率(1.51±0.90Hz，n＝9)与分离自首次用于实验的大鼠的LI神经元中的(0.82±40Hz，n＝S；p＞0.3；图2f)相比较无显著变化。
如果去极化GABAAR/GlyR-介导的突触后电流在PNI LI神经元中产生净兴奋作用，它们应直接引起动作电位，并因此导致Ca2+内向通量。为了检验这一假设，我们利用切片中负荷fura-2-am的LI神经元进行Ca2+成像以获得大数据集。对神经元体施用外源GABA在PNI部位身体同侧的19％LI神经元中导致了细胞内Ca2+([Ca2+]i)浓度的显著增加(n＝53；图3a，c)。这代表与首次用于实验的大鼠和/或对侧背角中发现的LI神经元相比增加了7倍，其中在被检测的37个神经元中只观察到1个具有针对GABA施用而产生的[Ca2+]i增加(图3b、c)。这些反应可以被荷包牡丹碱(10μM；n＝5)以及电压敏感钠通道阻断剂河豚毒素(TTX；1μM；n＝31)所阻断。然后我们进一步从电生理学上证实了应用的GABA和突触引起的阴离子突触后电位可直接引起动作电位(图3d、e)。这些结果表明突触后阴离子内向通量可在PNI大鼠的片层I神经元中引起净兴奋。我们然后通过对SDH的水平切片进行免疫印迹比较了KCC2蛋白质水平。相对于受伤部位的对侧而言，在PNI同侧的腰SDH中KCC2表达水平显著降低(＞2倍)(图3f)。在首次用于实验的大鼠中，两侧之间无显著的差异(n＝3)。
如果KCC2转运蛋白表达的减少导致神经元[Cl-]i的增加并，又导致了GABAAR-介导的去极化作用，那么在来自首次用于实验的大鼠LI神经元中KCC2转运蛋白的药理学阻断应具有相同的效果。为了检测此可能性，我们对首次用于实验的脊髓切片水浴应用选择性的KCC2阻断剂DIOA(30μM)。如在PNI情况中，DIOA存在时应用GABA引起30％被检测的首次用于实验的LI神经元中[Ca2+]i增加(图3b、c)。为了检查凭经验确定的GABAAR/GlyR-介导的突触后控制的变化是否足以导致PNI之后中枢敏化，我们利用就生物物理学而言逼真的神经元模型模拟体内情况(图5)。模拟证实PNI之后，LI神经元敏化的程度随它们的E阴离子而变，从轻微的去抑制至净超兴奋变化。
为了检测此超兴奋性(敏化)是否将导致引起伤害感受消退反射的刺激阈值的降低，我们通过鞘内导管将DIOA(15-30μg)直接施用于完整大鼠中脊椎的腰膨大处。DIOA导致了针对对机械和热刺激物的伤害感受阈值快速且可逆的降低(图4a-b)。通过脊髓施用针对KCC2mRNA的反义寡脱氧核苷酸选择性击倒(knock-down)所述转运蛋白，也得到了伤害感受阈值的相似降低(图4e)，更进一步证实了KCC2下调的功能性影响。
如图7中所示，我们证实了在取自患外周神经病大鼠的片层I神经细胞中，跨膜阴离子逆转电位(E阴离子)的去极化程度显著高于取自首次用于实验的大鼠的片层I神经元中的E阴离子。记录自首次用于实验的大鼠片层I神经元的阴离子(碳酸氢盐和氯化物)逆转电位(E阴离子)显著小于从已接受外周神经损伤(PNI)的大鼠的片层I神经元中记录的E阴离子。水浴应用(bath application)BDNF(50ng/ml；N/BDNF)和NGF(50ng/ml；N/NGF)二者都导致记录自首次用于实验的大鼠片层I神经元的E阴离子变得显著去极化，标志着跨膜阴离子梯度的衰减。或者，对取自PNI大鼠的片层I神经元水浴应用TrkB拮抗剂K-252a(200nM；P/K252a)导致E阴离子超极化至与取自首次用于实验的大鼠片层I神经元中观察到的相似的水平。所有的E阴离子值都利用短杆菌肽-D穿孔膜片电压钳记录得以证实。如上文所提及的，此去极化E阴离子是由于在取自神经病大鼠的片层I神经元中KCC2协同转运蛋白表达下降所导致的。在取自首次用于实验的大鼠的片层I神经元中，本文进一步表明可通过灌注生长因子NGF和BDNF显著去极化E阴离子，表明这些生长因子可降低表面背角中KCC2蛋白质的功能和/或表达。或者，本文表明在取自神经病大鼠的片层I神经元中用蛋白激酶抑制剂K-252a阻断BDNF受体TrkB逆转了E阴离子的去极化，使该值回复到与首次用于实验的大鼠片层I神经元中观察到的相似的水平。此外，如在图8中所示的，鞘内施用受体酪氨酸激酶抑制剂K-252a(6nM)(而非只注射载体)在已接受外周神经损伤的大鼠中导致触觉伤害感受消退的阈值提高。因此K-252a可在外周神经损伤后外周神经再发育之后逆转痛觉过敏/异常性疼痛。根据抓握、直立和放置反射以及行为观察进行评估，K-252a不产生任何运动干扰或镇静作用。预计，此抑制剂通过阻断磷酸化再次激活了取自神经病大鼠的片层I神经元中KCC2协同转运蛋白，所述磷酸化可能是在转运蛋白或其转录因子(或其它调节底物)上蛋白质酪氨酸激酶位点处。
此处的结果表明，PNI后导致疼痛的神经病变可通过KCC2exporter下调和脊髓LI神经元中阴离子的所得变化来解释。它们还证实了在成年动物中所述阴离子的改变可发生于损伤部位跨突触的神经元中。早先为了鉴定外围神经病超兴奋特性潜在底物所作的努力都集中于测量GABA能中间神经元的数目、GABA含量或GABAAR表达的改变。结果是矛盾的(3-6)。本文所介绍的发现提供了了解所述去抑制机制的新途径。通过阴离子的变化，GABAAR/GlyR-介导的突触后作用的转变提供了中枢敏化(centralsensitization)的机械基础，包括神经元反应性和兴奋输入的增加。
脊髓的重要特征是它利用了两条非常不同的GABA能抑制机制感觉纤维中枢末端的GABA能控制涉及去极化机制(39)，与GABA能抑制作用涉及超极化的背角细胞相反。因此，此处所报道的KCC2表达的变化只影响了控制感觉输入的两种抑制机制中一种的GABA活动的极性。这一点通过初级传入缺乏KCC2表达这一事实得以证实(图4f、g；也参阅图6)。
GABA/甘氨酸介导的去极化作用也可用作门控机制使得可通过电压敏感的Ca2+通道(VSCC)和NMDA受体/通道激活(10)。经由这些通道的Ca2+内向通量被认为对于脊髓神经元的敏化是重要的(11)。确实，已证实在神经性疼痛的治疗中通过诸如加巴喷丁和氯胺酮等药物阻断人体内的这些Ca2+通道非常有效(12-14)。不过，使用Ca2+通道阻断剂，尤其是氯胺酮和其它NMDA拮抗剂，是与许多不希望的副作用相关的(14，15)。
实施例3-KCC2的体外TrkB-依赖性调节制备来自首次用于实验的大鼠或PNI大鼠背角的旁矢状面切片(250-300μm)。用加氧的林格溶液持续灌注切片并在进行进一步处理前将切片平衡至少1.5小时。除非另外说明，用10μM CNQX-一种非NMDA离子型谷氨酸受体的阻断剂进一步灌注切片。用短杆菌肽-D穿孔膜片或全细胞电压膜片钳记录仪对肉眼可识别的片层I神经元进行记录。在两种情况下，用移液器吸取含甲基硫酸钾或葡糖酸铯的细胞内溶液作为主要的离子类型。通过对目的神经元体连续短暂(5-10ms)应用外源GABA来检测E阴离子；通过操纵神经元的膜电位，将GABA既不引起内向也不引起外向阴离子电流的点作为E阴离子。对液体接点电位、移液器偏移量和电阻校正膜电位的所有测量。
如图12中所示，脑源神经营养因子(BDNF；50ng/ml浴中)介导的TrkB活化和神经生长因子(NGF；50ng/ml浴中)介导的TrkA活化均在首次用于实验的大鼠片层I神经元中导致阴离子逆转电位(E阴离子)显著的去极化作用。
利用取自外周神经损伤(PNI)大鼠的切片，其中E阴离子是慢性去极化的，应用与TrkB受体偶联的细胞内途径组分的多种抑制剂，发现这引起了E阴离子(碳酸氢盐和氯化物)显著的超极化，其程度达到了与在首次用于实验的大鼠切片中观察到的相似的水平(图13)。导致此效果的活性剂包括，但不局限于，针对TrkB的抗体(抗-TrkB-IgG 1μg/ml浴中)；K-252a(TrkA/B自磷酸化的抑制剂(200nM溶液))；H-89，依赖cAMP的激酶(PKA)的膜渗透性抑制剂(15μM浴中))；以及KN-93(钙调蛋白依赖性激酶II和IV的膜可渗透性抑制剂(5μM浴中))。
实施例4-体内伤害感受阈值的TrkB-依赖型调节用于通过鞘内导管局部脊髓递送的所有药物都溶于加有或未加10％v/v DMSO的0.9％NaCl中。通过在大池产生一个小的开口并将一短的P10聚乙烯管插入蛛网膜下空间-从尾部径直～8cm至脊髓的腰膨大(L4-5)，完成鞘内导管插入术。根据通过抓握、直立和放置反射以及其它行为观察所进行的评估，施用的药物都不产生运动干扰或镇静作用。利如前所述(41)用Von Frey试验评估机械刺激的50％消退阈值。所有的实验都在完整成年Sprague-Dawley大鼠中进行。
利用鞘内导管局部脊髓递送多种活性剂可鉴定导致首次用于实验的大鼠中触觉刺激的伤害感受阈值下降或提高PNI大鼠中伤害感受阈值的几种化合物。
局部脊髓递送转导BDNF(图14)或人重组BDNF(10μg/天，共6天)的腺病毒而不是转导绿色荧光蛋白的腺病毒导致首次用于实验的大鼠中机械刺激的伤害感受阈值显著降低。同样的，鞘内递送人重组NGF(图15；10μg/天，共6天)至首次用于实验的大鼠导致所述伤害感受阈值非常相似的降低。
另一方面，通过鞘内导管对PNI大鼠连续施用针对TrkB的抗体(抗-TrkB-IgG 12μg/2小时，共3次)实现对机械刺激的伤害感受阈值显著提高(图16)。局部脊髓递送PKA抑制剂H-89(380nmol)也导致伤害感受阈值的提高(图17)。
在整篇申请书中，引用了多种文献，它们更完整地描述了本发明所属领域的状况。这些文献的公开在此引用作为本公开的参考。
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acc tgt gat gag tac ttc acc cga aac aat gtc aca gag atc cag ggc 1120Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly330 335 340 345att cct ggt gct gcc agt ggt ctc atc aaa gag aac ctg tgg agt tct 1168lle Pro Gly Ala Ala Ser Gly Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser350 355 360tac ctg acc aaa ggg gtg att gtc gag agg cgt ggg atg ccc tct gtg 1216Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val365 370 375ggc ctg gca gac ggt acc ccc gta gac atg gac cac ccc tat gtc ttc 1264Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe380 385 390agt gat atg acc tcc tac ttc acc ctg ctc gtt ggt atc tac ttc ccc 1312Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro395 400 405tca gtc aca ggg atc atg gct ggc tca aac cga tct gga gac ctg cgg 1360Ser Val Thr Gly Ile Met Ala Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg410 415 420 425gat gcc cag aag tct atc cct act gga act atc ctg gcc att gct acc 1408Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr430 435 440acc tct gct gtc tac atc agc tct gtt gtt ctg ttt gga gcc tgc atc 1456Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile445 450 455gag ggg gtc gtc tta cgg gac aag ttt ggg gaa gct gtg aat ggc aac 1504Glu Gly Val Val Leu Arg Asp Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn460 465 470ttg gtg gtg ggc acc ctg gcc tgg cct tct ccc tgg gtc atc gtc ata 1552Leu Val Val Gly Thr Leu Ala Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile475 480 485ggc tct ttc ttc tct acc tgt ggg gct gga tta cag agc ctc aca ggg 1600Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly490 495 500 505gcc cca cgt ctg ctg cag gcc atc tcc cgg gat ggc ata gtg ccc ttc 1648Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe510 515 520ctg cag gtc ttt ggc cat ggc aaa gct aat gga gag cca acc tgg gcg 1696
Leu Gln Val Phe Gly His Gly Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala525 530 535ctg ctg ctg act gcc tgc atc tgt gag atc ggc atc ctc ata gcc tcc 1744Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile Cys Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser540 545 550ctg gat gag gtc gcc cct ata ctt tcc atg ttc ttc cta atg tgt tac 1792Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr555 560 565atg ttt gtg aac ttg gct tgt gcg gtg cag acg ctg ctg agg aca ccc 1840Met Phe Val Asn Leu Ala Cys Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro570 575 580 585aac tgg agg cca cga ttt cgc tat tac cac tgg act ctc tcc ttc ctg 1888Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg Tyr Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu590 595 600ggc atg agc ctc tgc ctg gcc ctc atg ttc att tgc tcc tgg tac tac 1936Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala Leu Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr605 610 615gca ctg gtg gcc atg ctc att gcc gga ctc att tat aag tac atc gag 1984Ala Leu Val Ala Met Leu Ile Ala Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu620 625 630tac cgg ggg gcg gag aag gag tgg ggg gat gga atc cga ggc ctg tct 2032Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser635 640 645ctc agt gca gca cgc tat gct ctc ttg cgc ctg gag gaa gga cct ccg 2080Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro650 655 660 665cat acg aag aac tgg agg ccc cag ctg ctg gtg ctg gtg cgt gtg gac 2128His Thr Lys Asn Trp Arg Pro Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp670 675 680cag gat cag aac gtg gtg cat ccg cag ctg ctc tcc ctg acc tcc cag 2176Gln Asp Gln Asn Val Val His Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln685 690 695ctc aag gca ggg aag ggc ctg acc att gtg ggc tcc gtc ctt gag ggc 2224Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly700 705 710acc ttt ctg gac aac cat cca cag gct cag cgg gca gag gag tct atc 2272Thr Phe Leu Asp Asn His Pro Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile
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<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tcttcttgag actgcagtca 20
权利要求
1.治疗或预防受试者中疼痛的方法，所述方法包括降低所述受试者中枢神经系统(CNS)神经细胞中的细胞内氯化物水平。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括调节所述CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达，从而降低所述氯化物水平。
3.权利要求2的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
4.权利要求3的方法，所述方法还包括增加所述KCC2的活性或表达。
5.权利要求1的方法，其中所述CNS神经细胞是脊髓神经细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述疼痛信号发源于外周神经系统(PNS)细胞或所述CNS神经细胞跨突触的感觉纤维。
7.权利要求1的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
8.权利要求7的方法，其中所述神经性疼痛与神经或神经束损伤有关。
9.权利要求7的方法，其中所述神经性疼痛选自躯体疼痛和内脏疼痛。
10.权利要求1的方法，其中所述疼痛选自慢性炎症疼痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关疼痛、消化系统疾病相关疼痛、克罗恩氏病相关疼痛、自身免疫病相关疼痛、内分泌病相关疼痛、糖尿病性神经病相关疼痛、幻肢疼痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关疼痛、I型和II型复合性区域疼痛综合症、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛以及周期性急性痛。
11.权利要求1的方法，其中所述方法包括对所述受试者施用能降低所述CNS细胞中所述细胞内氯化物水平的化合物。
12.权利要求11的方法，其中所述化合物能调节所述CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。
13.权利要求12的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
14.权利要求13的方法，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表达。
15.权利要求14的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述抑制剂选自K-252a和抗-TrkB抗体。
17.权利要求13的方法，其中所述化合物是依赖cAMP的激酶(PKA)的抑制剂。
18.权利要求17的方法，其中所述抑制剂是H-89。
19.权利要求13的方法，其中所述化合物是钙调蛋白依赖性激酶(CAM激酶)的抑制剂。
20.权利要求19的方法，其中所述抑制剂是KN-93。
21.权利要求3的方法，其中所述KCC2包含与选自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
22.用于治疗或预防受试者中疼痛的组合物，所述组合物包含(a)能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物；和(b)药学可接受的载体。
23.权利要求22的组合物，其中所述化合物能调节所述CNS神经细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。
24.权利要求23的组合物，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
25.权利要求24的组合物，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表达。
26.商业包装，其包含权利要求22的组合物以及其用于治疗或预防疼痛的说明书。
27.商业包装，其包含能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物以及其用于治疗或预防疼痛的说明书。
28.权利要求27的商业包装，其中所述化合物能调节所述CNS神经细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。
29.权利要求28的商业包装，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
30.权利要求29的商业包装，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表达。
31.权利要求22的组合物的用途，用于治疗或预防疼痛。
32.权利要求22的组合物的用途，用于制备治疗或预防疼痛的药物。
33.能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物的用途，用于治疗或预防疼痛。
34.能降低CNS神经细胞中细胞内氯化物水平的化合物的用途，用于制备治疗或预防疼痛的药物。
35.权利要求33的用途，其中所述化合物能调节所述CNS细胞中氯化物转运蛋白的活性或表达。
36.权利要求35的用途，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
37.权利要求36的用途，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表达。
38.权利要求37的用途，其中所述化合物是TrkB的抑制剂。
39.权利要求38的用途，其中所述抑制剂选自K-252a和抗-TrkB抗体。
40.权利要求37的用途，其中所述化合物是依赖cAMP的激酶(PKA)的抑制剂。
41.权利要求40的用途，其中所述抑制剂是H-89。
42.权利要求37的用途，其中所述化合物是钙调蛋白依赖性激酶的抑制剂。
43.权利要求42的用途，其中所述抑制剂是KN-93。
44.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)将受试化合物接触CNS来源的细胞；和(b)测定在所述受试化合物存在下所述细胞内氯化物水平是否降低；其中所述降低表明所述受试化合物可用于治疗或预防疼痛。
45.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(c)将受试化合物接触表达氯化物转运蛋白的CNS来源的细胞；和(d)测定在所述受试化合物存在下所述氯化物转运蛋白的活性或表达是否以使得细胞内氯化物水平降低的方式受到调节；其中所述调节表明所述受试化合物可用于治疗或预防疼痛。
46.权利要求45的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
47.权利要求46的方法，其中所述方法包含确定在受试化合物存在下所述KCC2表达或活性是否增加和所述调节是否为增加。
48.权利要求47的方法，其中通过测量选自钾转运、氯化物转运、细胞内氯化物水平和阴离子逆转电位的参数确定所述KCC2活性。
49.权利要求44的方法，其中所述疼痛选自慢性炎症疼痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关疼痛、消化系统疾病相关疼痛、克罗恩氏病相关疼痛、自身免疫病相关疼痛、内分泌病相关疼痛、糖尿病性神经病相关疼痛、幻肢疼痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关疼痛、I型和II型复合性区域疼痛综合症、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛以及周期性急性痛。
50.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)将受试化合物接触包含第一种核酸的CNS来源的细胞，所述第一种核酸包含通常与氯化物转运蛋白基因结合的转录调节元件，所述氯化物转运蛋白基因有效连接包含能编码报道蛋白的报道基因的第二种核酸；和(b)在所述受试化合物存在下测定报道基因表达或报道蛋白活性是否被调节；其中报道基因表达或报道蛋白活性的所述调节表明所述受试化合物可用于治疗或预防疼痛。
51.权利要求50的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
52.权利要求51的方法，其中在所述受试化合物存在下所述报道基因表达或报道蛋白活性增加。
53.减轻受试者中伤害感受的方法，所述方法包括减少所述受试者中细胞内氯化物。
54.权利要求53的方法，其中所述方法包含调节所述CNS神经细胞中氯化物转运蛋白活性或表达。
55.权利要求54的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
56.权利要求55的方法，所述方法还包括增加所述KCC2活性或表达。
57.权利要求55的方法，其中所述方法还包括将所述CNS神经细胞接触能增加KCC2活性或表达的化合物。
58.权利要求57的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制剂。
59.权利要求58的方法，其中所述抑制剂选自K-252a和抗-TrkB抗体。
60.权利要求57的方法，其中所述化合物是依赖cAMP的激酶(PKA)的抑制剂。
61.权利要求60的方法，其中所述抑制剂是H-89。
62.权利要求57的方法，其中所述化合物是钙调蛋白依赖性激酶的抑制剂。
63.权利要求62的方法，其中所述抑制剂是KN-93。
64.权利要求55的方法，其中所述KCC2包含与选自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
65.诊断或预测经受疼痛的受试者中与CNS功能异常相关的疼痛的方法，所述方法包括确定相对于相应的对照氯化物水平，受试CNS细胞内氯化物水平是否提高；其中所述提高表明该受试者正经受与CNS功能异常相关的疼痛。
66.权利要求65的方法，所述方法还包括确定相对于对照转运蛋白活性或表达，CNS氯化物转运蛋白活性或表达是否受到调节。
67.权利要求66的方法，其中所述氯化物转运蛋白是KCC2。
68.权利要求67的方法，所述方法还包括确定相对于所述对照活性或表达，所述KCC2活性或表达是否降低。
69.权利要求65的方法，其中所述对照细胞内氯化物水平选自(a)已建立的标准；(b)较早时候在所述受试者中测定的相应细胞内氯化物水平；(c)当所述受试者所经受的疼痛较轻或基本上无疼痛时测定的所述受试者中相应细胞内氯化物水平；和(d)在经受疼痛较轻或基本上无疼痛的对照受试者中测定的相应细胞内氯化物水平。
70.权利要求68的方法，其中所述对照活性或表达选自(a)KCC2活性或表达的已建立的标准；(b)较早时候在所述受试者中测定的KCC2活性或表达的相应水平；(c)当所述受试者所经受的疼痛较轻或基本上无疼痛时测定的所述受试者中KCC2活性或表达的相应水平；和(d)在经受疼痛较轻或基本上无疼痛的对照受试者中测定的KCC2活性或表达的相应水平。
71.权利要求67的方法，其中通过测量选自钾转运、氯化物转运、细胞内氯化物水平和阴离子逆转电位的参数确定所述KCC2活性。
72.权利要求65的方法，其中通过(a)对所述受试者施用指示细胞内氯化物水平的指示剂化合物从而该化合物接触所述受试者的CNS神经细胞；(b)评估与所述指示剂化合物相关的体内信号；来测定所述细胞内氯化物水平。
73.权利要求65的方法，其中所述与CNS功能异常相关的疼痛是神经性疼痛。
74.权利要求73的方法，其中所述指示剂化合物是放射性核素。
75.权利要求75的方法，其中放射性核素选自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。
76.权利要求73的方法，其中通过成像技术评估所述体内信号。
77.权利要求72的方法，其中所述体内信号是所述指示剂化合物的滞留指数。
78.权利要求76的方法，其中所述成像技术选自单光子发射计算机层析X射线照相术、正电子发射层析X射线照相术和磁共振成像。
79.权利要求73的方法，其中所述指示剂化合物指示KCC2表达。
80.权利要求79的方法，其中所述指示剂化合物是针对KCC2的抗体。
81.治疗受试者中与CNS功能异常相关的疼痛的方法，所述方法包括(a)根据权利要求65的方法，诊断或预测所述受试者中与CNS功能异常相关的疼痛；(b)降低所述受试者的CNS细胞中细胞内氯化物水平。
全文摘要
描述了用于减弱或治疗疼痛和减轻伤害感受的方法和产品。所述方法和产品是以CNS细胞内氯化物水平的调节为基础的。所述方法和产品还涉及诸如KCC2氯化钾协同转运蛋白等氯化物转运蛋白的活性和/或表达的调节。本文还描述了以所述调节为基础的商业包装及其用途。本文还描述了用于鉴定或表征治疗疼痛的化合物、减轻伤害感受以及诊断和预测疼痛的有关方法。
文档编号A61K31/00GK1805769SQ200480016630
公开日2006年7月19日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月16日
发明者Y·德科宁克, P·德科宁克, J·A·M·库尔 申请人:拉瓦勒大学