专利名称：琥珀酰肼类化合物及其组合物在制备治疗抗白血病药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一种具有抗肿瘤活性的琥珀酰肼类化合物及其制备方法，以及含有琥珀酰肼类化合物的组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病(CML)及费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(ALL)药物方面的应用。
背景技术：
95％慢性髓系白血病(CML)和10~25％成人急性淋巴细胞白血病(ALL)存在Ph染色体t(9；22)(q34；q11)。9号染色体上的原癌基因c-ABL易位至22号染色体上的BCR区(断裂点聚合区)，产生BCR-ABL嵌合基因，并表达BCR-ABL蛋白。该蛋白与正常ABL基因蛋白相比，酪氨酸激酶活性因失去调控，导致细胞恶性转化。在CML慢性阶段，可通过细胞毒药物(羟基脲、马利兰等)来控制，一旦疾病最终急变，患者因失去控制而死亡；近年来临床上干扰素α的应用可以使病人Ph染色体转阴，但提高病人生存机会的效果尚不确切。因此，寻找新的治疗方法达到根治白血病的目的势在必行。根据酪氨酸激酶在CML及部分ALL形成中起到关键性的生物学作用，设计出针对BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶活性的治疗被证实是一种有效的治疗策略，已经成为近几年研究的主要方向。Gleevec的出现为CML的治疗带来了希望。
Gleevec又名伊马替尼(imatinib，STI571)，化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲烷磺酸盐，是一个新型酪氨酸激酶抑制剂，为第一个针对癌基因的分子靶向性药物，靶向性地作用于ABL、BCR/ABL、血小板分化生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、和TEL-PDGFR等多种酪氨酸激酶。Gleevec是获得美国FDA批准上市的第一个靶向特定的导致肿瘤发生的基因缺陷的小分子药物，作为特效“智能炸弹”，通过竞争性抑制ABL和BCR/ABL激酶与ATP的结合，抑制这些酪氨酸激酶的活性，导致BCR/ABL的功能丧失，从而抑制癌细胞的增殖。因此，抑制BCR/ABL融合蛋白就可以阻止CML的发生与发展，而发挥治疗效应，被《Science》杂志评选为2001年十大科技突破之一。在临床试验中，每天一次口服Gleevec，剂量从25mg逐渐增加到1000mg，未发现剂量限制毒性。在300mg-1000mg的剂量组，54例既往干扰素治疗无效的CML慢性期患者均获血液学缓解，有效率达100％，且98％(53例)达完全缓解；其中53％(29例)还是细胞遗传学缓解。该药在临床治疗CML和部分ALL取得了良好的疗效，Gleevec还阻断参与某些实体肿瘤生长的其它分子通路(包括肺、前列腺和大脑)。而且Gleevec不像化学治疗药物或放射治疗，除了毁灭癌细胞外也会损伤正常细胞。Gleevec的发现开拓了以分子生物学理论抑制癌基因信号传导的治癌新方法，开创了癌症治疗的新时代。
然而，患者需连续服用Gleevec以维持药效，一些患者在治疗数月之后复发，对该药不再敏感，化疗失败。临床资料表明，尽管Gleevec对CML可以起到持久的缓解作用，但对于急变期患者来说，缓解2-6个月后，即使继续给药也无济于事，疾病的发展常常伴随着p210BCR/ABL表达升高和酪氨酸激酶活性增强。
综上所述，一方面，BCR-ABL特异性抑制剂Gleevec在临床上取得了卓越疗效，表明BCR-ABL确实是治疗CML和ALL很好的靶标即抑制BCR-Abl的酪氨酸激酶活性，就可以控制疾病；另一方面，耐药性的出现严重阻碍了疾病的有效治疗，这就需要寻找克服耐药性的方法。本发明以BCR-Abl为靶点，设计与Gleevec结合部位不同的新一代抑制剂是跨越这一障碍的有效途径，也是探索白血病靶向治疗的有效途径。
Bcr-Abl酪氨酸激酶是目前唯一被证实与人白血病发病确切相关的靶酶分子，也是唯一明确的抗肿瘤药物的理想靶标。Gleevec是第一个特异性靶向Bcr-Abl的酪氨酸激酶抑制剂，临床主要用于治疗慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及胃肠间质瘤。然而，在取得良好疗效的同时，耐药性也随之产生。因此开发新的酪氨酸激酶抑制剂将是解决耐药性问题的有效途径。本研究以ABL的非活化构象为靶点，应用SGI药物虚拟筛选工作站筛选不同于Gleevec结合位点的新的抑制剂，得到了对敏感及耐药白血病模型有体内外抑制活性的琥珀酰肼类化合物，并证实该化合物对BCR-Abl酪氨酸激酶活性的抑制作用。
发明内容
本发明的目的是为克服目前伊马替尼(Gleevec，STI-571)的耐药性，提供了一种全新的琥珀酰肼类化合物。
本发明的另一个目的在于公开了一种琥珀酰肼类化合物新的制备方法。
本发明的再一个目的是提供了含有琥珀酰肼类化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组成的药物组合物。
本发明的还一个目的是提供了琥珀酰肼类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病和成人急性淋巴细胞白血病药物中的应用。
本发明提供具有下式I的化合物 制备式I化合物一种优选的方法是把式V与碘甲烷进行格氏反应制成化合物VI，将化合物VI与水合肼反应制成化合物VII，再与对硝基苯甲醛缩合制得化合物式I，NMR和质谱确证，熔点为230-232℃。
酰肼类化合物的合成路线如下(四步)
溴苯胺与丁二酸酐的反应通常是按等摩尔量的两种反应物来完成，虽然其它比例也可以使用。反应最好在一种非质子惰性溶剂中进行，如苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷等等。反应大约在0-100℃条件下进行，优选20-35℃。将化合物V与碘甲烷反应制备化合物VI，此反应需在惰性溶剂中进行，典型的溶剂为无水乙醚、DMF、四氢呋喃等等，化合物V与碘甲烷反应的mmol比一般为1∶1-3.5，优选1∶1-1.2，反应时间大约24小时。将产物VI溶于C1-C4低级醇中如甲醇、乙醇等等，加入水合肼，产物VI与水合肼的mmol比一般为1∶10-30，优选1∶10-13，室温放置一天，析出白色晶体，过滤得到产物VII。将产物VII与邻硝基苯甲醛加热回流搅拌反应，析出白色混浊，过滤得到产物I，H-1NMR；C-12NMR确证化合物，熔点为230-232℃。
本发明所述含有琥珀酰肼类化合物的药物组合物，可以以一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂制备成各种制剂，包括各种固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂等。
固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、输液剂、粉剂制剂等等。
本发明的琥珀酰肼化合物还可以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。当非肠道给药时，本发明的组合物被制成注射制剂。本发明的化合物在相当宽的剂量范围内是有效的。例如每天服用的剂量可在每公斤体重大约0.1mg-500mg的范围内。在成人的治疗中，剂量范围最好是在1mg/kg--50mg/kg，一次或几次服用。实际服用化合物的剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态，选者的给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。
下面结合体内、体外抗肿瘤实验进一步阐述本发明的的积极效果本发明中的琥珀酰肼类化合物对人红白血病K562和Gleevec耐药模型K562/G01细胞有剂量依赖性的、Western杂交及免疫共沉淀等方法验证该化合物对抗Gleevec白血病耐药模型K562/G01细胞的生物活性。寻找对抗Gleevec型白血病细胞不产生耐药的新药，探索白血病靶向治疗的有效途径。
一、体外抗肿瘤细胞增殖实验方法采用常规MTT法测定药物体外抗肿瘤活性，取对数生长期的肿瘤细胞，用含有10％小牛血清的RMPI 1640培养液配成1×105/ml，接种于96孔微培养板(细胞数为2×104/孔，180μl/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养24hr，分组加药，每个浓度设三个平行孔，治疗组加不同浓度的药物，阴性对照加等体积的生理盐水，使终体积为200μl/孔，培养68hr后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)，37℃继续培养4hr，离心(1000转/分，10min)，弃上清，每孔加入DMSO 150μl，振荡至沉淀完全溶解；在酶标仪上检测546nm光密度(OD)值。
肿瘤细胞生长抑制率按以下公式计算抑制率(％)＝[对照组OD值-加药组OD值]/对照组OD值×100％以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药物的半数杀伤浓度IC50，即细胞存活率减少50％时的药物剂量。
结果为了寻找新结构的BCR/ABL抑制剂，我们以BCR/ABL为靶点进行高通量计算机筛选。在对29万个小分子化合物三维结构数据库进行筛选后，得到结构全新的琥珀酰肼类化合物，它不仅对敏感K562细胞有杀伤作用，而且保持对K562/G01和K562/G02耐药细胞的敏感性，图1显示，该化合物对K562和K562/G01细胞的IC50分别为32.39±7.79μg/ml、21.35±7.90μg/ml和32.86±3.51μg/ml。提示，这个新化合物不仅可以杀灭白血病细胞，而且可以克服肿瘤细胞对Gleevec的耐药性。化合物对靶蛋白(BCR-ABL)表达水平的影响方法蛋白印记杂交法(Western blot)药物处理细胞5小时后，以PBS洗涤2遍，于冰上加入冷RIPA裂解液，用超声细胞破膜仪破碎细胞，4℃，12000r/min，离心10min，移上清至另一EP管中。取相同蛋白量的细胞裂解液进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将电泳分离的蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜上，用抗c-ABL的抗体杂交后，加入相应的连接有HRP的二抗，以DAB显色。
结果图2A可见，式I化合物从10μmol/L到200μmol/L浓度下，对BCR-ABL的表达均不产生明显影响，提示该化合物是通过对激酶活性的影响而杀灭白血病细胞的。
化合物对靶蛋白(BCR-ABL)激酶活性的影响原理活化的ABL激酶可以使自身及下游蛋白的酪氨酸残基磷酸化，因此，测定磷酸化酪氨酸的量就间接显示出ABL激酶活性强弱。
方法将药物处理的细胞裂解后，于细胞裂解液中加入c-ABL抗体，4℃振摇过夜，加入蛋白A吸附免疫复合物，进行12％SDS-PAGE电泳，将电泳分离的蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜上，分别用抗actin和p-Tyr的抗体杂交后，加入相应的连接有HRP的二抗，以DAB显色。
结果琥珀酰肼类化合物在10μmol/L到200μmol/L不同浓度处理K562细胞5小时后，细胞总蛋白提取物中ABL蛋白的酪氨酸表达有不同程度的下调(图2)，从而表明该类化合物对ABL酪氨酸激酶活性有一定的抑制作用。
体内抗肿瘤实验方法利用BCR-ABL阳性表达的人白血病K562细胞建立裸鼠移植瘤模型，用以在体内评价化合物抗肿瘤作用。Balb/c nu/nu裸鼠，雌性，周龄5周，体重12-17g，经137铯400rad照射，第三天于右前肢根部背侧皮下接种K562细胞，每只小鼠接种细胞数为1×107细胞/0.2ml，第五天将动物随机分组，每组3只。
分组和剂量设置实验分阴性对照组和治疗组，阴性对照组给予相应的溶剂，治疗组中式I化合物设高剂量(750mg/Kg)和低剂量(500mg/Kg)两组。于随机分组当日(即移植瘤接种后第3天)开始给药，间隔3天用药一次，连续5次，腹腔注射。
使用游标卡尺三天一次测量裸鼠移植瘤模型肿瘤直径，动态观察药物的抗肿瘤效应，肿瘤体积的计算公式为V(mm3)＝L×l2/2L和l分别为肿瘤的长径和短径每次测量的相对肿瘤体积比(Relative Tumor Volume，RTV)的计算公式为RTV＝Vn/V0V0为分组治疗开始时测量的体积，Vn为每一次测量时的体积抗肿瘤活性评价指标为肿瘤抑制率(IR％)，采用下面公式计算IR％＝(1-TRTV/CRTV)×100％TRTV为治疗组RTV，CRTV为对照组RTV毒性评估每次测量时称裸鼠体重，计算相对体重比(Relative Body Weight，RBW)以评估药物的毒性反应。
RBW＝Wn/W0Wn为测量时体重，W0为分组治疗开始时体重结果式I化合物显示出剂量依赖性的体内抗肿瘤活性。表1可见，低剂量化合物I(500mg/kg)治疗组肿瘤生长速度较生理盐水对照组明显减慢，抑瘤率为45.82mg/kg，有显著治疗学意义；高剂量(750mg/kg)的抑瘤率达到63.81％，相对瘤体积与溶剂对照组具有显著性差异(P＜0.05)，从治疗学角度来讲，这是有意义的，说明式I化合物在体内能有效控制肿瘤生长。
在观察抗肿瘤药物药效作用的同时，必须密切注意化合物本身的毒性，治疗后裸鼠体重变化间接反映药物的毒性，我们采用相对体重比衡量不同治疗组间裸鼠体重的变化情况。表2对裸鼠体重的分析表明未治疗对照组小鼠体重呈逐渐增长趋势，750mg/kg治疗组小鼠体重有下降趋势，但与对照组体重无显著性差异。500mg/kg治疗组体重增长趋势与对照组相当。表明该化合物在750mg/kg和500mg/kg两个治疗剂量下是安全有效的。
Table1 式I化合物对裸鼠K562移植瘤的治疗作用
*与对照组比较Table2 式I化合物对K562移植瘤裸鼠体重的影响
*与对照组比较
图1为式I化合物对敏感及耐药白血病细胞的杀灭作用。细胞经不同浓度的式I化合物处理72h后，以MTT法测定药物对人红白血病K562细胞及Gleevce耐药白血病K562/G01、K562/G02细胞的生长抑制曲线；图2为式I化合物对BCR-ABL酪氨酸激酶表达及活性的影响。裂解细胞，提取总蛋白，以Western blotting方法，观察式I化合物在200μM(A)、100μM(B)、50μM(C)、10μM(D)下对BCR-ABL表达的影响；以免疫共沉淀的方法测定式I化合物在上述浓度下对BCR-ABL激酶活性的影响，(E)为溶剂对照；图3为式I化合物的H-1NMR；图4为式I化合物的C-12NMR。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围，本发明的化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，熔点(m.p.)进行检测，随后可以采用核磁共振(1HNMR/13CNMR)等更进一步确证其结构。
实验中所需要的中间体可以从市场买到或可容易地通过上面叙述过的方法或其它文献中已知的方法制得。
实施例1琥珀酸单(对溴苯)酰胺(化合物V)的制备将对溴苯胺(7.08g，40mmol)和丁二酸酐(4.48g，40mmol)溶于300ml氯仿中室温搅拌，反应过夜，析出针状晶体，过滤得到产物V9.80g，产率88.44％。
实施例2琥珀酸1-(对溴苯)酰胺4-甲酯(化合物VI)的制备将产物V(5g，18mmol)和碘甲烷(3.33g，23mmol)溶于100ml DMF中，加入碳酸氢钾(2.35g，23mmol)，室温搅拌16小时.反应液用二氯甲烷稀释，反复水洗，碳酸氢钠洗，无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂得到产物VI5.0g，产率95.45％。
实施例3琥珀酸1-(对溴苯)酰胺4-酰肼(化合物VII)的制备将产物VI(38g，13mmol)溶于150ml乙醇中，加入水合肼(0.72g，144mmol)，室温放置一天，析出白色晶体，过滤得到产物VII3.5g，产率87.72％。
实施例4琥珀酸1-(对溴苯)酰胺4-(间硝基苯)酰腙(化合物I)的制备将产物VII(2.8g，9.6mmol)和邻硝基苯甲醛(1.6g，10.6mmol)溶于100ml乙醇中，100℃，回流搅拌反应，析出白色混浊，过滤得到产物VIII3.8g，产率90.48％。H-1NMR见图3；C-12NMR见图4。
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制剂实施例。这些实施例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。制剂可以采用本发明中的任意一个化合物作为活性成分。
实施例1每片含100mg活性成分的片剂制备mg/片化合物I 100乳糖50微晶纤维素 80淀粉50羟甲纤维素 40硬脂酸镁5将活性成分，乳糖、淀粉、微晶纤维素过100目筛，并充分混匀，将2％羟甲纤维素水溶液加入到上述混合粉末中混合，过20目筛制软材，制得湿颗粒于45-55℃干燥，将羧甲淀粉钠、硬脂酸镁加入到上述的干燥颗粒中压片。
实施例2每囊含100mg活性成分的胶囊的制备如下用量/囊重量浓度(％)化合物I 100mg 30.0聚氧乙烯脱水山梨0.05mg 0.02糖醇单油酸酯淀粉250mg 69.98总计350.05mg 100.00实施例3注射剂的制备化合物I 100mg柠檬酸钠50mgPEG3000 10mg氢氧化钠适量蒸馏水 10ml使pH值为7.5-8.5过滤，滤液浓度为1毫克/毫升，按每安瓶2毫升分装，灭菌，即得注射剂。
权利要求
1.具有式I的化合物
2.权利要求1的式I化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病及费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病药物方面的应用。
3.一种用于治疗急、慢性粒细胞白血病的药物组合物，它包含作为活性成分的式I化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
4.制备下式化合物的方法 它包括将式V的格氏化反应制备化合物VI， 化合物VI与水合肼反应制备化合物VII； 化合物VII与下式化合物进行反应制备式I化合物
全文摘要
本发明涉及琥珀酰肼类衍生物及含它们的药物组合物，以及该组合物在制备治疗抗白血病药物中的应用。本发明的琥珀酰肼类衍生物，经药理实验显示出对BCR－Abl酪氨酸激酶活性的抑制作用。同时具有高效、低毒的特点，因此作为药物化合物有望在治疗慢性粒细胞白血病(CML)及费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(ALL)药物方面的应用，尤其是对Gleevec产生耐药性的病例效果更加明显。
文档编号A61K31/16GK1990462SQ20051013365
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者齐静, 杨纯正, 彭晖, 纪庆, 王建祥, 王彩云 申请人:中国医学科学院血液学研究所