专利名称：针对胰岛素样生长因子Ⅰ受体的抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)的抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR，EC 2.7.112，CD 221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶的家族(LeRoith，D.，等，Endocrin.Rev.16(1995)143-163；和Adams，T.E.，等，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。IGF-IR高亲和力地结合IGF-I并且在体内激发对这种配体的生理响应。IGF-IR还结合IGF-II，但亲和性稍低。IGF-IR的过量表达促进了细胞的致瘤性转化并且存在IGF-IR涉及细胞的恶性转化的证据，因此其是一个开发治疗癌症的治疗用试剂的有用靶(Adams，T.E.，等，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。
针对IGF-IR的抗体在现有技术中是众所周知的，并且在体外和体内对它们的抗肿瘤效果进行了研究(Benini，S.，等，Clin.Cancer Res.7(2001)1790-1797；Scotlandi，K.，等，Cancer Gene Ther.9(2002)296-307；Scotlandi，K.，等，Int.J.Cancer 101(2002)11-16；Brunetti，A.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.165(1989)212-218；Prigent，S.A.，等，J.Biol.Chem.265(1990)9970-9977；Li，S.L.，等，Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252；Pessino，A.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.162(1989)1236-1243；Surinya，K.H.，等，J.Biol.Chem.277(2002)16718-16725；Soos，M.A.，等，J.Biol.Chem.，267(1992)12955-12963；Soos，M.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)5217-5221；O′Brien，R.M.，等，EMBO J.6(1987)4003-4010；Taylor，R.，等，Biochem.J.242(1987)123-129；Soos，M.A.，等，Biochem.J.235(1986)199-208；Li，S.L.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.196(1993)92-98；Delafontaine，P.，等，J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673；Kull，F.C.Jr.，等J.Biol.Chem.258(1983)6561-6566；Morgan，D.O.，和Roth，R.A.，Biochemistry 25(1986)1364-1371；Forsayeth，J.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)3448-3451；Schaefer，E.M.，等，J.Biol.Chem.265(1990)13248-13253；Gustafson，T.A.，和Rutter，W.J.，J.Biol.Chem.265(1990)18663-18667；Hoyne，P.A.，等，FEBS Lett.469(2000)57-60；Tulloch，P.A.，等，J.Struct.Biol.125(1999)11-18；Rohli，Q.T.，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.149(1987)276-281；和Kalebic，T.，等，Cancer Res.54(1994)5531-5534；Adams，T.E.，等，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063；Dricu，A.，等，Glycobiology 9(1999)571-579；Kanter-Lewensohn，L.，等，MelanomaRes.8(1998)389-397；Li，S.L.，等，Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252)。针对IGF-IR的抗体还描述于许多其它公开物中，例如Arteaga，C.L.，等，Breast Cancer Res.Treatment 22(1992)101-106；和Hailey，J.，等，Mol.Cancer Ther.1(2002)1349-1353。
具体地，将针对IGF-IR的称为αIR3的单克隆抗体广泛应用于研究IGF-IR介导的过程和IGF-I介导的疾病诸如癌症的研究中。α-IR-3在Kull，F.C.，J.Biol.Chem.258(1983)6561-6566中有所描述。同时，已经公开了约百篇涉及αIR3的研究及其治疗应用的公开物，涉及αIR3单独和与细胞生长抑制剂诸如多柔比星和长春新碱一起的抗肿瘤效果。αIR3是一种鼠单克隆抗体，已知其抑制IGF-I与IGF受体的结合但是不抑制IGF-II与IGF-IR的结合。高浓度的αIR3刺激肿瘤细胞增殖和IGF-IR的磷酸化(Bergmann，U.，et al.，Cancer Res.55(1995)2007-2011；Kato，H.，et al.，J.Biol.Chem.268(1993)2655-2661)。但是，存在其它抗体(例如，1H7，Li，S.L.，等，CancerImmunol.Immunother.49(2000)243-252)，与抑制IGF-I的结合比较，其更有效抑制IGF-II与IGF-IR的结合。抗体以及它们的性质和特征的现有技术的概要在Adams，T.E.，等.，Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063中有所描述。
描述在现有技术中的大多数抗体起源自小鼠。如在现有技术中众所周知的，在没有经过进一步的改变诸如嵌合化(chimerization)或人源化的情况下，这些抗体对于治疗人患者是没有作用的。基于这些缺陷，在治疗人患者中，明显首选将人抗体作为治疗用试剂。在现有技术中，人抗体是众所周知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于这项技术，可以制备针对许多种类靶目标的人抗体。针对IGF-IR的人抗体的实例在WO 02/053596中有所描述。
但是，对于需要抗肿瘤治疗的患者而言，仍然需要具有令人信服的益处的针对IGF-IR的抗体。简而言之，与患者有关的益处是通过用抗肿瘤药治疗使肿瘤生长减少，并使其进展时间明显延长。
发明简述本发明包括一种结合IGF-IR并且抑制IGF-I及IGF-II与IGF-IR的结合的抗体，其特征在于所述抗体a)是IgG1同种型，b)显示其对IGF-I与IGF-IR结合的抑制的IC50值与其对IGF-II与IGF-IR结合的抑制的IC50值的比率为1∶3-3∶1，c)当与没有所述抗体的这种测定比较时，在含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用HT 29细胞的细胞磷酸化测定中，其在5nM的浓度上抑制至少80％，优选地至少90％的IGF-IR磷酸化，和d)当与没有所述抗体的这种测定相比，在含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用3T3细胞的细胞磷酸化测定中，其在10μM的浓度上没有显示作为PKB磷酸化所测量的IGF-IR的刺激活性，所述3T3细胞提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞。
按照本发明的抗体显示了对于需要抗肿瘤治疗的患者的益处并且使肿瘤生长减少以及明显延长进展时间。按照本发明的抗体具有新的和创造性的特性，其给患有与IGF失调有关的疾病，特别是肿瘤疾病的患者带来了益处。按照本发明的抗体，其特征在于上述特性。因此，特别地，所述特性是与IGF-IR的特异性结合，以上述比率抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合，是IgG1同种型，以及甚至在其IC50值的200倍浓度上在IGF-IR过量表达细胞中没有激活IGF-IR发信号。当被用作治疗用药剂时，不具有“IGF-I模拟活性”的抗体提供强大的益处。
优选地，通过ADCC，在100nM的所述抗体浓度下24小时后，按照本发明的抗体另外诱导表达IGF-IR的细胞的制剂的20％或更多的细胞死亡。
此外，优选地，通过CDC，在100nM所述抗体的浓度下4小时后，按照本发明的抗体诱导表达IGF-IR的细胞的制剂的20％或更多的细胞死亡。
优选地，在5nM的浓度上，按照本发明的抗体完全抑制肿瘤细胞中由IGF-I介导的IGF-IR的信号转导。
本发明还包括核酸。编码的多肽能够与如下详细说明的各个其它的抗体链一起进行装配a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
另外，优选地，所述抗体是单克隆抗体，是嵌合抗体(人的恒定链)，人源化的抗体并且特别优选地是人抗体。
所述抗体与人IGF-IR(EC 2.7.1.112，SwissProt P08069)的结合要与抗体18与人IGF-IR的结合竞争。
所述抗体的特征还在于亲和性是10-8M(KD)或更少，优选地是约10-9-10-13M。
所述抗体优选没有显示可检测到的浓度依赖性的对胰岛素与胰岛素受体结合的抑制。
优选地，本发明提供包括作为互补决定区(CDRs)的抗体，所述互补决定区具有如下序列a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
优选地，所述抗体是IgG1类型，因此提供C1q补体结合并诱导CDC。所述抗体的特征还在于与IgGFc受体结合并诱导抗体依赖型的细胞细胞毒性(ADCC)的能力。
和赋形剂处理的动物比较，在相关异种移植肿瘤模型中，按照本发明的抗体相当长地延长了进展时间，并且减少了肿瘤的生长。所述抗体优选地以对IGF-I和IGF-II大约等同的方式，在体外和体内抑制了IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合。
本发明还提供杂交瘤细胞系，其产生按照本发明的这些拮抗的单克隆抗体。
将按照本发明的优选的杂交瘤细胞系，<IGF-1R>HUMAB克隆18(抗体18)和<IGF-1R>HUMAB克隆22(抗体22)保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，德国。
从所述细胞系中可获得的抗体是本发明优选的实施方案。
本发明还提供编码这些抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体以及重组制备这些抗体的宿主细胞。
本发明还提供重组制备这些抗体的方法。
本发明还提供治疗癌症的方法，其包括向被诊断患有癌症(因此需要抗肿瘤治疗)的患者施用有效量的按照本发明的针对IGF-IR的拮抗抗体。所述抗体可以以药物组合物的形式单独施用，或备选地与细胞毒性的治疗诸如放射疗法或细胞毒性试剂或其前药结合进行施用。
本发明还包括按照本发明的抗体用于癌症治疗以及制备按照本发明的药物组合物的用途。此外，本发明包括制备按照本发明的药物组合物的方法。
本发明还包括一种药物组合物，其包含按照本发明的药物有效量的抗体，以及任选地，对于药用的抗体的制剂是有用的缓冲剂和/或佐剂。
本发明还提供药物组合物，其在药用载体中包含这种抗体。在一个实施方案中，可以将药物组合物包含在产品或试剂盒的物品中。
本发明还包括包含按照本发明的核酸的载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。
本发明还包括包含按照本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
本发明还包括制备按照本发明的重组人抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达按照本发明的核酸并且从所述细胞中回收所述抗体。本发明还包括通过这种重组方法可获得的抗体。
本发明还包括一种从多种针对IGF-IR的抗体中选择针对IGF-IR的抗体的方法，其特征在于用所述抗体进行在包含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中使用3T3细胞的细胞磷酸化测定，所述3T3细胞提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞，并且选择这样的抗体，当与没有所述抗体的这种测定相比时，所述抗体在10μM的浓度上没有显示作为PKB磷酸化所测量的IGF-IR刺激活性。优选地，所述抗体具有一种或多种上述另外的性质。
本发明还包括一种制备药物组合物的方法，其特征在于从多种针对IGF-IR的抗体中选择针对IGF-IR的抗体，其是通过用所述抗体，在包含0.5％热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，利用提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞的3T3细胞进行细胞磷酸化测定来选择，和选择所述抗体，与没有所述抗体的这种测定比较，所述抗体在10μM的浓度上没有显示作为PKB磷酸化所测量的IGF-IR刺激活性，通过重组表达的方式产生所述抗体，回收所述抗体和使所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂结合。优选地，所述抗体具有一种或多种上述另外的特性。
发明详述术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，其包括但不限于只要保留了按照本发明的性状特性的整个抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体以及遗传工程化的抗体。
“抗体片段”包括全长抗体的部分，通常至少是抗原结合部分或其可变区。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、免疫毒素和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，抗体片段包括单链多肽，其具有VH链的特性，即能够与VL链一起装配或具有与IGF-1R结合的VL链的特性，即能够与VH链一起装配，以形成功能性抗原结合袋并由此提供抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR结合的特性。
“抗体片段”还包括这种片段，其本身上不能提供效应子功能(ADCC/CDC)，但在结合以适当抗体的不变结构域后，以按照本发明的方式可以提供这种功能。
用于本文时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单氨基酸组成的抗体分子的制剂。因此，术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域。在一个实施方案中，人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的，所述杂交瘤包含来自转基因非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，所述B细胞具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组并且融合于一种无限增值化细胞。
术语“嵌合抗体”指一种单克隆抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区域，即结合区域，以及来源自不同来源或物种的恒定区域的至少一部分，通常通过重组DNA技术进行制备。特别优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这种鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包括编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是其中类别或亚类已经经过从初级抗体的类别或亚类修饰或改变的那些。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经被修饰从而包括与亲本免疫球蛋白的特异性不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的框架区域以制备所述“人源化抗体”。见，例如，Riechmann，L.，等，Nature 332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别上述特别指出的嵌合和双功能抗体的抗原的代表性序列。
用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。可变的重链优选地来自种系序列DP-50(GenBank LO6618)并且可变轻链优选地来自种系序列L6(GenBankX01688)。抗体的恒定区是人IgG1型的恒定区。这些区域可以是异型的并且在例如Johnson，G，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218以及其参考的数据库中有所描述，并且只要按照本发明的ADCC和优选地CDC的诱导的特性得以保留，这些区域是有用的。
用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如SP2-0、NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体以重排方式具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经过体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管来自和涉及人种系VH和VL序列，但可能在体内非天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。
用于本文时，“结合”指抗体以约10-13-10-8M(KD)，优选地约10-13-10-9M的亲和性结合于IGF-IR。
用于本文时“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选地是双链DNA。
“恒定结构域”不直接涉及抗体与抗原的结合但是涉及效应子功能(ADCC，补体结合和CDC)。按照本发明的抗体的恒定结构域是IgG1型的。将具有这些性状的人恒定结构域详细描述于Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991)和Brüggemann，M.，等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.，等，Methods Enzymol.178(1989)515-527。实例显示于SEQ ID NOS5-8。其它有用且优选的恒定结构域是可以从用于本发明于DSMZ保藏的杂交瘤细胞系中获得的抗体的恒定结构域。在本发明中有用的不变结构域提供了补体结合。通过可变和恒定结构域的结合提供ADCC和任选的CDC。
用于本文时，“可变区”(轻链(VL)的可变区，重链(VH)的可变区)表示直接涉及抗体与抗原结合的每个轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包括4个框架区域(FR)，其序列是广泛保守的，并通过三个“高变区”(或互补决定区，CDRs)连接。所述框架区域采取β折叠构象并且所述CDRs可以形成连接β折叠结构的环。通过框架区域，每条链的CDRs保持在它们的三维结构中并且与来自其它链的CDRs一起形成抗原结合部位。抗体的重链和轻链CDR3区域在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性中具有特殊的重要作用，并且因此提供本发明的另外的目标。
用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区域是除本文详细说明的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链包括从N端到C端的结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD.(1991))的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基来确定CDR和FR区域。
用于本文时，术语“与IGF-IR结合”意味着在体外试验中，优选地在结合试验中进行抗体与IGF-IR的结合，在所述结合试验中，所述抗体与表面结合并且通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance)(SPR)来测量与IGF-IR的结合。结合意味着10-8M或更少，优选地10-13-10-9M的结合亲和性(KD)。
通过BIAcore分析(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)可以研究与IGF-IR的结合。通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的关联的速率常数)、kd(解离常数)以及KD(kd/ka)来定义结合的亲和性。按照本发明的抗体显示10-10M或更少的KD。
IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合还受到按照本发明的抗体的抑制。在进行肿瘤细胞上IGF-I/IGF-II与IGF-IR的结合的试验中，以IC50表示测量抑制。在实施例7中描述了这种试验。在这种试验中，在不增加和增加抗体的浓度情况下，测量与所述肿瘤细胞(例如HT29)表面提供的IGF-IR结合的放射性标记的IGF-I或IGF-II或IGF-IR结合片段的量。对于IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合而言，按照本发明的抗体的IC50值不超过2nM并且IGF-I/IGF-II与IGF-IR的结合的IC50值的比率是约1∶3-3∶1。测量的IC50值是至少三次独立测量的平均值或中位值。单个IC50可不在这个范围内。
用于本文时，术语“抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合”指在体外试验中，抑制I125标记的IGF-I或IGF-II与存在于HT29(ATCC HTB-38)肿瘤细胞表面的IGF-IR的结合。抑制意味着IC50值为2nM或更低。
术语“IGF-IR表达细胞”指过量表达IGF-I受体到约至少20,000受体/细胞的这种细胞。这些细胞是，例如，肿瘤细胞系诸如NCI H322M或HT29，或在用IGF-IR的表达载体转染后，过量表达IGF-IR的细胞系(例如3T3ATCC CRL1658)。按照Lammers，R.，等EMBO J.8(1989)1369-1375来测量每个细胞的受体的量。
术语“抑制IGF-IR磷酸化”指一种细胞磷酸化测定，其在包含0.5％热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞的3T3细胞，届时与没有所述抗体的这种测定比较。使用特异于酪氨酸磷酸化的蛋白质的抗体通过蛋白质印迹法来检测磷酸化。这种测定在实施例11中有所描述。通过短期加热到56℃进行FCS的热灭活从而钝化补体系统。
术语“抑制PKB磷酸化”指一种细胞磷酸化测定，其在包含0.5％热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞的3T3细胞，届时与没有所述抗体的这种测定比较。使用特异于在PKB的丝氨酸473被磷酸化的PKB的抗体(Akt 1，Swiss Prot Acc.No.P31749)通过蛋白质印迹法来检测磷酸化。这种测定在实施例11中有所描述。
术语“抗体-依赖型细胞的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞的情况下，通过按照本发明的抗体裂解人肿瘤靶细胞。在存在效应细胞诸如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层(buffycoats)的纯化效应细胞，象单核细胞或NK细胞的情况下，优选地通过用按照本发明的抗体处理表达IGF-IR的细胞制剂进行ADCC的测量。如果在24小时后，所述抗体在100nM的浓度上诱导20％或更多的肿瘤细胞的裂解(细胞死亡)，发现ADCC。如果发现ADCC在4小时比在24小时更显著，那么在4小时进行测量。该试验优选地以51Cr或Eu标记的肿瘤细胞和特异性释放51Cr或Eu的测量进行。对照包括用效应细胞但是不用抗体对肿瘤靶细胞进行培养。
术语“补体-依赖型细胞毒性(CDC)”指在存在补体的情况下通过按照本发明的抗体对人肿瘤靶细胞的裂解。优选地，在补体存在下，通过用按照本发明的抗体对表达IGF-IR细胞的制剂进行处理来测量CDC。如果在4小时后，所述抗体在100nM的浓度上诱导20％或更多的肿瘤细胞裂解(细胞死亡)，发现CDC。优选地，以51Cr或Eu标记的肿瘤细胞以及测量释放的51Cr或Eu来进行分析。对照包括用补体而不用抗体来培养肿瘤靶细胞。
术语“IGF-I介导的信号转导的完全抑制”指IGF-I介导的对IGF-IR的磷酸化的抑制。对于这种分析，用IGF-I对IGF-IR表达细胞，优选地H322M细胞进行刺激，并用按照本发明的抗体进行处理(5nM的抗体浓度或更高是有效的)。随后，进行SDS PAGE，并且通过以特异于磷酸化的酪氨酸的抗体进行的蛋白质印迹法分析来测量IGF-IR磷酸化。如果在蛋白质印迹中，明显不能观察到指示磷酸化的IGF-IR的条带，则发现信号转导的完全抑制。
按照本发明的抗体显示与抗体18相同的结合于IGF-IR的表位，或者由于抗体18的结合的位阻，在与IGF-IR结合中被抑制。使用20-50nM浓度的固定化的抗体18和IGF-IR以及在100nM浓度上待检测的抗体通过SPR分析可以检测结合抑制。50％或更多的信号减少显示所述抗体与抗体18竞争。通过将抗体22用作固定化抗体，以相同的方式可以进行这种分析。
术语“表位”表示能够特异性地与抗体结合的蛋白质决定子。表位通常由分子的化学活性表面定群诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特异性三维结构特性，以及特异性电荷特性。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下，对前者的结合而不是后者的结合丢失。
此外，按照本发明的抗体包括具有不影响或改变按照本发明的抗体的上述特性的“保守性序列修饰”，核苷酸和氨基酸序列修饰的这类抗体。可以通过本领域已知的标准技术，诸如定点诱变技术和PCR介导的突变来引入修饰。保守性氨基酸置换包括其中以具有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基的那些。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中进行定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在人抗-IGF-IR抗体中，可以优选地用另一种来自相同侧链家族的氨基酸残基来取代预期的非必需氨基酸残基。
如在Riechmann，L.，等，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033中所描述的，可以通过基于分子模型的突变来进行氨基酸置换。
在本发明一个优选的实施方案中，按照本发明的抗体的特征还在于一个或多个选自组中的特性，所述组选自结合到与抗体18和22结合的相同表位上的结合参数ka，kd和KD，抑制IGF-I和IGF-II结合肿瘤细胞上IGF-IR的IC50值，和在肿瘤细胞中IGF-I刺激后，抑制IGF-IR磷酸化的IC50值。IGF-IR磷酸化的抑制导致下游元件诸如PKB的磷酸化的抑制，肿瘤细胞中的IGF-IR的下调，和在体外对肿瘤细胞三维生长的影响。优选地，所述抗体的特征还在于它们的药物代谢动力学和药物动力学值，以及对于其它物种的交叉-反应性。
按照本发明的抗体抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化并优选地也抑制PKB酪氨酸磷酸化到相似的程度。
按照本发明的抗体优选地在肿瘤细胞，和肿瘤例如异种移植的肿瘤中下调IGF-IR蛋白质水平。
按照本发明的抗体优选地在集落形成试验中抑制肿瘤细胞的三维生长以及IGF-IR表达细胞(例如NIH 3T3细胞)的增殖。
使用200nmol/l浓度的所述抗体，在胰岛素受体过量表达的3T3细胞的结合竞争分析中，优选地按照本发明的抗体不抑制胰岛素与胰岛素受体的结合。
优选地，通过重组方式产生按照本发明的抗体。在现有技术中普遍了解这些方法，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，抗体多肽的随后分离以及通常纯化到药用纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞象CHO细胞、NS0细胞，SP2/0细胞、HEK293细胞，COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行表达，并且从细胞中(上清液或裂解后的细胞)回收所述抗体。
抗体的重组制备在现有技术中众所周知，并且，描述于例如，Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Wemer，R.G，Drug Res.48(1998)870-880的综述文献中。
所述抗体可以存在于整个细胞中，细胞溶解产物中，或以部分纯化或基本纯化形式存在。通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳，以及其它本领域众所周知的技术来进行纯化以去除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞的核酸或蛋白质。见，Ausubel，F.，等，编辑Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley Interscience，New York(1987)。
在NS0细胞中的表达描述于例如Barnes，L.M.，等，Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270中。瞬时表达描述于例如Durocher，Y.，等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可变结构域的克隆描述于Orlandi，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)描述于Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，inCytotechnology 30(1999)71-83和Schlaeger，E.-J.，in J.Immunol.Methods194(1996)191-199中。
例如，适合于原核生物的调控序列，包括启动子、任选地操纵序列和核糖体结合部位。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
当核酸被置于与另外的核酸序列的功能性关联中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，其可操作地与编码序列连接；或如果将核糖体结合部位定位以促进翻译，其可操作地与编码序列连接。通常，“可操作地连接”意味着被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导区的情况中，是连续的，并且在阅读框中。但是，增强子不一定是连续的。通过在适宜限制性位点的连接反应来完成连接。如果这些位点不存在，依照常规惯例，使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化方法诸如，例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石(hydroxylapatite)层析、凝胶电泳、透析，或亲和层析来适当地从培养基中分离单克隆抗体。使用常规方法，容易对编码这些单克隆抗体的DNA和RNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可以作为这种DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如HEK 293细胞，CHO细胞或骨髓瘤细胞中以获得在宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过肽合成制备人IGF-IR抗体的氨基酸序列变体。但是，例如，如上所述的，可以仅在非常有限的范围内进行这些修饰。例如，这些修饰没有改变上述抗体特性诸如IgG同种型和表位结合，但是可以提高重组制备的产量、蛋白质稳定性或有利于纯化。
任何不涉及维持抗-IGF-IR抗体的正确构象的半胱氨酸残基还可以通常为丝氨酸所置换从而提高分子的氧化稳定性并且阻止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键加入抗体中以提高其稳定性(特别地在抗体是抗体片段诸如Fv片段处)。
抗体的另一种类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。所谓改变意味着缺失发现于抗体中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加在抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化典型地是N-连接的。N-连接指将碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，是将碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中，这些三肽序列中任何一个的存在产生潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列从而使其包含一个或多个上述三肽序列来方便地实现糖基化位点向抗体的添加(N-连接的糖基化位点)。
通过本领域已知的各种方法来制备编码抗-IGF-IR抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)分离或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变以及早期制备的变体或人源化的抗-IGF-IR抗体的非-变体形式的盒式诱变进行的制备。
本发明还涉及免疫缀合物，其包括与细胞毒性试剂诸如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)、放射性活性同位素(即放射性缀合物)或细胞毒性试剂的前体药物连接的按照本发明的抗体。上面已描述了有效用在产生这些免疫缀合物中的试剂。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、modeccin A链、α-八叠球菌、Aleuritesfordii蛋白质、dianthin蛋白质、Phytolaca americana蛋白质(PAPI，PAPII，和PAP-S)、momordicacharantia抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、gelonin、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。
使用许多双官能的蛋白质偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SRDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物；(诸如二甲基adipimidate HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(p-叠氮基苯甲酰基)已二胺)、二-重氮化衍生物(诸如二-(p-重氮化苯甲酰基)-ethylenediatnine)、二异氰酸酯(诸如tolyene 2，6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒性试剂的缀合物。例如，可以如在Vitetta，E.S.，等，Science 238(1987)1098-1104)中所描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。见WO 94/11026。
另一种类型的共价修饰包括化学地或酶促地使糖苷与抗体偶联。这些方法是有优势的，因为在具有糖基化能力的宿主细胞中，它们不需要产生N-或O-连接的糖基化抗体。取决于所使用的偶联模式，糖可以结合以(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，诸如半胱氨酸的那些，(d)游离的羟基基团诸如丝氨酸、苏氨酸、或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述在WO 87/05330，和在Aplin，J.D.，和Wriston，J.C.Jr.，CRCCrit.Rev.Biochem.(1981)259-306中。
可以通过化学地或酶促地方法来完成对存在于抗体上的任何碳水化合物部分的去除。化学去糖基化需要使抗体与化合物三氟甲磺酸或等价化合物接触。这种处理导致了除了连接的糖(N-乙酰氨基葡糖或N-乙酰半乳糖胺)的大多数或所有的糖的裂解，而使抗体是完整的。化学去糖基化在Sojahr，H.T.，和Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge，A.S.，等Anal.Biochem.118(1981)131-137中有所描述。如在Thotakura，N.R.，和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359中所描述的，可以通过使用许多内和外糖苷酶来完成抗体上碳水化合物部分的酶促裂解。
抗体共价修饰的另一种类型包括以在美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中提到的方式使抗体与许多非蛋白质(nonproteinaceous)聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯连接。
在另一个方面，本发明提供分离自转基因非-人动物，例如转基因小鼠的B-细胞，其表达按照本发明的人抗IGF-IR抗体。优选地，分离的B细胞从转基因的非人动物，例如，转基因小鼠中获得，已经使用纯化的或富集的IGF-IR抗原的制剂和/或表达IGF-IR的细胞对小鼠进行了免疫。优选地，转基因的非人动物，例如转基因小鼠，具有基因组，所述基因组包含编码本发明抗体的所有或部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后，将分离的B细胞进行无限增殖化以提供人抗-IGF-IR抗体的来源(例如，杂交瘤)。因此，本发明还提供能产生按照本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括从转基因的非人动物，例如转基因小鼠中获得的与无限增殖化细胞融合的B细胞，所述转基因小鼠具有包含编码本发明抗体的所有或部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。
在一个具体实施方案中，所述转基因的非人动物是转基因小鼠，其具有包含编码本发明抗体的全部或部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。可以使用IGF-IR抗原的纯化或富集制剂和/或表达IGF-IR的细胞来对转基因的非人动物进行免疫。优选地，转基因非人动物，例如转基因小鼠能够产生针对IGF-IR的人单克隆抗体的IgG1同种型。
可以通过用纯化的或富集的IGF-IR抗原制剂和/或表达IGF-IR的细胞对转基因的非人动物，例如转基因小鼠进行免疫来制备按照本发明的人单克隆抗体，所述转基因小鼠具有包含编码本发明抗体的全部或部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。然后获得动物的B细胞(例如，脾的B细胞)，并且将其与骨髓瘤细胞融合以形成永生化的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌针对IGF-IR的人单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，使用携带部分的人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠，可以产生针对IGF-IR的人单克隆抗体。这些在本文称作“HuMAb”小鼠的转基因小鼠，包含编码未重排的人免疫球蛋白基因的人免疫球蛋白基因miniloci，所述未重排人免疫球蛋白基因包括重链(μ和γ)和κ轻链(恒定区基因)以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg，N.，等，Nature 368(1994)856-859)。因此，所述小鼠显示了小鼠IgM或K的减少的表达，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性的人IgG单克隆抗体(Lonberg，N.，等，Nature 368(1994)856-859；综述于Lonberg，N.，Handbook ofExperimental Pharmacology 113(1994)49-101；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intem.Rev.Immunol.25(1995)65-93；和Harding，F.，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci 764(1995)536-546)。HuMAb小鼠的制剂描述于Taylor，L.，等，Nucleic Acids Research 20(1992)6287-6295；Chen，J.，等，InternationalImmunology 5(1993)647-656；Tuaillon，N.，等，Proc.Natl.Acad.Sci USA90(1993)3720-3724；Choi，T.K.，等，Nature Genetics 4(1993)117-123；Chen，J.，等，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.，等，Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.，等，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook ofExperimental Pharmacology 113(1994)49-101；Taylor，L.，等，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F.，和Lonberg；N.，Ann.N.Acad.Sci 764(1995)536-546；Fishwild，D.M.，等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851，特此将其全部内容并入作为参考。另外见，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO 98/24884；WO 94/25585；WO 93/1227；WO 92/22645；和WO 92/03918。
为了完全产生针对IGF-IR的人单克隆抗体，可以按照如Lonberg，N.，等，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.，等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884所描述的常规方法，使用纯化的或富集的IGF-IR抗原的制剂和/或表达IGF-IR的细胞对HuMAb小鼠进行免疫。优选地，初次免疫时，小鼠在6-16周龄。例如，可以使用纯化的或富集的可溶性IGF-IR抗原的制剂(例如，从表达IGF-IR的细胞中纯化的)对HuMAb小鼠进行腹膜内地免疫。在使用纯化的或富集的IGF-IR抗原制剂进行免疫没有产生抗体的情况下，还可以使用表达IGF-IR的细胞，例如肿瘤细胞系免疫小鼠以促进免疫应答。使用各种抗原进行的积累经验已经显示当用完全弗氏佐剂中的抗原进行初始腹膜内地免疫(i.p.)，随后每隔一星期用不完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内地免疫(i.p.)时(例如，多至总数6次)，HuMAb转基因小鼠应答最佳。采用眶后采血获得的血浆样品，在免疫流程过程中可以监控免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆，并且可以使用具有足够效价的抗-IGF-IR人免疫球蛋白的小鼠进行相应B细胞的无限增殖化。可以在处死和去除脾和淋巴结前3-4天用抗原进行静脉内激发小鼠。预期对于每个抗原，可能需要进行2-3次的融合。将用每种抗原对一些小鼠进行免疫。例如，可以对总共12个HCo7和HCo12株系的HuMAb小鼠进行免疫。
所述HCo7小鼠具有在它们的内源轻链(kappa)基因中JKD断裂(如描述于Chen，J.，等，EMBO J.12(1993)821-830)，在它们的内源重链基因中CMD断裂(如在WO 01/14424的实施例1中所描述的)，KCo5人kappa轻链转基因(如在Fishwild，D.M.，等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所描述的)，和HCo7人重链转基因(如在美国专利号5,770,429中所描述的)。
所述HCo12小鼠具有在它们的内源轻链(kappa)基因中JKD断裂(如描述于Chen，J.，等，EMBO J.12(1993)821-830)，在它们的内源重链基因中CMD断裂(如在WO 01/14424的实施例1中所描述的)，KCo5人kappa轻链转基因(如在Fishwild，D.M.，等，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所描述的)，和HCo12人重链转基因(如在WO 01/14424的实施例2中所描述的)。
基于标准方案可以分离小鼠淋巴细胞并且使用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。然后对得到的杂交瘤进行抗原特异性抗体产生的筛选。例如，用50％PEG将来自免疫小鼠的脾和淋巴结源的淋巴细胞的单细胞混悬液与1/6量的SP 2/0非分泌的小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)进行融合。将细胞以约2×105接种于平底微量滴定板中，随后在选择性培养基中培养约2个星期。
然后，通过ELISA对每个孔进行人抗-IGF-IR单克隆IgM和IgG抗体的筛选。一旦大量杂交瘤生长发生，通常在10-14天后，分析培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新接种、再次筛选并且如果对于人IgG仍旧是阳性的，可以通过有限稀释将抗-IGF-IR单克隆抗体进行至少两次的亚克隆。然后，在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生抗体进行特征鉴定。
因为CDR序列负责抗体-抗原相互作用，通过在来自不同人抗体的框架序列上构建包括按照本发明的CDR序列的表达载体来表达依照本发明的重组抗体是可能的(见，例如，Riechmann，L.，等，Nature 332(1998)323-327；Jones，P.，等，Nature 321(1986)522-525；和Queen，C.，等，Proc.Natl.Acad.见U.S.A.86(1989)10029-10033)。可以从公共DNA数据库中获得这种包括种系人抗体基因序列的框架序列。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为它们不包括在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成的完全装配的可变基因。在个体均匀地跨越可变区上，种系基因序列也不同于高亲和性的次级所有组成成分抗体的序列。
本发明优选地包括编码与IGF-IR结合的多肽的核酸片段，其中所述多肽抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合，所述多肽选自由下列组成的组a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
重新构建的重链和轻链可变区与启动子序列，翻译起始点，恒定区，3′未翻译的，多聚腺苷酸和转录终止子(termination)结合以形成表达载体构建物。重链和轻链表达构建物可以与单一载体结合，并且共转染、连续转染或分别转染到宿主细胞，然后将其融合以形成表达两条链的单一宿主细胞。
因此，本发明提供一种制备按照本发明的重组人抗体的方法，其特征在于表达核酸，所述核酸编码a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
本发明还包括优选地通过免疫分析来将按照本发明的抗体用于体外诊断IGF-IR的应用，所述免疫分析确定在样品的IGF-IR和按照本发明的抗体之间的结合。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，例如，药物组合物，其包含与药用载体一起配制的本发明的一个或组合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
还可以在组合疗法中，即与其它试剂结合来施用本发明药物组合物。例如，组合疗法可以包括本发明的组合物与至少一种抗肿瘤试剂或其它常规疗法组合。
“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂的实例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(″Ara-C″)、环磷酰胺、塞替派、泰索帝(多西他赛)、白消胺、吉西他滨、Cytoxin、泰素、甲氨蝶呤，顺铂、美法仑、长春碱，博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、Vincreistine、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺红霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素(Mitomycins)、Esperamicins(见美国专利号4,675,187)、美法仑和其它相关的氮芥。
用于本文时，术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞损伤的物质。该术语倾向于包括放射性同位素、化疗剂和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段。
用于本申请时，术语“前体药物”指与亲本药物相比对肿瘤细胞具有较少细胞毒性的药用活性物质的前体或衍生物形式，并且其能够被酶促地活化或转化为更有活性的亲本形式。见，例如，Wilman，″Prodrugs in CancerChemotherapy″Biochemical Society Transactions，14，375-382页，615thMeeting Belfast(1986)，和Stella等，″ProdrugsA Chemical Approach toTargeted Drug Delivery，″Directed Drug Delivery，Borchardt等，(编辑)，247-267页，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括，但不限于含磷酸盐(酯)的前体药物、含硫代磷酸盐(酯)的前体药物、含硫酸盐(酯)的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、β-内酰胺环前体药物，包含任何取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯乙酰胺的前体药物，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可以被衍生为用在本发明中的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述的那些化疗剂。
用于本文时，“药用载体”包括生理适合的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通过注射或灌输)。
“药用盐”指保留抗体的所需的生物学活性并不带来任何不需要的毒理作用的盐(见例如，Berge，S.M.，等，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。将这些盐包括在本发明中。这些盐的实例包括酸式加成盐和碱式加成盐。酸式加成盐包括从非毒性无机酸衍生的那些，诸如盐酸盐。
通过许多本领域已知的方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。
为了通过某些施用路径来施用本发明化合物，用一种材料来包被化合物，或与一种材料共同施用化合物以预防其失活可能是必需的。例如，可以以适当载体，例如脂质体或稀释剂来给受试者施用所述化合物。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
药用载体包括用于即时制备灭菌的可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。将这些介质和试剂用于药用活性物质的应用为本领域所知。
在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的、胸骨内的注射和灌输。
这些组合物还可以包含佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌方法以及加入各种抗细菌和抗真菌试剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等都可以确保预防微生物的存在。将等渗试剂，诸如糖、氯化钠等包括在组合物中也可能是理想的。此外，通过将延缓吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶加入可导致可注射的药用形式的延长吸收。
无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药用剂型。
对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所用的特定化合物结合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史和医学领域众所周知的类似因素。
所述组合物必须是无菌且流体的，以到达组合物可以通过注射器进行传递的程度。除了水之外，载体优选是等渗缓冲盐溶液。
例如，通过应用涂层诸如磷脂酰胆碱，通过在分散状况下维持所需的颗粒大小，以及通过表面活性剂的使用可以保持适当的流动性。在许多情况中，将等渗试剂，例如，糖，多元醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化钠包括在组合物中是优选的。
提供下列实施例、参考文献、序列表和附图以协助理解本发明，在后附的权利要求中要求其实际范围。要理解的是可以在不背离本发明精神的情况下在提出的方法中进行修改。
序列表描述SEQ ID NO1-4抗体18和22的轻链和重链可变区结构域的核苷酸和氨基酸序列
SEQ ID NO5和6人不变区结构域的核苷酸和氨基酸序列附图简述
图1在低和高密度细胞培养物中的IGF-IR表面表达。
图2在3D培养物中进行的增殖抑制的WST分析(NCI H322M细胞)。
图3在3D培养物中进行的增殖抑制的集落形成试验(显微相片)图4在3D培养物中进行的增殖抑制的集落形成试验(量化)ctr＝对照；C1 18＝抗体18图5抗体18和22对I125-IGF-I与HT29细胞结合的抑制(IC50值)。
图6.抗体18对I125-IGF-II与HT29细胞结合的抑制。
图7抗体αIR3对I125-IGF-II与HT29细胞结合的抑制。
图8 IGF-I的阻遏诱导IGF-IR和Akt/PkB的磷酸化。
图9抗-hlGF-1R抗体对I125-胰岛素与3T3-IR细胞的结合没有抑制。(MAX w/o AbI125-胰岛素的最大结合；MIN与1μM胰岛素竞争后的最小结合)图10 AK18对IGF-IR过量表达3T3细胞没有刺激活性。
图11 AK18对人肿瘤细胞(HT29)没有刺激活性图12抗体18在体外对暴露在H322N细胞表面上的IGF-IR的下调图13用AK18进行处理，初始肿瘤体积图14存在或不存在吉西他滨时，用AK18进行处理图15用AK18处理，初始肿瘤体积实施例1产生抗-IGF-IR抗体的杂交瘤细胞系的产生杂交瘤的培养将产生的HuMAb杂交瘤于37℃和5％CO2在添加了2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)和4％Origen克隆因子(Igen，France)的杂交瘤表达培养基(PAA实验室GmbH，Austria)中培养。
转基因小鼠的免疫方法用1×106NIH 3T3细胞对10只HCo7转基因小鼠(4只雄性和6只雌性)，品系GG2201(Medarex，SanJosé，CA，USA)进行轮流免疫，用IGF-IR的表达载体和20μg的可溶性胞外IGF-IR的结构域对其进行转染。共进行6次免疫，3次用IGF-IR表达细胞进行腹膜内的(IP)免疫，3次在尾基(tail base)用重组蛋白进行皮下(SC)免疫。对于第一次免疫，将100μl的1×106NIH 3T3 IGF-IR细胞与100μl的完全弗氏佐剂(CFA；Difco实验室，Detroit，USA)混合。对于所有其它的免疫，使用100μl的在PBS中的细胞或将重组蛋白与100μl不完全弗氏佐剂(ICFA；Difco)混合。
抗原特异性ELISA通过抗原特异性ELISA来确定免疫小鼠的血清中的抗-IGF-IR效价。将以1μg/ml浓度的在PBS中的IGF-IR可溶性胞外结构域包被在96孔板上，于4℃过夜或者于37℃2小时。其后，用PBSTC(添加了0.05％Tween-20和2％鸡血清(Gibco BRL)的PBS)将孔于室温封闭1小时。将首次穿刺血清(tap sera)在PBSTC中以1/50稀释，将来自所有其它穿刺的血清在PBSTC中预稀释1/100并且连续稀释到1/6400。将稀释的血清加入孔中并且在37℃温育1小时。将预穿刺的血清用作阴性对照。将200ng/ml的山羊抗-人IGF-IR(100μg/ml)用作阳性对照。随后，将板用PBST洗涤2次并且用在PBSTC中稀释1/2000的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的大鼠抗人IgG F(ab′)2(DAKO)于37℃温育1小时。将孔用PBST洗涤两次并且用新鲜制备的ABTS溶液(1mg/ml)(ABTS2，2’-连氮基二(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸))避光于室温(RT)显影30分钟进行分析。在405nm测量吸光度。
FACS分析除了通过抗原特异性ELISA测定外，免疫小鼠血清中的抗-IGF-IR效价还通过FACS分析进行测定。用稀释血清于4℃温育NIH 3T3 IGF-IR细胞和未被转染的NIH 3T3 IGF-IR细胞30分钟。将预穿刺的血清用作阴性对照。最初，将200ng/ml山羊抗-人IGF-IR用作阳性对照。将细胞在添加了1％牛血清白蛋白和0.01％叠氮化物的PBS中洗涤3次。随后，用在FACS缓冲液中以1/100稀释的大鼠抗-人人IgG的异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗原结合片段(F(ab′)2片段)于4℃温育细胞30分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并且将样品在FACS Calibur上分析(Becton Dickinson，Erembodegem-Aalst，Belgium)。
小鼠的加强免疫当发现抗-IGF-IR的血清效价是足够的时候，在融合前4和3天，用在200μl PBS中的15μg的IGF-IR胞外结构域对小鼠进行另外的静脉内(i.v.)加强免疫两次。
杂交瘤产生将小鼠处死，并且收集腹主动脉和腔静脉旁侧的脾和淋巴结。按照标准操作方法进行脾细胞和淋巴结细胞与融合配偶体SP 2.0细胞的融合。
κ-ELISA为了确定融合产生的杂交瘤是否产生人抗体，进行了κ-ELISA。用在PBS中稀释1/10000的大鼠抗-人IgGκ轻链抗体(DAKO)通过4℃温育过夜包被ELISA板。在丢弃孔后，通过用PBSTC于室温温育1小时来封闭板。其后，将孔用在PBSTC中1/2稀释的杂交瘤培养物上清液温育。将在PBSTC中1/2稀释的培养基用作阴性对照，将在PBSTC中1/100稀释的κ-链阳性小鼠血清用作阳性对照。其后，将孔洗涤三次并且用在PBSTC中稀释1/2000的HRP缀合的大鼠抗-人IgG F(ab′)2(DAKO)于37℃温育1小时。将孔洗涤3次，并且用新鲜制备的ABTS溶液(1mg/ml)避光于室温(RT)显影30分钟进行分析。以ELISA板阅读器在405nm上测量吸光度。
制备单克隆抗体18和22。
实施例2测定抗-IGF-IR抗体与IGF-IR的亲和性仪器BIACORE3000芯片CM5
偶联胺偶联缓冲液HBS(HEPES，NaCl)，pH 7.4，25℃对于亲和性测试，已经将抗人FCγ抗体(来自兔)与存在针对IGF-IR的抗体的芯片表面偶联。以各种浓度将IGF-IR胞外结构域添加到溶液中。通过IGF-IR注射3分钟来测量关联性；通过用缓冲液洗涤芯片表面5分钟来测量解离。将抗体18和22的亲和性数据显示于表1中。
表1通过SPR(BIACORE3000)测量的亲和性数据
实施例3在细胞-细胞-接触(3D培养)上的肿瘤细胞的三维生长和IGF-I受体的过度表达材料和方法将NCI H322M细胞以低密度或超汇合培养于光学级别的玻璃盖载玻片上的RPMI培养基中从而研究在IGF-IR表面表达上的作用。平行地，将分离自对照组(未处理的小鼠)的H322M异种移植组织在异戊烷中休克冷冻，将冷冻切片切成5μm的厚度。使用鼠-抗IGF-IR单克隆抗体(αIR3，5μg/ml)或按照本发明的抗体，随后用山羊抗-小鼠-抗体或用Cy3(Amersham Biosciences，GB)或Alexa Fluor488(Molecular Probes，Inc.，USA)标记的山羊抗-小鼠-抗体进行免疫荧光标记。将标本在Leica SP2共焦显微镜上成像或通过FACS进行分析。
结果当以高密度培养的H322M细胞通过共焦显微镜成像时，在细胞-细胞接触部位的IGF-IR特异性地聚簇变得明显。当与体内生长的H322M细胞即异种移植组织比较时，就表面IGF-I受体的组织而言，与浓密包裹的体外培养物具有令人惊奇的相似性。
在H322M细胞的超汇合培养物中的表面IGF-I受体的上调也通过FACS进行定量。与在低密度没有明显的细胞-细胞接触的条件下比较，当细胞在高密度条件下生长时，IGF-I受体表面表达增加了超过10倍。
其它的肿瘤细胞诸如HT29、MDA231和MCF-7显示了相似的行为，这说明在建立细胞-细胞接触部位后，IGF-I受体在细胞表面上的上调不是H322M细胞的独特特性而似乎是更多组织如也在体内发现的组织的一般特性(图1)。
实施例4在用抗体18处理下在3D培养物中表达IGF-IR的H322M肿瘤细胞的生长抑制(WST-测定)将H322M细胞培养于在聚-HEMA(聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯))包被的皿上的RPMI 1640/0.5％FCS培养基中以预防与塑料表面的粘附。在这些条件下，H322M细胞形成三维生长的浓密球状体(称为贴壁不依赖性的特性)。这些球状体接近地类似于原位的固体肿瘤的三维组织结构和组织。在存在从0-240nM增加量的抗体的情况下将球状体培养物培养5天。将WST转化测定用于测量生长抑制。当用不同浓度的抗体18(1-240nM)处理H322M球状体培养物时，可以观察到在生长中的剂量依赖型抑制(图2)。
实施例5在3D培养物中表达IGF-IR的H322M肿瘤细胞的生长抑制(集落形成分析)将H322M细胞培养于在聚-HEMA包被的皿上的RPMI 1640/10％NCS培养基中以预防与塑料表面的粘附。在这些条件下，H322M细胞形成三维生长的浓密球状体(称为贴壁不依赖性的特性)。这些球状体代表原位的固体肿瘤的三维组织结构和组织。在存在从0-7.5μg/ml的增加量的抗体的情况下，将这些球状体培养物培育5-10天。将<HBV>单克隆抗体用作阴性对照。在利用相差的倒置显微镜(Zeiss Axiovert)上使集落成像并使用自动成像系统(MetaMorph)进行计数。当用不同浓度(0.5-7.5μg/ml)的抗体18对H322M球状体培养物进行处理时，可以观察到生长中的剂量依赖型抑制，而对照抗体<HBV>具有微小或没有作用。集落的数目和大小在用7.5μg/ml的抗体18处理的培养物中明显地减少(图3)。
对直径大于100μm的集落的量化分析揭示集落的数目在用0.5μg/ml的抗体18处理的培养物中减少了约66％(图4)。
实施例6对IGF-I和IGF-II结合表达IGF-IR的肿瘤细胞的抑制为了测定本发明抗体阻遏配体IGF-I和IGF-II结合IGF-I受体(IGF-IR)的能力，用放射性标记的配体肽进行竞争实验。
将人肿瘤细胞(HT29，NCI H322M，0.5-1×105/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸钠(Gibco，Cat.No.11360-039)和10％热灭活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。对于每个实验，在各自培养基中，将20ml细胞接种于六个T175形式的瓶并于37℃和5％CO2下培养两天以获得汇合的单细胞层。
为了收集个体细胞，加入2ml的1×胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175烧瓶并用Zeiss Axiovert 25显微镜监测细胞的脱附。收集细胞并如前所述将具有10％FCS的培养基加至总体积50ml。通过于1000rpm离心10分钟(Heraeus sepatech，Omnifuge 2.0RS)重新分离细胞并重悬于50ml的结合缓冲液中(120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM MgSO4，1mM EDTA，10mM D(+)葡萄糖，15mM NaAc，100mM Hepes pH 7.6，1％BSA)。对细胞进行计数，通过离心重新分离并用结合缓冲液调整到1×106细胞/ml。
将溶于0.1％CH3COOH的I125标记的IGF-I和IGF-II肽(Amersham，～2000Ci/mmol，Cat.No.IM172和IM238)在结合缓冲液中稀释到最终活性4×105计数/(分钟×ml)。将75μl特定浓度的抗体与25μl预稀释的I125标记的IGF-I或IGF-II肽一起加入到200μl的细胞混悬液中并于4℃温育3，5小时。通过于2000rpm(Eppendorf，5415C)离心5分钟重新分离细胞并去除上清液。在1ml结合缓冲液中洗涤两次后，将细胞重悬于1ml结合缓冲液中并转移到闪烁管中。在闪烁计数器上测量结合到细胞表面受体上的放射性肽的量。
得到的IC50的曲线示于图5和6中，所述IC50曲线表明抗体抑制IGF-I和IGF-II肽结合IGF-I受体的能力。抗体18的IC50的平均值是0.3nM。对于抗体αIR3的结果示于图7中。没有观察到对于IGF-II结合的可检测的抑制。
实施例7IGF-IR结合的抗体竞争分析对于抗IGF-IR单克隆抗体的表位图谱，选择与亲和性测量(实施例2)相似的形式，但是以在溶液中的抗体于室温将IGF-IR预培养至少0.5小时。注射该混合物并检测IGF-IR的结合(或抑制)。这种测定容许测量关于IGF-IR结合的单克隆抗体的交互抑制活性。发现本发明的抗体与αIR3竞争和IGF-IR的结合，已知所述αIR3是一种与217-274氨基酸结合的抗体(Gustafson，T.A.，和Rutter，W.J.，J.Biol.Chem.265(1990)18663-18667)。
实施例8IGF-IR和Akt/PKB的IGF-I介导的磷酸化的抑制为了测定本发明抗体抑制IGF-I受体(IGF-IR)的活化和磷酸化的能力，以IGF-I肽进行竞争实验和随后用特异于磷酸化酪氨酸的抗体进行蛋白质印迹分析。
将人肿瘤细胞(HT29，NCI H322M，5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸钠(Gibco，Cat.No.11360-039)和0.5％热灭活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。为了测定IC50值，对于每个实验，在各自的培养基中，将1ml细胞接种12孔板并于37℃和5％CO2下培养2天。
用低血清培养基培养48小时之后，小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。于37℃和5％CO2中温育5分钟后，以2nM的终浓度加入IGF-I肽并在上面所述的条件下将细胞再次温育10分钟。通过抽吸小心去除培养基并加入100μl/孔的冷裂解缓冲液(50mMHepes pH 7.2，150mM NaCl，1mM EGTA，10％甘油，1％Triton-X100，100mM NaF，10mMNa4P2O7，Complete蛋白酶抑制剂)。用细胞刮器(Coming，Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟去除细胞片段并以1∶1(v/v)的比例将一半的上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。对于IGF-IR的免疫沉淀，将细胞裂解物的剩余上清液进行清除性离心(于13000rpm和4℃10分钟)，随即(right before)加入1μl的针对IGF-IRβ的多克隆抗体(C-20，Santa Cruz Biotechnologies)，或鼠单克隆抗体(IgG1)(mAb，24-55，GroPep)，所述单克隆抗体识别在人IGF类型1受体中的胞外结构域(α链)的氨基酸440-586中的表位。在转动的Eppendorf反应管中于4℃温育2小时后，加入25μl Protein G Sepharosee珠(Amersham Biosciences，Cat.No.17-0618-01)，随后于4℃进行另一次1小时的温育步骤。通过离心(于2000rpm和4℃1分钟)分离具有结合抗体-蛋白质-络合物的珠并用洗涤缓冲液(只具有0.1％Trito-X100的裂解缓冲液)洗涤三次。在将珠于Laemmli样品缓冲液中煮沸后，通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRANBA 85，Schleicher &Schuell)。
利用一种磷酸酪氨酸特异性抗体(Upstate，clone 4G10，Cat.No.05-321)测定免疫纯化的IGF-IR的磷酸化状态。为了检测磷酸化的Akt/PKB，应用一种具有对于磷酸化的Ser473的特异性的抗体(Cell Signalling，Cat.No.9271)。
将观察到的IGF-I诱导的IGF-IR和Akt/PKB的磷酸化作用的阻遏示于图8中。
实施例9体外诱导抗体介导的IGF-IR的下调为了检测本发明抗体对于肿瘤细胞中IGF-I受体(IGF-IR)量的效应，进行时程实验和随后使用IGF-IR特异性抗体的蛋白质印迹分析。
将人肿瘤细胞(HT29，5×104细胞/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸钠(Gibco，Cat.No.11360-039)和10％热灭活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。对于每个实验的每个温育时期，在各自的培养基中，将1ml细胞接种一个12孔板并于37℃和5％CO2中培养24小时。
小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。在两个对照孔中，将培养基替代以没有抗体的培养基或具有对照抗体(AB-1，Oncogene，Cat.No.GR11)的培养基。将细胞于37℃和5％CO2中培养并在15分钟、24小时和48小时后将单个板取出进行进一步处理。
通过抽吸小心去除培养基并且每孔加入100μl的冷裂解缓冲液(50mM Hepes pH 7.2，150mM NaCl，1mM EGTA，10％甘油，1％Triton-X100，100mM NaF，10mM Na4P2O7，Complete蛋白酶抑制剂)。使用细胞刮器(Corning，Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟去除细胞片段并以1∶1(v/v)的比例将上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRANBA 85，Schleicher & Schuell，Cat.No.10401196)。
利用特异于IGF-IR的抗体(C-20，Santa Cruz Biotechnologies，Cat.No.sc-713)测定IGF-IR的蛋白质水平。
在加入抗体之后不到24小时观察到由本发明抗体诱导的IGF-IR的下调。
实施例10抑制胰岛素结合表达人胰岛素受体的3T3细胞为了测定本发明的抗体是否也阻遏胰岛素结合胰岛素受体(IR)，用放射性标记的配体肽进行竞争实验。
将表达重组高数目(＞105)的人IR的3T3细胞(1×105/ml)接种于具有高葡萄糖(PAA，Cat.No.E15-009)的MEM Dulbecco培养基(DMEM)中，所述培养基添加了2mM L-谷氨酰胺(Gibco，Cat.No.25030-024)和10％热灭活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。对于每个实验，在各自的培养基中，将20ml细胞接种于六个T175形式的瓶中，并于37℃和5％CO2中培养两天以获得汇合的单细胞层。
为了收集个体细胞，加入2ml的1×胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175烧瓶并用显微镜监测细胞的脱附。收集细胞并如前所述将具有10％FCS的培养基加至总体积50ml。通过于1000rpm离心10分钟重新分离细胞并重悬于50ml的结合缓冲液中(120mM NaCl，5mMKCl，1.2mM MgSO4，1mM EDTA，10mM D(+)葡萄糖，15mM NaAc，100mM Hepes pH 7.6，1％BSA)。对细胞进行计数，通过离心重新分离并用结合缓冲液调整到1×106细胞/ml。
将溶于0.1％CH3COOH的I125标记的胰岛素肽(Amersham，Car.No.IM166～2000 Ci/mmol)在结合缓冲液中稀释到最终活性4*105计数/(分钟*ml)。将75μl抗体与25μl预稀释的I125标记的胰岛素肽一起加入到200μl的细胞混悬液中(最终抗体浓度200nM)并于4℃温育3，5小时。通过于2000rpm离心5分钟重新分离细胞并去除上清液。在1ml结合缓冲液中洗涤两次后，将细胞重悬于1ml结合缓冲液中并转移到闪烁管中。在闪烁计数器上测量结合到细胞表面受体上的放射性肽的量。
结果表明本发明的抗体并不干扰胰岛素配体结合胰岛素受体(图9)。
实施例11对IGF-IR和Akt/PKB磷酸化没有刺激为了将本发明抗体的IGF-IR刺激活性排除在外，在缺乏IGF-I配体而存在本发明抗体和参比抗体(αIR3，Oncogene，Germany)时，确定IGF-IR的磷酸化。这通过用磷酸化状态的特异性抗体进行蛋白质印迹分析来实施。将用IGF-IR转染的3T3细胞(ATCC CRL 1658)(5*104细胞/ml，Pietrzkowski，Z.，et al.，Cell Growth Differ.4(1992)199-205)接种在具有高葡萄糖(PAA，CatNo.E15-009)并补充以2mM L-谷氨酰胺(Gibco，CatNo.25030-024)和0.5％热灭活的FCS(PAA，CatNo.A15-771)的MEM Dulbecco培养基(DMEM)中或将人肿瘤细胞(HT29，NCI h322M 5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述RPMI 1640培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸钠(Gibco，Cat.No.11360-039)和0.5％热灭活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。为了测定IC50值，对于每个实验，在各自的培养基中，将1ml细胞接种12孔板并于37℃和5％CO2下培养2天。
用低血清培养基培养48小时之后，小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。在上述条件下，将细胞温育15分钟。通过抽吸小心去除培养基并加入100μl/孔的冷裂解缓冲液(50mM HepespH 7.2，150mM NaCl，1mM EGTA，10％甘油，1％Triton-X100，100mMNaF，10mM Na4P2O7，CompleteTM蛋白酶抑制剂)。用细胞刮器(Coming，Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟(Eppendorf离心机5415R)去除细胞片段并以1∶1(v/v)的比例将一半的上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。对于IGF-IR的免疫沉淀，将细胞裂解物的剩余上清液进行清除性离心(于13000rpm和4℃10分钟)，随即(right before)加入1μl的针对IGF-IR的抗体(C-20，Santa Cruz Biotechnologies，CatNo.sc-713或mAb 24-55，GroPep，CatNo.MAD1)。在转动的Eppendorf反应管中于4℃温育2小时后，加入25μl Protein G SepharoseTM珠(Amersham Biosciences，Cat.No.17-0618-01)，随后于4℃进行另一次1小时的温育步骤。通过离心(于2000rpm和4℃1分钟)分离具有结合抗体-蛋白质-络合物的珠并用洗涤缓冲液(只具有0.1％Triton-X100的裂解缓冲液)洗涤三次。在将珠于Laemmli样品缓冲液中煮沸后，通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRAN BA 85，Schleicher &Schuell，CatNo.10401196)。
将磷酸酪氨酸特异性抗体(Upstate，克隆4G10，CatNo.05-321，识别酪氨酸磷酸化的蛋白质)用于测定免疫纯化的IGF-IR的磷酸化状态。为了检测磷酸化的Akt/PKB，应用一种针对Akt1特异于磷酸化的丝氨酸473的抗体(cell signaling，CatNo.9271)。
观察到在IGF-IR发信号途径中的Akt/PKB激酶下调明显地被以高于5nM浓度的参比抗体激活，但是没有被在多至10.000nM浓度上的本发明抗体激活。结果显示于图10和11(HM＝具有0.5％FCS的低血清培养基，HM+IGFI＝具有0.5％FCS和10nM hIGF-I的低血清培养基)。
实施例12在H322M异种移植模型中诱导受体下调在裸鼠中诱导肿瘤并以不同浓度的本发明抗体处理1次。在处理24小时后，提取肿瘤并在液氮下进行匀浆。以3∶1的缓冲液体积对肿瘤重量比例加入冷裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.2，150mM NaCl，1mM EGTA，10％甘油，1％ Triton-X100，100mM NaF，1mM Na3VO4，10mM Na4P2O7，CompleteTM蛋白酶抑制剂，1mM PMSF)并与融解的肿瘤匀浆一起充分混合。在冰上溶解组织15分钟后，通过于13000rpm和4℃离心(Eppendorf离心机5415R)10分钟去除不可溶的片段。用Micro BCATMReagents(Pierce)测定样品的蛋白质浓度并加入裂解缓冲液以调节相等的浓度。将部分上清液以1∶1(v/v)的比例加入到2×Laemmli样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRANBA 85，Schleicher & Schuell，Cat.No.10401196)。利用IGF-IR特异性抗体(C-20，Santa Cruz Biotechnologies，Cat.No.sc-713)检测IGF-IR。
用本发明的抗体处理后，我们观察到浓度依赖型的IGF-IR水平的减少，估计的EC50为0.6mg/kg(图12)。
实施例13Clq结合ELISA介绍为了测定按照本发明的抗体固定Clq的能力，使用一种ELISA方法。Clq是适应性免疫系统的部分，并且在结合免疫络合物后，引发几种酶原的顺序激活。所述酶依次引发C3分子的剪切，这可以导致炎性反应的发作，外源或异常颗粒的调理和细胞膜的裂解。
大体而言，用浓度范围的抗体包被ELISA板，其加入了人Clq。通过一种针对人Clq的抗体，随后通过一种过氧化物酶标记的缀合物检测Clq结合。
材料和方法以10，5，1和0.5μg/ml的浓度对抗体18，8和23以及对照抗体进行检验。表1显示被测样品的特异性。作为阴性对照，使用非常微弱地结合C1q的人IgG4(CLB，贮存液0.5μg/ml)。结合人IgG1作为阳性对照。使用具有2μg/ml浓度的人Clq贮存液。对于Clq的检测，使用一种针对Clq的兔抗体(Dako)和一种缀合了辣根过氧化物酶的抗兔IgG抗体(Sigma)。
计算和曲线拟合使用Graphpad Prism软件利用非线性回归曲线拟合(一个位点结合)确定关于所测试的HuMAb的最大结合(Bmax)的计算。
结果按照本发明的抗体显示人Clq蛋白的剂量依赖性结合。相对于HuMAb浓度绘出于405nm的光密度(OD405nm)并利用非线性回归对曲线进行拟合。如对于每个值的曲线的相关系数(R2)和标准偏差，最大结合(Bmax)的最佳拟合值列于表2中。最低的相关系数具有0.950的值(IgG4)。具有0.279的最大结合的人IgG4(阴性对照)显示Clq的最小结合。分别如1.729和2.223的最大结合所示，阳性对照IgG1和IgG3都结合Clq。
表2在Clq结合ELISA(n＝3)中测试的HuMAb的最大结合(Bmax)
还列出了相关系数(R2)和标准偏差。
与人IgG4(阴性对照，O.D.为0.279)的Clq结合相比，所有测试抗体都等同地能够固定Clq。
实施例14由抗IGF-IR HuMAbs测定抗体介导的效应子功能为了测定产生的HuMAb抗体激发免疫效应器机制的能力，进行补体依赖性的细胞毒性(CDC)和抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)研究。
为了研究CDC(National Cancer Institute，肺腺癌细胞系)，用100μCi51Cr(Amersham Pharmacia Biotech，UK，Cat CJS11)对H322M，H460和NIH3T3细胞(2-6×106)进行标记45-120分钟。标记之后用40ml PBS将细胞洗涤两次并于1500rpm离心3分钟。随后以5000/孔将细胞以50μl的体积接种于圆底平板。在50μl细胞培养基的体积中以25-0.1μg/ml的终浓度将抗体加至50μl细胞悬浮液中并培养30-60分钟。培养之后通过用PBS洗涤两次去除过量抗体。加入100μl在介于1/3-1/30之间进行稀释的活性或失活的(于56℃30分钟)合并的人血清、豚鼠、兔或裸鼠血清，并将细胞培养3小时，其后于1500rpm将细胞离心下来3分钟。收集100μl的上清液，转移到聚丙烯试管中并在γ-计数器中进行计数。
为了研究抗体在ADCC中的效果，用100μCi51Cr对H322M、H460和NIH 3T3或其它适合的表达IGF-IR的细胞(2-6×106)进行标记45-120分钟(Amersham Pharmacia Biotech，UK，Cat CJS 11)，用40ml PBS洗涤两次并于1500rpm离心3分钟。以5000细胞/孔将细胞在50μl的体积中接种于圆底平板。在50μl细胞培养基的体积中以25-0.1μg/ml的终浓度将HuMAb抗体加至50μl细胞悬浮液中并培养15分钟。随后，以100∶1到5∶1的E∶T比例加入50μl的效应子细胞、刚分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应子细胞。于500-700rpm将板离心2分钟，并于37℃培养过夜。培养之后于1500rpm将细胞离心下来3分钟，并收集100μl的上清液，转移到聚丙烯试管中并在γ-计数器中进行计数。
将通过CDC或ADCC进行的细胞裂解的大小表示为来自去污剂裂解靶细胞的放射性最大释放的％，并作来自各个靶细胞的放射性的自发释放的校正。
实施例15H322M肿瘤的生长抑制通过按照已确定的方法在无胸腺小鼠中诱导肿瘤来研究抗体18在体内的效应。将人H322M NSCLC细胞与基质胶(Matrigel)一起皮下共注射到6-7周龄的无胸腺nu小鼠(nu/nu)中。为此目的，将5×106H322M细胞浓缩在100μl培养基中并混和以100μl基质胶。将200μl的该混和物注射到小鼠的右胁。按照由Geran等首先公开的公式(“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors and otherbiological systems”，Cancer Chemother.Rep.11.301，1972)，其中肿瘤体积[mg]＝(长度×(宽度)2)通过每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径来计算肿瘤的体积。以10ml/kg腹膜内地(i.p.)施用抗体。处理开始以双倍体积的双倍剂量抗体施用。如上所述在裸鼠中诱导肿瘤。在肿瘤生长到160mg的平均体积后，对小鼠进行腹膜内处理6次，所述处理在处理的第一天以12，1.2和0.12mg/kg作为负荷剂量给药1次，以6、0.6和0.06mg/kg的抗体作为连续剂量，每周一次。图13描述在直到第67天动物被处死并且实验终止的处理过程中，所测量的肿瘤体积。该实验证明当以6和0.6mg/kg的单个试剂施用时，由rhu抗-IGF-IR mAb 18对IGF-IR轴的阻断导致抗肿瘤效率。与此相对，0.06mg/kg对肿瘤生长没有影响。
此外，在相同的模型中结合吉西他滨检验了抗体18。如上所述诱导肿瘤并且当肿瘤已经在所有的组中形成并长到170mm3的平均大小时开始治疗。以6和0.6mg/kg并以0.6mg结合62mg/kg的吉西他滨i.p.施用抗体每周1次。施用吉西他滨一个周期，即每隔三天，总共4次。通过施用双倍剂量的抗体再次开始治疗。图14显示随时间肿瘤大小与各种治疗之间的相关性。实验证明了以每7日施用1次用抗体18进行的治疗本身抑制肿瘤生长并增加了吉西他滨的有效性，已知所述吉西他滨是一种抗代谢化合物。
实施例16对3T3肿瘤的生长抑制基本如实施例15中所述在裸鼠中诱导肿瘤，除了应用过度表达人IGF-IR的鼠3T3成纤维细胞之外。以18，6或0.6mg/kg的抗体18对具有约180mg的形成的肿瘤的小鼠进行腹膜内处理，每周1次，共7次。将双倍剂量的抗体给药作负荷剂量(36，12和1.2mg/kg)来再次开始治疗。所述实验证实了通过用抗体治疗，当被以18和6mg/kg，每周1次给药时，肿瘤的生长可被延缓(图15)。
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序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>针对胰岛素样生长因子I受体的抗体及其应用<130>21695<150>EP 03015526<151>2003-07-10<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>118<212>PRT<213>人<400>1Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95
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PCT/RO/134表
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细则13bis)
Form PCT/RO/134(1998年7月；重印2004年1月)
C.附加说明(附页)申请人霍夫曼-拉罗奇有限公司等申请者提交的参考21695 WO-SR国际申请号PCT/EP2004/007562涉及与说明书中提到的保藏的生物材料有关的专家方案的说明涉及保藏的生物材料的说明都包含在说明书中。随后的附加说明不需要成为说明书的一部分，而应该被作为“单独的说明”处理。它们仅与专家方案有关。
下面附加的说明与在说明书第5页的保藏的生物材料有关，所述生物保藏材料指<IGF-1R>HUMAB-克隆18 DSM ACC2587<IGF-1R>HUMAB-克隆22 DSM ACC2594附加的说明是对于CA(加拿大)的指定关于加拿大的指定，如在加拿大专利法下的专利细则的细则107和108所规定的，将直到加拿大专利局授权时，或直到申请被驳回或被放弃并且不再恢复时，或被撤回时仅通过将样品授权给由专利局长提名的独立专家，才可以获得保藏的生物材料样品(细则104(4))。
对于EP(欧洲专利)指定关于EPO的指定，如在EPC下的补充规定的细则28(3)所规定的，将直到欧洲专利局有关授权记述的公开时，或如果申请被驳回或撤回或被视为撤回直到从提交之日起的20年，仅通过将样品授权给由要求者指定的专家，才能获得保藏的生物材料样品(细则28(4)EPC)。
对于SG(新加坡)指定特此申请人提请注意，我们的意图是上述鉴定的培养物样品将仅由按照专利法1995的第四目录的第三段规定的专家可获得。
权利要求
1.一种结合IGF-IR并且抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR结合的抗体，其特征在于所述抗体a)是IgG1同种型，b)显示其对IGF-I与IGF-IR结合的抑制的IC50值与其对IGF-II与IGF-IR结合的抑制的IC50值的比率为1∶3-3∶1，c)当与没有所述抗体的这种测定比较时，在含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用HT 29细胞的细胞磷酸化测定中，其在5nM的浓度上抑制至少80％的IGF-IR磷酸化，和d)当与没有所述抗体的这种测定相比，在含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用3T3细胞的细胞磷酸化测定中，其在10μM的浓度上没有显示作为IGF-IR磷酸化所测量的IGF-IR刺激活性，所述3T3细胞提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞。
2.按照权利要求1的抗体，其特征在于通过ADCC，在100nM的所述抗体浓度下24小时后，所述抗体诱导表达IGF-IR的细胞的制剂的20％或更多细胞的死亡。
3.按照权利要求1或2的抗体，其特征在于通过CDC，在100nM的所述抗体的抗体浓度下4小时后，所述抗体诱导表达IGF-IR的细胞的制剂的20％或更多细胞的死亡。
4.按照权利要求1-3的抗体，其特征在于是人或人源化的抗体。
5.按照权利要求1-4的抗体，其特征在于亲和性为约10-13-10-9M(KD)
6.按照权利要求1-5的抗体，其特征在于包括作为互补决定区(CDRs)，所述互补决定区具有如下序列a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
7.按照权利要求1-6的抗体，其可以从杂交瘤细胞系<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)或<IGF-1R>HUMAB克隆22(DSM ACC 2594)中获得。
8.按照权利要求1-7的抗体在制备药物组合物中的应用。
9.一种药物组合物，其包含药用有效量的按照权利要求1-7的抗体。
10.杂交瘤细胞系<IGF-1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)和<IGF-1R>HUMAB克隆22(DSM ACC 2594)。
11.制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含药用有效量的按照权利要求1-7的抗体。
12.一种编码能与下面定义的各个另外抗体链一起装配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一种a)SEQ ID NO1或3的包括作为CDRs的CDR1(31-35氨基酸)，CDR2(50-66氨基酸)和CDR3(99-107氨基酸)的抗体重链；b)SEQ ID NO2或4的包括作为CDRs的CDR1(24-34氨基酸)，CDR2(50-56氨基酸)和CDR3(89-98氨基酸)的抗体轻链。
13.一种包括按照权利要求12的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。
14.一种原核或真核宿主细胞，其包括按照权利要求13的载体。
15.一种制备结合IGF-IR并且抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR结合的多肽的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达按照权利要求11的编码重链的核酸和编码轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。
16.治疗需要抗肿瘤治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的按照权利要求1-7的抗体。
17.按照权利要求16的方法，其特征在于与细胞毒性试剂、其前体药物或细胞毒性放射疗法结合施用所述抗体。
18.从多种针对IGF-IR的抗体中选择针对IGF-IR的抗体的方法，其特征在于用所述抗体进行在包含0.5％的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用3T3细胞的细胞磷酸化测定，所述3T3细胞提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞，并且选择这样的抗体，当与没有所述抗体的这种测定相比时，所述抗体在10μM的浓度上没有显示作为PKB磷酸化所测量的IGF-IR刺激活性。
19.制备一种药物组合物的方法，其特征在于从多种针对IGF-IR的抗体中选择针对IGF-IR的抗体，其是通过用所述抗体，在包含0.5％热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中，使用3T3细胞进行细胞磷酸化测定而实施，所述3T3细胞提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞，和选择所述抗体，当与没有所述抗体的这种测定比较，所述抗体在10μM的浓度上没有显示作为PKB磷酸化所测量的IGF-IR刺激活性，通过重组表达的方式产生所述抗体，回收所述抗体和使所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂结合。
全文摘要
一种已经提高了抗肿瘤治疗的特性的抗体，所述抗体结合IGF－IR并且抑制IGF－I和IGF－II与IGF－IR结合，其特征在于所述抗体a)是IgG1同种型，b)显示其对IGF－I与IGF－IR结合的抑制的IC
文档编号A61K39/395GK1823163SQ200480019796
公开日2006年8月23日 申请日期2004年7月9日 优先权日2003年7月10日
发明者Y·格劳斯, E·科佩茨基, K-P·金克勒, O·蒙迪格勒, P·帕伦, F·雷贝阿斯, R·舒马赫, J·范德温克尔, M·弗里斯玛-范武格特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司