抗－胰岛素样生长因子Ⅰ受体抗体的用途的制作方法

专利名称：抗－胰岛素样生长因子Ⅰ受体抗体的用途的制作方法
背景技术：
本发明涉及抗-胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)抗体的用途、和包含抗-胰岛素样生长因子I受体抗体的组合物。
胰岛素样生长因子(IGF-I)是一种在血浆内以高浓度循环的7.5-kD多肽，在大多数组织中都可以检测得到。IGF-I刺激细胞分化和细胞增殖，是大多数哺乳动物细胞类型持续增殖所需的。这些细胞类型尤其包括人二倍体纤维母细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、神经细胞、骨髓细胞、软骨细胞、成骨细胞和骨髓干细胞。
导致IGF-I刺激细胞增殖和分化的转导途径中的第一步是IGF-I或IGF-II(或超生理浓度下的胰岛素)与IGF-I受体的结合。IGF-I受体(IGF-IR)由两种类型的亚单位组成α亚单位(完全位于细胞外且功能为结合配体的130-135kD蛋白质)和β亚单位(95-kD的跨膜蛋白质，具有跨膜和胞质结构域)。IGF-IR最初合成为单链受体原多肽，经过糖基化、蛋白酶切割、和共价结合处理装配成含有两个α亚单位和两个β亚单位的成熟460-kD异四聚体。β亚单位具有由配体激活的酪氨酸激酶活性。这一活性参与介导配体作用的信号传导途径，该途径包括β亚单位的自磷酸化和IGF-IR底物的磷酸化。
已有大量证据证明IGF-I和/或IGF-IR在体内外维持肿瘤细胞中的作用。已经评估了肺(Kaiser等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.119665-668，1993；Moody等人，Life Sciences 521161-1173，1993；Macauley等人，Cancer Res.，502511-2517，1990)、乳房(Pollak等人，Cancer Lett.38223-230，1987；Foekens等人，Cancer Res.497002-7009，1989；Cullen等人，Cancer Res.497002-7009，1990；Arteaga等人，J.Clin.Invest.841418-1423，1989)、前列腺和结肠(Remaole-Bennet等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.75609-616，1992；Guo等人，Gastroenterol.1021101-1108，1992)肿瘤中的IGF-IR水平。此外，IGF-I似乎是人神经胶质细胞瘤的自分泌刺激剂(Sandberg-Nordqvist等人，Cancer Res.532475-2478，1993)，而IGF-I刺激过表达IGF-IR的纤维肉瘤的生长(Butler等人，Cancer Res.583021-27，1998)。此外，带有“高正常”水平IGF-I的个体与带有“低正常”范围IGF-I水平的个体相比，患普通癌症的风险更高(Rosen等人，Trends Endocrinol.Metab.10136-41，1999)。关于IGF-I/IGF-I受体互作在各种肿瘤生长中所起的作用的综述参见Macaulay，Br.J.Cancer，65311-320，1992。
限制卡路里是提高各种动物物种(包括哺乳动物)寿命的最有效且可重复的措施。它也是实验致癌模型中最有效、作用最广的癌症预防疗法。作为其诸多有益效果基础的一种重要生物学机制是胰岛素样生长因子-1途径(Hursting等人，Annu.Rev.Med.54131-52，2003)。
考虑到当IGF-I和/或IGF-IR过表达时IGF-I和IGF-IR在比如癌症和其它增殖性疾病这样的疾病中的作用，已经生产出了阻断IGF-I或IGF-II与IGF-IR结合的IGF-IR抗体。这样的抗体描述在，比如，2002年7月11日公开的WO 02/05359中。这些公开文本，包括所描述的所有序列，引入本文作为参考。用这样的高亲和力人抗-IGF-IR抗体治疗人类中的相关疾病是人们所希望的。
发明概述本发明涉及治疗或预防疾病的方法，其中所述疾病选自哺乳动物的多发性骨髓瘤、液体肿瘤(liquid tumor)、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌学疾病(endocronologicaldisorder)、缺血、和神经变性疾病，该方法包括向所述哺乳动物施用对治疗所述疾病有效的量的人抗-IGF-IR抗体。在一种实施方式中，该方法还包括与选自皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、抗血管剂(anti-vascular agent)、和抗增殖剂的试剂联合向所述哺乳动物施用所述抗体。
液体肿瘤优选为急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性milogenic白血病(CML)。肝癌优选为肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、或肝胚细胞瘤。胸腺疾病优选为胸腺瘤或甲状腺炎。T-细胞介导的自体免疫疾病优选为多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯病(Grave’s Disease)、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、或Bechet’s病。内分泌学疾病优选为II型糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状腺机能减退、甲状腺炎、肾上腺皮质功能亢进和肾上腺皮质机能减退。缺血优选为post-cardiac缺血。神经变性疾病优选为早老性痴呆。
当抗体与抗增殖剂组合给药时，优选该药剂选自法尼基蛋白质转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、和PDGFR抑制剂。
当该抗体与抗-血管剂组合给药时，优选该药剂选自bevacizumab或rhuMAb-VEGF。
当该抗体与止吐药组合给药时，优选该药剂选自盐酸昂丹司琼(ondansetron hydrochloride)、盐酸格拉司琼(granisetronhydrochloride)、metroclopramide、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、赛克力嗪(cyclizine)、劳拉西泮(lorazepam)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、地塞米松、甲氧异丁嗪(levomepromazine)、或托烷司琼(tropisetron)。
当该抗体与疫苗组合给药时，优选该疫苗选自GM-CSF DNA和基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种异体或自体肿瘤疫苗。在一种实施方式中，该疫苗为以肽、DNA、或细胞为基础的。
当该抗体与止痛剂组合给药时，优选该药剂选自布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、或盐酸羟考酮。
在一种优选实施方式中，该哺乳动物是人。
在一种实施方式中，结合IGF-IR的抗体具有以下特性对人IGF-IR的结合亲和力的Kd为8×10-9或更低；抑制人IGF-IR和IGF-1间结合的IC50小于100nM；及含有包含人FRI、FR2、和FR3氨基酸序列的重链氨基酸序列，该人FRI、FR2、和FR3氨基酸序列对应于VH DP-35、VIV-4/4.35、VHDP-47、或VH DP-71基因的FR1、FR2、和FR3氨基酸序列、或其中的保守替代或体细胞突变(somatic mutations)，其中FR序列与CDR1、CDR2、和CDR3序列相连，且其中抗体在其轻链中还含有来自A27、A30、或O12基因的CDR区域。
作为替代，该抗体与含有选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合。例如，该抗体可以与由含有选自抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的重链和轻链氨基酸序列的抗体所结合的表位结合。
在另一种实施方式中，利用含有包含CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重链和包含CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的轻链的抗体来实践本发明，其中的重链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列是选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的抗体的重链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列，或是与所述CDR序列相比具有如下改变的序列，其中所述改变选自保守改变、非保守替代、添加和缺失，其中所述保守改变选自非极性残基用不同的非极性残基替换、极性带电残基用不同的极性不带电残基替换、极性带电荷的残基用不同的极性带电荷残基替换和结构相似残基的替代，其中的非保守替代选自极性不带电残基对极性带电残基的替代、和极性残基对非极性残基的替代。
在一种优选实施方式中，该抗体含有含CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重链和含CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的轻链，其中的重链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列是选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的抗体的重链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列和轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列。在另一种实施方式中，该抗体含有衍生自人基因DP-47的重链氨基酸序列和衍生自人基因A30的轻链氨基酸序列。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物疾病的药物组合物，它包括对治疗所述疾病有效的量的人抗-IGF-IR抗体和药学可接受载体，其中所述疾病选自多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌疾病、缺血、和神经变性疾病。在一种实施方式中，本发明涉及一种还包含与所述抗体联合后对治疗所述疾病有效的量的皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、抗血管剂、和抗增殖剂的联合型药物组合物。
本发明还涉及一定量人抗-IGF-IR抗体用于制备治疗哺乳动物疾病的组合物的用途，其中所述抗体量对治疗所述疾病有效，其中所述疾病选自多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌疾病、缺血、和神经变性疾病。
附图简述

图1A-1C显示来自六个人抗-IGF-IR抗体的轻链可变区核苷酸序列间的相互比对以及与种系序列(germline sequence)的比对。图1A显示抗体2.12.1(SEQ ID NO1)、2.13.2(SEQ ID NO5)、2.14.3(SEQ ID NO9)、和4.9.2(SEQ ID NO13)的轻链(VL)可变区核苷酸序列间的相互比对以及与种系VκA30序列(SEQ ID NO39)的比对。图1B显示抗体4.17.3(SEQ ID NO17)的VL核苷酸序列与种系VκO12序列(SEQ ID NO41)的比对。图1C显示抗体6.1.1(SEQ ID NO21)的VL核苷酸序列与种系VκA27序列(SEQ IDNO37)的比对。这些比对还显示了来自各抗体VL的CDR区域。图1A-1C的共有序列分别示于SEQ ID NO53-55。
图2A-2D显示来自六个人抗-IGF-IR抗体的重链可变区核苷酸序列间的相互比对以及与种系序列的比对。图2A显示抗体2.12.1的VH核苷酸序列(SEQ ID NO3)与种系VH DP-35序列(SEQ ID NO29)的比对。图2B显示抗体2.14.3的VH核苷酸序列(SEQ ID NO11)与种系VIV-4/4.35序列(SEQ ID NO43)的比对。图2C-1和2C-2显示抗体2.13.2(SEQ ID NO7)、4.9.2(SEQ ID NO15)和6.1.1(SEQ ID NO23)的VH核苷酸序列间的相互比对以及与种系VH DP-47序列(SEQ ID NO31)的比对。图2D显示抗体4.17.3的VH核苷酸序列(SEQ ID NO19)与种系VH DP-71序列(SEQ ID NO35)的比对。该比对还显示这些抗体的CDR区域。图2A-2D的共有序列分别示于SEQ ID NO56-59。
图3A显示，与种系序列相比，2.13.2和2.12.1重链和轻链的不同区域内的突变数量。图3A-D显示抗体2.13.2和2.12.1的重链和轻链氨基酸序列与它们所来源的种系序列间的比对。图3B显示抗体2.13.2(SEQ ID NO45)重链氨基酸序列与种系序列DP-47(3-23)/D6-19/JH6氨基酸序列(SEQ ID NO46)的比对。图3C显示抗体2.13.2轻链氨基酸序列(SEQ ID NO47)与种系序列A30/Jk2氨基酸序列(SEQID NO48)的比对。图3D显示抗体2.12.1重链氨基酸序列(SEQID NO49)与种系序列DP-35(3-11)/D3-3/JH6氨基酸序列(SEQ IDNO50)的比对。图3E抗体2.12.1轻链氨基酸序列(SEQ ID NO51)与种系序列A30/Jk1氨基酸序列(SEQ ID NO52)的比对。对于图3B-E，信号序列以斜体表示，CDR以下划线表示，恒定区为黑体，构架区(FR)突变在该氨基酸残基上用加号(“+”)突出显示，CDR突变用星号在该氨基酸残基上突出显示。
图4显示，抗-IGF-IR抗体2.13.2和4.9.2减少3T3-IGF-IR肿瘤中的IGF-IR磷酸酪氨酸信号。
图5显示，抗-IGF-IR抗体2.13.2抑制体内3T3-IGF-IR肿瘤生长。
发明详述本文中引用的所有专利、专利申请、和其它参考文献全文引入本文作为参考。
抗体还可与其它可用于治疗异常IGF-IR活性的药剂，包括但不限于比如WO 02/053596中所述的不同抗-IGF-IR抗体，以及其它也能够阻断IGF-IR的药剂一同使用。
本文所述的联合(组合)治疗可以通过同时、顺序或分开施予各单个治疗组分来实现。
使用该抗体可以治疗或预防初次疾病(initial disease)、或治疗或预防复发。它可用于治疗早期或晚期疾病。
除非另外指明，如本文所使用的术语“治疗(treating)”意指，预防该用语所应用的疾病或状况、或这样的疾病或状况的一或多种症状，或逆转、减轻、抑制上述疾病或状况的进程。除非另外指明，如本文所使用的术语“治疗(treatment)”是指，如上述定义的“治疗”的治疗行为。
除非在本文中另外指明，所使用的与本发明相关的科技术语应当具有本领域技术人员通常所理解的含义。一般地，本文中所使用的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交有关的命名学和技术是本领域已知的和常用的。
除非在本文中另外指明，以下术语应当理解为具有以下含义“抗体”指，与完整抗体竞争特异性结合的完整免疫球蛋白或其抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶或化学切割来制备。抗原结合部分包括，尤其是，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、微型双功能抗体(diabodies)和包含足以使其具有特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。
免疫球蛋白链呈现相同的一般结构，即通过三个超变区，也称作互补决定区或CDR，连接的相对保守的构架区(FR)。来自每一对的两条链的CDR通过构架区对齐，使得能够与特异性表位结合。从N-末端至C-末端，轻链和重链都含有结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。依据Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))、或Chothia& Lesk J.Mol.Biol 196901-917(1987)；Chothia等人，Nature342878-883(1989)的Kabat序列的定义将氨基酸指定到各结构域。
“分离的抗体”是(1)不与在天然状态下和它相伴的天然相关联成分，包括其它天然相关联的抗体，相联系的抗体，(2)不带有来源于同一物种的其它蛋白质的抗体，(3)由来自不同物种的细胞表达的抗体，或(4)自然界中不存在的抗体。分离的抗体的例子包括，已用IGF-IR亲和纯化的抗-IGF-IR抗体、由杂交瘤或其它细胞系在体外合成的抗-IGF-IR抗体、和来源于转基因小鼠的人抗-IGF-IR抗体。
术语“嵌合抗体”是指，包含一或多个来自一种抗体的区域和一或多个来自一或多种其它抗体的区域的抗体。在一种优选实施方式中，一或多个CDR来源于人抗-IGF-IR抗体。在一种更优选的实施方式中，所有的CDR都来源于人抗-IGF-IR抗体。在另一种优选实施方式中，将来源于一种以上人抗-IGF-IR抗体的CDR混合并匹配在嵌合抗体中。此外，构架区可以来源于相同抗-IGF-IR抗体中的一种、来源于比如人抗体这样的一或多种不同的抗体、或来源于人源化抗体。
术语“表位”包括任何能与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由比如氨基酸或糖侧链这样的分子的具有化学活性的表面组群(groupings)组成，且通常具有特异性的三维结构特征、以及特异性电荷特征。当解离常数≤1μM、优选≤100nM且最优选≤10nM时，抗体和抗原被称作特异性结合。
用于多肽时，术语“基本同一”意指，当两条肽序列用例如GAP或BESTFIT程序以默认缺口权量进行最佳比对时，具有至少75％或80％序列同一性，优选至少90％或95％序列同一性，甚至更优选至少98％或99％序列同一性。优选地，不一致的残基位置由于保守氨基酸替代而不同。“保守氨基酸替代”是，一个氨基酸残基被另一个带有具相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基替代。通常，保守氨基酸替代本质上不改变蛋白质的功能。当两条或多条氨基酸序列由于保守替代而相互不同时，为针对该替代的保守性质进行校正可以上调序列同一性百分数或相似程度。做这一调正的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如Pearson，Methods Mol.Biol.24307-31(1994)，引入本文作为参考文献。带有具相似化学特性的侧链的氨基酸组的例子包括1)脂肪族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；和6)含硫侧链为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本领域普通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基-和羧基-末端存在于功能结构域的边界附近。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库进行比较，可以鉴定出结构域和功能域。优选地，利用计算机比较方法来鉴定出现在其它结构和/或功能已知的蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人，Science 253164(1991)。因此，前述例子证实，本领域普通技术人员可以识别可用于定义本发明的结构域和功能域的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸替代是(1)降低对蛋白酶的易感性的替代，(2)降低对氧化作用的易感性的替代，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力的替代，(4)改变结合亲和力的替代，和(4)赋予或改变这样的类似物的其它物理化学或功能特性的替代。类似物可包括除天然存在的肽序列之外的各种序列突变。例如，可在天然存在的序列中制造单个或多个氨基酸替代(优选保守氨基酸替代)(优选在多肽中形成分子间接触的结构域外的区段中进行替代)。保守氨基酸替代不应当在本质上改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应当倾向于破坏出现在亲本序列中的螺旋，或破坏表现亲本序列特征的其它类型的二级结构)。
术语患者包括人和兽医对象。
人抗体避免了与具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的某些问题。因此，在一种实施方式中，本发明提供人源化的抗-IGF-IR抗体。更优选的是完全人抗-人IGF-IR抗体。预计，完全的人抗-IGF-IR抗体将使小鼠或小鼠-衍生的单克隆抗体所固有的免疫原性和变应性应答最小化，并由此提高所施用抗体的效力和安全性。使用完全人抗体预计可以为治疗慢性和复发性人类疾病，比如炎症和癌症，提供实质性益处，因为这些治疗可能需要重复施用抗体。在另一种实施方式中，本发明提供一种不与补体结合的抗-IGF-IR抗体。
在本发明的另一方面，抗-IGF-IR抗体以高亲和力与IGF-IR结合。在一种实施方式中，抗-IGF-IR抗体结合IGF-IR的Kd为1×10-8M或更低。在一种更优选的实施方式中，抗体结合IGF-IR的Kd为I×10-9M或更低。在一种甚至更优选的实施方式中，抗体结合IGF-IR的Kd为5×10-10M或更低。在另一种优选实施方式中，抗体结合IGF-IR的Kd为1×10-10M或更低。在另一种优选实施方式中，抗体结合IGF-IR的Kd基本与选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的抗体的Kd相同。在另一种优选实施方式中，抗体结合IGF-IR的Kd基本与含有一或多个来自抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的CDR的抗体的Kd相同。
本发明还利用与人抗-IGF-IR抗体结合相同的抗原或表位的抗-IGF-IR抗体。此外，本发明还可以利用与人抗-IGF-IR抗体交叉竞争的抗-IGF-IR抗体。在一种优选实施方式中，人抗-IGF-IR抗体是2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1。在另一种优选实施方式中，人抗-IGF-IR含有一或多个来源于选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的抗体的CDR。
本发明还可以利用含有由人κ基因编码的可变序列的抗-IGF-IR抗体来实施。在一种优选实施方式中，该可变序列由VκA27、A30或者O12基因家族编码。在一种优选实施方式中，该可变序列由人VκA30基固家族编码。在一种更优选的实施方式中，相对于种系VκA27、A30或O12，轻链含有不超过十个氨基酸替代，优选不超过六个氨基酸替代，和更优选不超过三个氨基酸替代。在一种优选实施方式中，该氨基酸替代为保守替代。
在一种优选实施方式中，相对于种系氨基酸序列，抗-IGF-IR抗体的VL与抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的任何一或多个VL包含相同的氨基酸替代。
在另一种优选实施方式中，轻链含有与2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的VL氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一种高度优选的实施方式中，轻链含有与2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的轻链CDR区相同的氨基酸序列。在另一种优选实施方式中，轻链含有来自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的至少一个轻链CDR区的氨基酸序列。
本发明还可利用含有人重链或衍生自人重链的序列的抗-IGF-IR抗体或其部分来实施。在一种实施方式中，重链氨基酸序列衍生自人VHDP-35、DP-47、DP-70、DP-71或VIV-4/4.35基因家族。在一种优选实施方式中，重链氨基酸序列衍生自人VHDP-47基因家族。在一种更优选的实施方式中，相对于种系VHDP-35、DP-47、DP-70、DP-71或VIV-4/4.35，重链含有不超过八个氨基酸改变，更优选不超过六个氨基酸改变，甚至更优选不超过三个氨基酸改变。
在一种优选实施方式中，相对于种系氨基酸序列，抗-IGF-IR抗体的VH与抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的任何一个或多个VH包含相同的氨基酸替代。在另一种实施方式中，在与抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的任何一个或多个VH中发现的替代相同的位置制造氨基酸替代，但制造的是保守氨基酸替代而非使用相同的氨基酸进行替代。
在另一种优选实施方式中，重链含有与2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的VH的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一种高度优选的实施方式中，重链含有与2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的重链CDR区相同的氨基酸序列。在另一种优选实施方式中，重链含有来自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的至少一个重链CDR区的氨基酸序列。在另一种优选实施方式中，重链含有来自不同重链的CDR的氨基酸序列。在一种更优选的实施方式中，来自不同重链的CDR获自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、或6.1.1。
在另一种实施方式中，本发明使用抑制IGF-I与IGF-IR的结合或IGF-II与IGF-IR的结合的抗-IGF-IR抗体。在一种优选实施方式中，IGF-IR是人的。在另一种优选实施方式中，抗-IGF-IR抗体是人抗体。在另一种实施方式中，抗体或其部分抑制IGF-IR和IGF-I间的结合，IC50不超过100nM。在一种优选实施方式中，IC50不超过10nM。在一种更优选的实施方式中，IC50不超过5nM。可以用本领域已知的任何一种方法测定IC50。典型地，可以用ELISA或RIA测定IC50。在一种优选实施方式中，用RIA测定IC50。
在另一种实施方式中，本发明使用防止IGF-IR在IGF-I存在下活化的抗-IGF-IR抗体。在本发明的另一方面，该抗体导致用该抗体处理的细胞IGF-IR下调。在一种优选实施方式中，该抗体选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、或6.1.1，或含有其重链、轻链或抗原结合区。
可以通过用IGF-IR抗原免疫含有一些或全部人免疫球蛋白基因座位的非人动物来制备人抗体。在一种优选实施方式中，该非人动物是XENOMOUSETM，它是一种含有人免疫球蛋白基因座位大片段、且小鼠抗体生产缺乏的工程化小鼠株系。参见，例如Green等人，NatureGenetics 713-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。亦参见1991年7月25日公开的WO 91/10741、1994年2月3日公开的WO 94/02602、1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735、1998年4月23日公开的WO 98/16654、1998年6月11日公开的WO 98/24893、1998年11月12日公开的WO 98/50433、1999年9月10日公开的WO 99/45031、1999年10月21日公开的WO99/53049、2000年2月24日公开的WO 00 09560和2000年6月28日公开的WO 00/037504。XENOMOUSETM生产一种类似于成人的完全人抗体集合，并产生抗原特异性人Mabs。通过导入人重链座位和κ轻链座位兆碱基大小的种系构型YAC片段，第二代XENOMOUSETM包含人抗体集合的大约80％。参见Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)，其公开文本引入本文作参考。
为刺激免疫应答，IGF-IR抗原可以与佐剂一起施用。这样的佐剂包括完全或不完全弗氏(Freund′s)佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激性复合物)。这样的佐剂可以通过使多肽隔离在局部沉淀中从而保护其免于快速分散，或者它们可能包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞或免疫系统其它组分而言趋化性的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫方案将包括在数周内两次或多次施用多肽。
编码轻链可变区的核酸分子可以来源于A30、A27或O12Vκ基因。在一种优选实施方式中，轻链来源于A30Vκ基因。在一种更优选的实施方式中，编码轻链的核酸分子包含不超过十个相对于种系A30Vκ基因的氨基酸改变，优选不超过六个氨基酸改变，和甚至更优选不超过三个氨基酸改变。
在一种实施方式中，与突变前的抗-IGF-IR抗体相比，抗体在突变的抗-IGF-IR抗体的VH或VL区中包含不超过十个氨基酸改变。在一种更优选的实施方式中，在突变的抗-IGF-IR抗体的VH或VL区域中含有不超过五个氨基酸改变，更优选不超过三个氨基酸改变。在另一种实施方式中，恒定结构域含有不超过十五个氨基酸改变，更优选不超过十个氨基酸改变，甚至更优选不超过五个氨基酸改变。
SEQ ID NO2、6、10、14、18和22给出六个抗-IGF-IRκ轻链的可变区氨基酸序列。SEQ ID NO4、8、12、16、20和24给出六个抗-IGF-IR重链的可变区氨基酸序列。SEQ ID NO25描述编码抗-IGF-IR抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、和6.1.1轻链恒定区的核酸序列，SEQ ID NO26描述氨基酸序列。SEQ IDNO27描述编码抗-IGF-IR抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2、4.17.3、和6.1.1重链恒定区的核酸序列，SEQ ID NO28描述氨基酸序列。SEQ ID NO30、32、34、36和44分别提供种系重链DP-35、DP-47、DP-70、DP-71和VIV-4的氨基酸序列。SEQ ID NO33提供种系重链DP-70的核苷酸序列。SEQ ID NO38、40和42提供三个种系κ轻链的氨基酸序列，从这三个种系κ轻链衍生出所述六个抗-IGF-IRκ轻链。
在另一种优选实施方式中，本发明涉及抗-IGF-IR在预防衰老中的用途。
在另一种实施方式中，本发明涉及用于治疗需要活化IGF-IR的哺乳动物的药物组合物，其中的药物组合物含有治疗有效量的本发明活化性抗体和药学可接受载体。含有活化性抗体的药物组合物可用于治疗缺乏足够IGF-I或IGF-II的动物。
可以将抗-IGF-IR抗体掺入适于向对象施用的药物组合物中。典型地，该药物组合物含有抗体和药学可接受载体。如同本文所使用的，“药学可接受载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌试剂、等渗剂和吸收延缓剂、以及生理相容的类似物。药学可接受载体的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或其类似、及其组合中的一或多种。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖类，比如甘露醇、山梨醇这样的多元醇，或氯化钠。药学可接受物质，比如湿润剂，或少量辅料，比如湿润剂或乳化剂、提高抗体或抗体部分的保存期或有效性的防腐剂或缓冲液。
该药物组合物可以有多种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体或固体剂量形式，比如液体溶液(例如，可注射的和能输注的溶液)、分散剂或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式依赖于目的给药方式和治疗用途。典型的优选组合物是可注射的或能输注的溶液，比如类似于用其它抗体对人进行被动免疫所使用的组合物。优选的给药方式是非肠胃方式(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一种优选实施方式中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一种优选实施方式中，通过肌内或皮下注射施用抗体。
治疗组合物典型地必须是无菌的，而且在制造及保存条件下是稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或其它适于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的抗-IGF-IR抗体根据需要和以上列举的一种成分或多种成分的组合掺入适当溶剂中，并随后进行过滤灭菌，可以制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物混合进无菌载体来制备分散体，该无菌载体包含基本分散介质和所需的来自上述列举成分的其它成分。对于用于制备可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，通过干燥从上述无菌过滤溶液产生含有活性成分和任何附加目的成分的粉末。可以通过，例如，使用卵磷脂这样的包衣、保持分散体的目的颗粒大小、和使用表面活性剂，来保持溶液适宜的流动性。使组合物中包含延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长对可注射组合物的吸收。
可以通过本领域已知的各种方法施用抗体，尽管对于许多治疗用途，优选的给药途径/方式是腹膜内、皮下、肌内、静脉内或输注。正如本领域技术人员可以理解的，给药途径和/或方式将根据所需的结果而不同。在一种实施方式中，抗体可以以单次剂量或多次剂量施用。
在特定实施方式中，活性化合物可以用保护该化合物免于快速释放的载体来制备，比如，释放受控制的剂型，包括植入物、透皮贴片、和微囊化运输系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙烯乙酸乙烯基酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、和聚原酸酯。许多制备此类制剂的方法已获得专利，并为本领域技术人员所知。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978年。
在特定实施方式中，抗体可以口服给药，例如，与惰性稀释剂或可被吸收的可食用载体一同口服。还可以将该化合物(如果需要的话，和其它成分)封在硬或软壳明胶胶囊中、压成片剂、或直接混合在服用者的食物里。对于口服治疗性给药，可以将化合物与赋形剂混合并制成可吞咽的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂、及类似。以除了非肠道途径给药之外的方式来施用本发明的化合物，可能必须用材料包被该化合物、或者与该化合物共同施用以防止其失活。
组合物中还可以含有补充的活性化合物。在特定实施方式中，抗-IGF-IR抗体与一或多种附加的治疗剂，比如止吐药、癌症疫苗、止痛剂、抗血管剂、和抗增殖剂，共同配制和/或共同给药。
该药物组合物可以包括“治疗有效量的”或“预防有效量的”本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指，以必要的剂量和时间，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量的抗体或抗体部分可根据比如疾病状态、年龄、性别、和个体的体重这样的因素、以及抗体或抗体部分在个体引发目的应答的能力而变化。治疗有效量也是指抗体或抗体部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效应的剂量。“预防有效量”是指，以必要的剂量和时间，有效实现所需预防结果的量。典型地，因为在疾病前或疾病早期阶段施用预防剂量，所以预防有效量小于治疗有效量。
可以调整剂量方案以获得最优的目的反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以一次性施以大剂量，一段时间内分几次剂量给药，或根据治疗状况的紧急需要来适当减少或提高剂量。含有抗体、或含有包括抗体及一或多种附加治疗剂的组合疗法的药物组合物可以配制成单次或多次剂量。尤其有利的是，将非肠道组合物配制成便于给药、且剂量均一的剂量单位形式。本文中所用的剂量单位形式是指，对于被治疗的哺乳动物对象来说适合的单剂量的物理独立单位；各单位包含根据与所需的药物载体一同产生目的治疗效应而计算出的预先确定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的说明书根据以下来规定并直接依赖于(a)活性化合物的独特性质和所要达到的特定治疗或预防效应，和(b)本领域中为个体中治疗敏感性而对于配制这样一种化合物的固有限制。一种特别有用的剂型是20mM柠檬酸钠缓冲液，pH5.5、140mM NaCl、和0.2mg/ml聚山梨醇酯(polysorbate)80中含5mg/ml抗-IGF-IR抗体。
本发明抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的一个非限制性的示例性范围是0.1-100mg/kg，更优选0.5-50mg/kg，更优选1-20mg/kg，和甚至更优选1-10mg/kg。要注意，剂量值可能根据所欲减轻的症状的类型和严重程度而变化。还应理解，对于任何特定对象，应当根据个体的需求、和施用或指导施用该组合物的人的专业判断随时间对特定剂量方案作出调整，而且本文中所给出的剂量范围仅仅是示例性的，它们并不限制本发明所请求保护的组合物的范围和使用。在一种实施方式中，抗体或其抗体部分的治疗或预防有效量与一或多种其它治疗剂一同给药。
本发明方法中所使用的抗体可以被标记。这可以通过掺入可检测标记来实现，例如，掺入放射性标记的氨基酸或将多肽附着于可以通过标记抗生物素蛋白(例如，包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)来检测的生物素基部分。特定情况中，该标签或标记还可以是治疗性的。多肽和糖蛋白的各种标记方法是本领域已知的，且可利用。用于标记多肽的标记的例子包括但不限于以下物质放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、lanthanidephosphors)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光物质、生物素基团、预先确定的由二级报告基团识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方式中，利用不同长度的间隔臂来结合标记，以减少潜在的空间障碍。
本发明使用的抗体优选来源于表达人免疫球蛋白基因的细胞。利用转基因小鼠来生产这样的“人”抗体是本领域已知的。Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)、Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)、和U.S.专利申请序列号08/759,620(1996年12月3日申请)中描述了一种这样的方法。美国专利申请07/466,008(1990年1月12日申请)、07/610,515(1990年11月8日)、07/919,297(1992年7月24日)、07/922,649(1992年7月30日)、08/031,801(1993年3月15日申请)、08/112,848(1993年8月27日)、08/234,145(1994年4月28日申请)、08/376,279(1995年1月20日申请)、08/430,938(1995年4月27日申请)、08/464,584(1995年6月5日申请)、08/464,582(1995年6月5日申请)、08/463,191(1995年6月5日申请)、08/462,837(1995年6月5日申请)、08/486,853(1995年6月5日申请)、08/486,857(1995年6月5日申请)、08/486,859(1995年6月5日申请)、08/462,513(1995年6月5日申请)、08/724,752(1996年10月2日申请)、和08/759,620(1996年12月3日申请)也描述了利用这样的小鼠来获得人抗体。亦参见Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)，以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)。亦参见欧洲专利EP 0 463 151(1996年6月12日授权公开)、国际专利申请WO 94/02602(1994年2月3日公开)、国际专利申请WO 96/34096(1996年10月31日公开)、和WO 98/24893(1998年6月11日公开)。
如上所述，本发明包括抗体片段(包括在本文对“抗体”的定义中)的用途。可以利用例如蛋白酶或化学切割切割完整蛋白质来制备抗体片段，比如Fv、F(ab′)2和Fab。作为备选方案，还可以设计截断基因。例如，编码F(ab′)2片段一部分的嵌合基因包括编码H链铰链区和CH1结构域的DNA序列、后面接着翻译终止密码子，以产生截断的分子。
在一种方法中，可以利用编码重链和轻链J区域的共有序列来设计用作引物的寡核苷酸以将可用于随后V区域区段与人C区域区段相连的限制性位点导入J区域。可以利用位点定向诱变在与人序列中类似的位置设置限制性位点，这样修饰C区域cDNA。
用于获得本发明中所使用的抗体的表达载体包括质粒、逆转录病毒、粘粒、YAC、来源于EBV的游离体，及类似物。便利的载体通常是这样一种载体，它编码功能完整人CH或CL免疫球蛋白序列、并带有通过遗传工程导入的适宜限制性位点以使得可以容易地插入和表达任何VH或VL序列。在这样的载体中，拼接通常发生在所插入的J区域中的拼接供体位点和人C区域之前的拼接受体位点之间，也发生在存在于人CH外显子中的拼接区域。多聚腺苷酸化和转录终止出现在位于编码区下游的天然染色体位点。所得的嵌合抗体可以与任何强启动子相连接，包括逆转录病毒LTRs，例如SV-40早期启动子、(Okayama等人，Mol.Cell.Bio.3280(1983))、Rous肉瘤病毒LTR(Gorman等人，P.N.A.s.796777(1982))、和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人，Cell 41885(1985))；天然Ig启动子，等等。
被生产出来用于在本发明中使用的抗体不需要最初就具有特定的所需同种型。相反，所产生的抗体可以具有任何同种型并且可以之后用常规技术进行同种型转换。这些包括直接重组技术(参见，例如，美国专利申请4,816,397)，和细胞-细胞融合技术(参见，例如，美国专利申请08/730,639(1996年10月11日申请)。
如上述，对于各种不同的治疗目的，本发明的抗体的效应物功能可以通过同种型转换成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM而被改变。此外，通过利用，例如，双特异性抗体(bispecifics)、免疫毒素、或放射性标记，可以避免杀死细胞时对补体的依赖性。
可以产生包含下述的双特异性抗体(i)两个抗体一个具有对IGF-IR的特异性，另一个对第二分子有特异性，(ii)单个抗体，其一条链特异于IGF-IR，第二条链特异于第二分子，或(iii)特异于IGF-IR的单链抗体和另一分子。这样的双特异性抗体可以用熟知的技术制备，例如，Fanger等人，Immunol Methods 472-81(1994)，Wright和Harris，见上述，和Traunecker等人，Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。
用于本发明的抗体还包括“kappabodies”(III等人，“Design andconstruction of a hybrid immunoglobulin domain with propertiesof both heavy and light chain variable regions”Protein Eng 10949-57(1997))、“minibodies”(Martin等人，“The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of humaninterleukin-6”EMBO J 135303-9(1994))、“diabodies”(Holliger等人，“‘Diabodies’small bivalent and bispecific antibodyfragments″PNAS USA 906444-6448(1993))、和“janusins”(Traunecker等人，“Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”EMBO J 103655-3659(1991)和Traunecker等人，“Janusinnew moleculardesign for bispecific reagents”Int J Cancer Suppl 751-52(1992))。
所使用的抗体可以通过常规技术进行修饰以用作免疫毒素。参见，例如，Vitetta Immunol Today 14252(1993)。亦参见美国专利申请5,194,594。还可以用已知技术制备放射性标记的抗体。参见，例如，Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo，eds.，Lippincott Raven(1996))。亦参见美国专利4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE35,500)、5,648,471、和5,697,902。
可用于实施本发明的特定抗体包括WO 02/053596中所述的那些抗体，WO 02/053596进一步描述了抗体2.12.1、2.13.2、2.14.3、3.1.1、4.9.2和4.17.3。如同在该公开申请中所公开的，生产这些抗体的杂交瘤于2000年12月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏编号如下杂交瘤保藏编号2.12.1PTA-27922.13.2PTA-27882.14.3PTA-27903.1.1 PTA-27914.9.2 PTA-27894.17.3PTA-2793
这些抗体是完全人的IgG2或者IgG4重链，带有人κ轻链。尤其是，本发明涉及使用具有这些抗体的氨基酸序列的抗体。
本发明所使用的抗体优选具有非常高的亲和力，典型地通过固相或液相测定时，其Kd为约10-9至约10-11M。
可以在除杂交瘤细胞系之外的细胞系中表达本发明中使用的抗体。特定抗体的cDNA或基因组克隆的编码序列可用于转化适宜的哺乳动物和非哺乳动物宿主细胞。可以用本领域已知的任何一种将多核苷酸导入宿主细胞的方法来完成转化，这些方法包括，例如将多核苷酸包装进病毒(或包装进病毒载体)并用该病毒(或载体)转导宿主细胞，或利用本领域已知的转染方法来完成转化，例如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455中例举的转染方法。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、多核苷酸包封入脂质体、肽缀合物、dendrimers、和直接将DNA微注射入核。
可以获得的作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO0、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、和人肝细胞瘤细胞(例如，Hep G2)。也可以使用非哺乳动物细胞，包括细菌、酵母、昆虫、和植物细胞。为了防止由于非人糖基化而导致免疫原性、药物动力学、和/或效应物功能改变，优选对抗体CH2结构域进行位点定向诱变以消除糖基化。谷氨酰胺合酶系统的表达的论述全部或部分与欧洲专利216846、256055、和323997、以及欧洲专利申请89303964.4有关。
还可以通过产生目的免疫球蛋白重链和轻链序列的转基因哺乳动物或植物、并从中生产可回收形式的抗体，来制备用于本发明的抗体。可以在山羊、奶牛或其它哺乳动物的乳汁中生产并回收转基因抗体。参见，例如，美国专利5,827,690、5,756,687、5,750,172、和5,741,957。
带或不带附加试剂的抗体，可以给药一次，但是更优选给药多次。抗体给药可以从每天三次到六个月一次。可以按计划给药，比如，每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、和每六个月一次。可以通过口服、黏膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、非肠道途径、肿瘤内或局部途径给药。
在特定实施方式中，抗体可以以气溶胶或可吸入形式给药。溶解或悬浮于液体中的呈精细粉碎固体颗粒形式的干燥气溶胶也可用于实施本发明。可以使用例如在1986年11月25日公开的美国专利4,624,251、1972年11月21日公开的美国专利3,703,173、1971年2月9日公开的美国专利3,561,444、和1971年1月13日公开的美国专利4,635,627中所述的喷雾器以气溶胶喷雾形式施用本发明的药物剂型。
Hubbard，R.C.等人，(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86680-684，1989)公开了，为治疗α抗-胰蛋白酶缺陷，通过肺上皮表面英文句号来施用相对较大的α.sub.1-抗胰蛋白酶(AAt)。以气溶胶形式对绵羊施用了AAt，45,000道尔顿分子量的单链多肽，其作为嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂起作用。气雾化的AAt在哺乳动物组织中保持了完全的功能和完整性，并根据肺、淋巴和血液组织中存在的AAt证实，其经肺泡上皮细胞扩散。
可以在远离肿瘤的位置施用抗体。还可以经由微泵来持续施用抗体。抗体可以施用一次、至少两次或至少施用一段时间直到疾病被治疗、减轻或治愈。通常，如果抗体使肿瘤或癌症停止生长或减小其重量或体积，则只要肿瘤存在就将施用抗体。抗体通常作为上述药物组合物的一部分来施用。抗体剂量通常在0.1-100mg/kg、更优选0.5-50mg/kg、更优选1-20mg/kg、和甚至更优选1-10mg/kg的范围内。抗体的血清浓度可以通过本领域已知的方法测定。还可以为预防疾病而施用抗体，以防止癌症或肿瘤出现。这对于具有“高正常”水平的IGF-I患者特别有用，因为这些患者已经显示出较高的形成常见癌症的危险性。参见Rosen等人，见上述。
抗体与附加治疗剂共同施用(联合疗法)包括施用含有抗-IGF-IR抗体和附加治疗剂的药物组合物，和施用两或多种分离的药物组合物，一种含有抗-IGF-IR抗体，另一种或多种含有附加治疗剂。此外，尽管共同给药和联合疗法通常意指抗体和治疗剂彼此同时施用，但它还包括这样的情况，其中抗体和附加治疗剂在不同的时间给药。例如，抗体可以每三天给药一次，而附加治疗剂可以每天一次施用。作为备选方案，抗体可以在用附加治疗剂治疗疾病之前或之后施用。类似地，抗-IGF-IR抗体的施用可以在其它疗法，比如放射疗法、化学疗法、光力学疗法、手术或其它免疫疗法，之前或之后进行。
本说明书中所引用的所有出版物和专利申请作为参考引入本文，如同各独立的出版物或专利申请特别地、独立地被指明作为参考引入。尽管为了清楚地理解，上述发明已经通过举例说明和例子在一定程度上进行了详细说明，但是根据本发明的教导，在不背离所附权利要求的精神和范围的情况下而对其作出某些改变和修饰对于本领域技术人员来说是显然的。
实施例I本发明的抗体对IGF-IR的体内效应我们根据(V.A.Pollack等人，“Inhibition of epidermal growthfactor receptor-associated tyrosine phosphorylation in humancarcinomas with CP-358，774Dynamics of receptor inhibitionin situ and antitumor effects in athymic mice”，J.Pharmacol.Exp.Ther.291739-748(1999))公开的方法在无胸腺小鼠中诱导了肿瘤。简言之，我们用0.2ml Matrigel制剂将IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞(5×106)皮下注射进3-4周龄的无胸腺(nu/nu)小鼠。然后，我们在形成确认的(即，约400mm3)肿瘤后用本发明的抗体经腹腔内对小鼠进行注射。
24小时后，我们提取了肿瘤，将其匀浆，并测定IGF-IR水平。为确定IGF-IR水平，我们将SC-713抗体稀释于Blocking(封闭)缓冲液，直至终浓度为4μg/ml，并向用Reacti-Bind山羊抗-兔(GAR)包被的板(Pierce)内各孔中添加100μl。于室温下将板振荡孵育1小时，然后用洗涤缓冲液将板洗涤五次。之后，对如上所述制备的肿瘤样品称重，将其在裂解缓冲液(1ml/100mg)中匀浆。用裂解缓冲液将12.5μl肿瘤提取物稀释至终体积100μl，并将其添加道96孔板的各孔中。室温下将板振荡孵育1-2小时，然后用洗涤缓冲液洗板五次。我们然后向各孔中添加了100μl溶于Blocking缓冲液的生物素化抗-IGF-IR抗体，并于室温下振荡孵育30分钟。然后用洗涤缓冲液将板洗涤五次。我们通过向每孔添加100μl稀释于Blocking缓冲液的链霉抗生素蛋白-HRP使得用抗-IGF-IR抗体探测的板显影，室温下振荡孵育30分钟。我们通过向各孔中添加100μl TMB微孔底物使板显色，再用100μl 0.9M H2SO4终止显色。然后我们通过测定D450nm将信号定量。将信号对总蛋白质标准化。
我们观察到，通过IGF-IR磷酸酪氨酸(磷酸化的IGF-IR)和总IGF-IR蛋白(附图4)二者的降低测定到的，用本发明的抗体，尤其是2.13.2和4.9.2，进行腹腔内注射，导致对IGF-IR活性的抑制。此外，这一抑制对所注射的抗体剂量敏感(附图4)。这些数据证明，本发明的抗体能以类似于我们在体外观察到的方式在体内靶向IGF-IR。
实施例II对3T3/IGF-IR细胞肿瘤生长的抑制我们测试了，本发明的抗-IGF-IR抗体是否会抑制肿瘤生长。我们如上所述(实施例I)诱导了肿瘤，并且当形成确认的、明显的肿瘤(即，6-9天内250mm3)时，我们通过腹腔内注射用单次0.20ml剂量的抗体处理小鼠。根据Geran等人“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors andother biological systems”，Cancer Chemother.Rep.31-104建立的方法，我们在每第三天用游标卡尺跨两个直径测量了肿瘤的大小，并用公式(长×[宽]2)/2计算了体积。
当我们用本发明的抗体进行这一分析时，我们发现，用单独的抗体2.13.2进行单次治疗抑制了IGF-IR-转染的NIH-3T3细胞-诱导的肿瘤(附图5)的生长。
附图详述附图1A-1C显示来自六个人抗-IGF-IR抗体的轻链可变区核苷酸序列彼此间的比对以及与种系序列的比对。附图1A显示抗体2.12.1(SEQ ID NO1)、2.13.2(SEQ ID NO5)、2.14.3(SEQ ID NO9)、和4.9.2(SEQID NO13)的轻链(VL)可变区核苷酸序列相互间的比对以及与种系VκA30序列(SEQ ID NO39)的比对。附图1B显示抗体4.17.3(SEQ ID NO17)的VL核苷酸序列与种系VκO12序列(SEQ ID NO41)的比对。附图1C显示抗体6.1.1(SEQ ID NO21)的VL核苷酸序列与种系VκA27序列(SEQ ID NO37)的比对。这些比对还显示了来自各抗体VL的CDR区域。附图1A-1C的共有序列分别示于SEQ ID NO53-55。
附图2A-2D显示来自六个人抗-IGF-IR抗体的重链可变区核苷酸序列相互间的比对以及与种系序列的比对。附图2A显示抗体2.12.1(SEQ ID NO3)的VH核苷酸序列与种系VH DP-35序列(SEQ ID NO29)的比对。附图2B显示抗体2.14.3(SEQ ID NO11)的VH核苷酸序列与种系VIV-4/4.35序列(SEQ ID NO43)的比对。附图2C-1和2C-2显示抗体2.13.2(SEQ ID NO7)、4.9.2(SEQ ID NO15)和6.1.1(SEQ ID NO23)的VH核苷酸序列相互间的比对以及与种系VH DP-47序列(SEQ ID NO31)的比对。附图2D显示抗体4.17.3(SEQ ID NO19)的VH核苷酸序列与种系VH DP-71序列(SEQ ID NO35)的比对。该比对还显示这些抗体的CDR区域。附图2A-2D的共有序列分别示于SEQ ID NO56-59。
附图3A显示，与种系序列相比，2.13.2和2.12.1重链和轻链的不同区域内的突变数量。附图3A-D显示抗体2.13.2和2.12.1的重链和轻链氨基酸序列与它们所来源的种系序列间的比对。附图3B显示抗体2.13.2(SEQ ID NO45)重链氨基酸序列与种系序列DP-47(3-23)/D6-19/JH6氨基酸序列(SEQ ID NO46)的比对。附图3C显示抗体2.13.2(SEQ ID NO47)轻链氨基酸序列与种系序列A30/Jk2氨基酸序列(SEQ ID NO48)的比对。附图3D显示抗体2.12.1(SEQ ID NO49)重链氨基酸序列与种系序列DP-35(3-11)/D3-3/JH6氨基酸序列(SEQ ID NO50)的比对。附图3E抗体2.12.1(SEQ ID NO51)轻链氨基酸序列与种系序列A30/Jk1氨基酸序列(SEQ ID NO52)的比对。对于附图3B-E，信号序列以斜体表示，CDR以下划线表示，恒定区为粗体，构架区(FR)突变在该氨基酸残基上方用加号(“+”)突出显示，CDR突变用星号在该氨基酸残基上方突出显示。
附图4显示，抗-IGF-IR抗体2.13.2和4.9.2减少3T3-IGF-IR肿瘤中的IGF-IR磷酸酪氨酸信号。
附图5显示，抗-IGF-IR抗体2.13.2抑制体内3T3-IGF-IR肿瘤生长。
序列表<110>Cohen，Bruce D.
Bedian，VaheObrocea，MihailGomez-Navarro，JesusCusmano，John D.
Wang，Huifen F.
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Guyot，Deborah J.
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<160>60<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>291<212>DNA<213>人<400>1tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120ccgtttacaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa c 291<210>2<211>136<212>PRT<213>人<400>2Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp1 5 10 15Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro20 25 30Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser35 40 45Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser50 55 60Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn65 70 75 80Ash Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Val Glu Ile Ile Arg
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caagggacca aggtggaaat caaac 325<210>56<211>376<212>DNA<213>人工序列<400>56caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360gtcaccgtct cctcag 376<210>57<211>358<212>DNA<213>人工序列<400>57caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc 120gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 358<210>58<211>418<212>DNA<213>人工序列<400>58caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac 180gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300ggctrsksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418<210>59<211>364<212>DNA<213>人工序列<400>59caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360tcag 364<210>60<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>60Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15
序列表<110>Cohen，Bruce D.
Bedian，VaheObrocea，MihailGomez-Navarro，JesusCusmano，John D.
Wang，Huifen F.
Page，Kelly L.
Guyot，Deborah J.
<120>抗胰岛素样生长因子I受体抗体的用途<130>PC25232A<140>
<141>
<160>60<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>291<212>DNA<213>人<400>1tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120ccgtttacaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa c 291<210>2<211>136<212>PRT<213>人<400>2Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp1 5 10 15Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro20 25 30
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Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln100 105 110His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp130 135 140Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn145 150 155 160Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu165 170 175Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp180 185 190Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr195 200 205Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser210 215 220Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>53<211>326<212>DNA<213>人工序列<400>53gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr 300gggaccrags tggaratcaw acgaac 326<210>54<211>322<212>DNA
<213>人工序列<400>54gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaarctcct gatcyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa ac 322<210>55<211>325<212>DNA<213>人工序列<400>55gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300caagggacca aggtggaaat caaac 325<210>56<211>376<212>DNA<213>人工序列<400>56caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360gtcaccgtct cctcag 376<210>57<211>358<212>DNA<213>人工序列<400>57caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc 120
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1.治疗或预防疾病的方法，其中所述疾病选自哺乳动物的多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌学疾病、缺血、和神经变性疾病，该方法包括向所述哺乳动物施用对治疗所述疾病有效的量的人抗-IGF-IR抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述液体肿瘤选自急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性mllogenic白血病(CML)；其中所述肝癌选自肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、或肝胚细胞瘤；其中所述胸腺疾病选自胸腺瘤或甲状腺炎；其中所述T-细胞介导的自体免疫疾病选自多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、或Bechet’s病；其中所述内分泌学疾病选自II型糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状腺机能减退、甲状腺炎、肾上腺皮质功能亢进和肾上腺皮质机能减退；其中所述缺血为post-cardiac缺血；其中所述神经变性疾病选自早老性痴呆。
3.权利要求1的方法，包括与选自皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、抗血管剂、和抗增殖剂的试剂联合向所述哺乳动物施用所述抗体。
4.权利要求1的方法，包括联合施用所述抗体和疫苗，其中所述疫苗选自基于GM-CSF DNA和细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同种异体或自体肿瘤疫苗。
5.权利要求1的方法，包括联合施用所述抗体和止痛剂，其中所述止痛剂选自布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、或盐酸羟考酮。
6.权利要求1的方法，包括联合施用所述抗体和抗血管剂，其中所述抗血管剂选自bevacizumab或rhuMAb-VEGF。
7.权利要求1的方法，包括联合施用所述抗体和抗增殖剂，其中所述抗增殖剂选自法尼基蛋白质转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、和PDGFR抑制剂。
8.权利要求1的方法，其中结合IGF-IR的抗体具有以下特性对人IGF-IR的结合亲和力的Kd为8×10-9或更低；抑制人IGF-IR和IGF-1间结合的IC50小于100nM；及含有包含人FR1、FR2、和FR3氨基酸序列的重链氨基酸序列，人FR1、FR2、和FR3氨基酸序列对应于VH DP-35、VIV-4/4.35、VH DP-47、或VH DP-71基因的FR1、FR2、和FR3氨基酸序列、或其中的保守替代或体细胞突变，其中FR序列与CDR1、CDR2、和CDR3序列相连，且其中抗体在其轻链中还含有来自A27、A30、或012基因的CDR区域。
9.权利要求1的方法，其中所述抗体与具有选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争和IGF-IR的结合。
10.权利要求1的方法，其中所述抗体含有包含选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列或相对于所述CDR序列而言具有改变的序列的重链和包含选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、4.9.2、4.17.3、和6.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列或相对于所述CDR序列而言具有改变的序列的轻链，其中，所述改变选自保守改变、非保守替代、添加和缺失，其中所述保守改变选自其它非极性残基对非极性残基的替换、其它极性不带电残基对极性带电残基的替换、其它极性带电残基对极性带电残基的替换、和结构相似残基的替代，其中所述非保守替代选自极性带电残基对极性不带电残基的替代、和非极性残基对极性残基的替代。
11.权利要求11的方法，其中所述抗体含有包含选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重链和包含选自2.12.1、2.13.2、2.14.3、4.9.2、4.17.3、或6.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的轻链。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体选自含有衍生自人基因DP-47的重链氨基酸序列和衍生自人基因A30的轻链氨基酸序列的抗体。
13.一种用于治疗或预防哺乳动物疾病的药物组合物，它包括对治疗所述疾病有效的量的人抗-IGF-IR抗体和药学可接受载体，其中所述疾病选自多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌学疾病、缺血、和神经变性疾病。
14.一定量人抗-IGF-IR抗体用于制备治疗或预防哺乳动物疾病的组合物的用途，其中所述量对治疗所述疾病有效，其中所述疾病选自多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T-细胞介导的自体免疫疾病、内分泌学疾病、缺血、和神经变性疾病。
15.治疗或预防哺乳动物衰老的方法，包括向所述哺乳动物施用在所述治疗或预防中有效的量的抗-IGF-IR抗体。
全文摘要
本发明涉及一种治疗方法，它包括治疗对象施用抗－IGF－IR抗体、尤其是人抗－IGF－IR抗体，优选结合施用另一种治疗剂，用于治疗某些疾病。本发明还涉及含有这些抗体的药物组合物和利用这些抗体及其组合物进行治疗的方法。
文档编号A61P9/10GK1753693SQ200480004190
公开日2006年3月29日 申请日期2004年2月3日 优先权日2003年2月13日
发明者B·D·科恩, V·贝戴安, H·F·王, M·奥布罗恰, J·戈麦斯-纳瓦罗, J·D·卡斯马诺, D·J·盖约特, K·L·佩奇 申请人:辉瑞产品公司