专利名称：：替加环素葡糖苷酸代谢物及其差向异构体的制作方法替加环素葡糖苷酸代谢物及其差向异构体本发明涉及替加环素(tigecycHne)的葡糖苷酸、更具体是葡糖苷酸衍生物、制备它们的方法以及含有它们的药物组合物。替加环素(GAR-936)是甘氨酰环素类抗生素，并且是半合成四环素一一米诺环素一一的类似物。它随着出现对抗生素的耐药性的全球性威胁而被开发出。替加环素在体外和体内均具有广镨抗菌活性。与四环素类抗生素类似，甘氨酰环素类抗生素通过抑制细菌的蛋白质翻译而起作用。包M加环素在内的甘氨酰环素对多种耐抗生素的革兰氏阳性病原菌如耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Sto/^j^a^ow耐青霉素肺炎链球菌(ift考,ococc"s/meum卵/ae)和耐万古霉素肠球菌(e"teiwocd)具有活性(Weiss等人，1995;Fraise等人1995)。替加环素对抗带有两种主要形式的四环素耐药性一一外流和核糖体保护一一的菌抹的活性具有重要意义(Schnappinger和HHlen，1995)。四环素类抗生素很少或不经过代谢。已有报道米诺环素在人体内进行9-幾基化和N-脱甲基，但是程度有限(Ndis和DeLeenheer，1982)。还有报道大部分四环素类抗生素在C4位置进行差向异构化，差向异构化通常:ML认为是降解而非代谢途径(Remmers等人，1963)。将"C替加环素静脉内施用于健康男性志愿者后分析了药物的代谢处置，并且还将^研究的结果与大鼠和狗的临床前代谢研究所获得的结果进行了比较。将"C1替加环素静脉内施用于健康男性志愿者后，对血清、尿液和粪便中基于放射性标记的替加环素的组分进行了分析。将非放射性替加环素静脉内施用于男性志愿者后分析了人血清和尿液，报道了类似的结果，其中报道了最少的代谢。非标记性研究与使用大鼠和狗的代谢研究的结果一致，在后者中替加环素是静脉内施用后血浆和尿液中主要的与化合物有关的组分。在本文中，在^^基质中还观察到了替加环素的差向异构体和M3a(叔丁基氨基乙酸)。已经表明替加环素的差向异构体是降解物而非代谢物，并且向异构体。血清和粪便样品中替加环素差向异构体的量可能被高估了，因为在用于这些基质的提取操作过程中大量替加环素被转化为了差向异构体。在大鼠和狗的血浆和尿液中还观察到了推测是M3a的早期洗脱色镨峰。来自本研究的在血清、尿液和粪便中检测出的与替加环素有关的化合物显示在流程图l中。流程图l.在Ajk清、尿液和粪便中检测出的与"C1替加环素有关的化合物5OHOO替加环素Y入叔丁基氨基乙酸(M3a)S、U和F中的代谢物o69-氨基米诺环素(M3)S和U中的代谢物0OHOo替加环素差向异构体S、U和F中的降解物,葡糖醛酸替加环素葡糖苷酸(M7)和替加环素葡糖苷酸的差向异构体(M6)S、U和F中的代谢物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>N-乙耽基9-氨基米诺环素(M9)和N-乙跣基9-氣基米诺环素的差向异构体(M8)羟基替加环素(Ml、M2、M4)U中的痕量代谢物S和U中的代谢物S:血清；U:尿液；F:粪便；,表示放射性标记的位点在血清和粪便样品的放射色镨图中既观察到了M6(替加环素葡糖苷酸的差向异构体)，又观察到了M7(替加环素葡糖苷酸)。葡糖苷酸化的位置尚未知晓。代谢物及其差向异构体的可能结构显示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>差向异构体在尿液样品的放射色镨图中观察到了M7，但没有观察到M6。以前没有在体外釆用AJf^^体或AJf细胞的实验中或者在体内在大鼠、狗或人中报道替加环素的葡糖苷酸化。以前采用未标记的替加环素并采用用于初步评价替加环素代谢的LC/MS样品分析，对AjfcL清和尿液进行分析。在该研究过程中，没有特别地研究葡糖苷酸代谢物，使用["C1替加环素进行了体内大鼠和狗样品的分析，没有观察到葡糖苷酸化。在科学文献中没有将葡糖苷酸化确定为四环素类抗生素的代谢途径的已知报道。代谢物M6和M7可以用作替加环素的前药。一旦施用，/S-葡糖醛酸糖苷酶可以切割M6和M7而释放替加环素。作为M6和M7施用而非直接施用替加环素可以改变药物的吸收、分布、代谢、排泄和/或副作用特性.此夕卜，这些化合物还可以直接用作抗微生物剂，附图简述图l是人单次静脉内施用50mg剂量"C替加环素后尿液和粪便中放射性消除的均值(ISD);图2是随时间推移血清中替加环素和放射性浓度的均值(ISD);图3A显示了在"C1替加环素给药后1小时从受试者1提取的人血清的HPLC放射色^普图；图3B显示了在「CI替加环素给药后8小时从受试者l提取的人血清的HPLC放射色镨图；图4是在"CI替加环素给药后8小时从受试者1提取的人血清的联合LC/SRM色镨图；图5A是在"C替加环素给药后0-4小时从受试者4收集的人尿液的HPLC放射色i脊图；图5B是在["Cl替加环素给药后24-48小时从受试者4收集的人尿液的HPLC放射色镨图；图5C是在"Cl替加环素给药后24-48小时从受试者4收集的人粪便的HPLC放射色^普图；图6是于37t;在人尿液中孵育的["C]替加环素的稳定性；图7是在"Cl替加环素给药后0-4小时从受试者8收集的人尿液的联合质谦图；图8是在14<:1替加环素给药后34.2小时从受试者8收集的所提取的人粪便的HPLC放射色谦图；图9是替加环素的m/z586质谱的子离子(production);图IO是替加环素差向异构体的m/z586质谱的子离子；图11是M2的m/z602质镨的子离子；图12A是vMwA尿液中分离的M3a的放射色镨图；图12B是^v尿液中分离的M3a的质镨图；图13是M3a的LC/MS质i普；图M是人血清中M3(^氨基米诺环素)的m/z4"+456SRM跃迁的LC/SRM色镨图；图15是M6的M/Z762质i普的子离子；图16是M7的M/Z762质^瞽的子离子；图17是M9的M/Z515质镨的子离子；图18是对替加环素葡糖苷酸所提出的结构和质镨碎裂流程图；图19A是人尿液LC/MS分析的UV色镨图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)；图19B是人尿液LC/MS分析的选择质镨图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)；图19C是人尿液LC/MS分析的选择质谱图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)；图20A是替加环素葡糖普酸的m/z762质谦的子离子的满刻度图，(B)是M大以显示较低强度的子离子的图；图20B是替加环素葡糖苷酸的m/z762质语的子离子图，被放大以显示较低强度的子离子；图21A是人尿液m/z762分析的子离子的LC/MS/MS色镨图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)，该图显示了低强度的子离子；图21B是人尿液m/z762分析的子离子的LC/MS/MS色谱图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)，该图显示了低强度的子离子；图21C是人尿液m/z762分析的子离子的LC/MS/MS色谱图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)，该图显示了低强度的子离子；图21D是人尿液m/z762分析的子离子的LC/MS/MS色谱图(其中人尿液来自施用了替加环素的受试者)，该图显示了总离子色谙图；图22是于37X:在人血清中孵育的["C1替加环素的稳定性；图23A显示了来自直接输注从人尿液收集的HPLC级分的替加环素葡糖苷酸的子离子；图23B是替加环素葡糖苷酸的质谱，该图显示了来自直接输注从人尿液收集的HPLC级分的m/z762质谙的子离子；图24A是来自>^^>^尿液中分离的替加环素葡糖苷^LC/MS分析的替加环素葡糖苷酸的LC/MS谱；图24B是来自^A尿液中分离的替加环素葡糖苷酸LC/MS分析的替加环素葡糖苷酸m/z762质镨的MS2;图24C是来自^MvA尿液中分离的替加环素葡糖苷虹C/MS分析的替加环素葡糖苷酸m/z762M86a质镨的MS3;图24D显示了来自v^wA^泉液中分离的替加环素葡糖苷酸丄C/MS分析的替加环素葡糖苷酸的子离子；图25是来自合成的N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的HPLC分析的UV色镨图；图26A是由替加环素的m/z586的碰撞活化解离得到的MS/MS镨所提出的碎裂流程图；图26B是由替加环素的m/z586的碰撞活化解离得到的MS/MSi瞽；图27A显示了替加环素差向异构体的m/z586质镨的子离子；图27B是替加环素差向异构体的m/z586质镨；图28A显示了M3的m/z473质i脊的子离子；图28B;UVI3的m/z473质i瞽；图29A显示了M7的m/z762质镨的子离子；图29B是M7的m/z762质错；且图30显示了兔血清中替加环素及其代谢物的LC/SRM色谱图，在m/z515+498迹线中显示了M9;图31是兔血清的联合LC/SRM色谱图；且图32是显示了所提出的替加环素在小鼠、大鼠、兔、狗和人中的代谢途径的流程图。可以确定，用替加环素治疗人可产生替加环素葡糖苷酸代谢物及其差向异构体。在人血清、尿液和粪便中发现了该代谢物及其差向异构体，随后对它们进行了提取和分析。本发明的详细的实验方面在对照实施例l-3和实施例1-10中给出，其描述了替加环素给予6名健康男性志愿者后的质量平衡和代谢物特征。对照实施例l-3讨论了在血清、尿液和粪便中的对照实验，这些对照实验用于帮助确定替加环素在这些培养基中的相对稳定性。另一方面，实施例1-10涉及对上述6名志愿者进行的实验，参照流程图l，通过血清和尿液的LC/MS分析还检测出了代谢物M3(9-氨基米诺环素)、M8(N-乙^-9-^JjJt诺环素的差向异构体)和M9(N-乙酰基-9-氨基米诺环素)。因为这些代谢物在叔丁基氨基乙酰氨基侧链的酰胺水解后形成，所以它们不带有放射性标记。因此，这些代谢物在血清和尿液中的浓度只能由LC/MS数据进行估计。才艮据这些数据，M3和M8显示出是血清和尿液中的次要代谢物，而M9显示出是血清中的次要代谢物但是以与M7相当的浓度存在于尿液中。已经报道了M3存在于大鼠、狗和人的尿液和血浆(对于人是血清)中，但是以前没有报道N-乙酰基代谢物(M8和M9)。因为代谢物M8和M9不带有放射性标记，所以它们可能已经存在于来自以前的大鼠和狗代谢研究的样品中，但是没有被检测出，因为它们没有特别通过LC/MS来研究。人排泄物中放射性的平均总回收率是91.8%(±5.6，n=3),其中33.2±1.9%在尿液中排泄，58.6±4.4%在粪便中排泄(图1)。这些数据与来自大鼠和狗的数据一致，在大鼠和狗中，在各物种中单次静脉内"C1替加环素给药后有约89%(包括沖洗笼子)的剂量被回收。在大鼠中，在尿液中回收34%,在粪便中回收53%，而在狗中，在尿液中回to60/。，在粪便中回收47%。血清中的放射性比血清中的替加环素浓度降低快得多(图2)。该差异可能是由大量未标记的替加环素在施用["C替加环素之前就已分布到组织中所引起的，这可能已经限制了一些组织对fq替加环素的摄取。这种"后进先出"现象最可能产生对总放射性而言比替加环素小得多的分布容积和高得多的清除率。在前48小时内，约50。/。的"C替加环素剂量被回收(27。/。在尿液中，24%在粪便中)。在所分析的尿液样品中，15%的剂量作为未变化的替加环素被排泄，2.0%作为替加环素的差向异构体被排泄，4.1。/o作为M7被排泄，6.3。/。作为M3a被排泄。在粪便匀浆样品中，9.9%的剂量作为未变化的替加环素被排泄，5.5%作为替加环素差向异构体被排泄，5.4。/。作为葡糖苷酸(M6+M7)被排泄，1.5。/。作为M3a被排泄。作为M3a而被排泄的放射性被认为与形成的M3、M8和M9的量(约8。/。的剂量)相当。但是，因为代谢物M3、M8和M9不含放射性标记，所以它们在血清、尿液和粪便中的浓度不能被准确评价。使用LC/MS在尿液中检测出了痕量的羟基替加环素代谢物(M1、M2和M4)，但是通it^射色镨法没有检测出它们。以前已经报道了这些羟基替加环素代谢物作为痕量代谢物存在于大鼠和狗的血浆和尿液以U血清和尿液中。但是，以前报道的这些代谢物在人血清和尿液中的估计浓度低于M究中放射色谱法的检测限。报道了替加环素的N-去甲基代谢物作为痕量代谢物存在于来自以前研究的大鼠血浆和尿液以及单独的A^液样品中。在;Mf究中，在任何所分析的样品中均没有检测出该代谢物。4^9f究仅评价了"C1标记的替加环素剂量的处置，而没有说明在未标记的剂量中剩余的任意与替加环素有关的产物。因此，本文报道的与替加环素有关的产物的估计浓度预计低估了这些組分在血清、尿液和粪便中的实际浓度。实际上，^研究中总替加环素(放射性标记的和未标记的)在血清和尿液样品中的浓度始终高于(通常高10至300y。)使用["Cl替加环素剂量的放射性浓度和比活性对那些相同样品所计算的浓度。根据本研究中所用的给药方案(多次施用未标记的剂量，然后单次施用"q标记的剂量)和所报道的长的替加环素半衰期，这并不是无法预料的。因此，对他泉男性志愿者多次静脉内施用替加环素、然后单次施用[14C标记的替加环素后，在血清、尿液和粪便中主要的放射性标记的组分是未变化的替加环素。替加环素的主要代谢途径是葡糖苷酸化和酰胺水解、然后N-乙酰化。在各样品中还检测出了降解产物替加环素的差向异构体。根据别处报道的总放射性浓度计算了血清、尿液和粪便中与替加环素有关的组分的浓度。使用剂量的比活性(1.00jiiCi/mg)将这些浓度转化为ng替加环素等同物。然后使用该值、根据放射色谱图中的放射性分布估计了特定组分的浓度。这些浓度仅反映了["ci标记的替加环素剂量的处置，而没有说明在未标记的剂量中剩余的任意与替加环素有关的产物。来自受试者1的在给药后1和8小时的血清提取物的代表性HPLC放射色镨图显示在图3A和3B中。对于不同受试者和不同时间点，血清提取物的代谢物概况是类似的。表l显示了放射性在血清提取物中的相对分布和与"C1替加环素有关的各组分在血清中的估计浓度。表l.由静脉内单次施用50mg剂量"C标记的替加环素的健康男性受试者所提取的血清样品中放射性的相对分布和估计浓度时间(小时)受试者M3a相对分布(X)'和估计浓度(ng-替加环素等同物/mL)^M7您愁替加环素5.2(11)NDND25.5(54)66.3(140)10.9(16)ND1.1(1.6)29.3(42)55.7(80)6.8(9.0)NDND21.8(29)70.2(92)13.5(20)NDND27.7(40)54.2(79)10.1(17)NDND20.4(35)68.1(120)12.4(13)1.2(1.3)1.8(1.9)22.1(24)61.7(66)9.8±3.20.2±0.50.5±0.824.5±3.662.7±6.617,0(22)ND3.6(4.6)24.0(31)51.0(65)17.0(12)3.8(2.7)11.6(8.1)21.6(15)42.3(30)10.9(5.6)ND5.9(3.0)22.1(11)60.4(31)24.7(15)3.5(2.1)7.7(4.5)19.2(11)43.2(26)14.9(")2.8(2.0)6.9(4.9)24.7(18)47.5(34)15.9(11)7.7(5.3)18.3(13)11.4(7.9)45.2(31)16.7±4.53.0:t2.99.0±5.320.5±4.948.3±6.712.3(9,6)3.0(2.3)■14.1(11)21.7(17)45.5(36)23.9(11)6.5(2.9)12.4(5,6)18.3(8.2)37.5(17)16.7(5.3)ND5.4(1,7)21.0(6.7)57.0(18)27.5(8.8)2.6(1.0)13.0(4.2)15.9(5."41.0(13)12.7(4.2)ND3.4(1.1)22.2(7.3)59.1(20〉21,2(10)8.0(3.8)23.2(11)10.7(5."37.0(18)19.1土6,23.4±3,3".9±7.118.3±4.446.2±9.74568均值±SD4568均值±SD14568均值±SDa.相对分布通过来自一式两份样品的HPLC放射色谱图中的峰面积积分来测定。b.在括号中，作为ng-替加环素等同物/mL的相对浓度通itir清放射性浓度(作为ng-替加环素等同物/mL)乘以来自HPLC放射色谱图的分布百分比来估计。c.检测P艮是lng等同物/mL。d.在血清提取物中观察到的大部分替加环素差向异构体可能是提取操作的结果。ND.表明未检测出代谢物并被指定为O值.根据剂量溶液的比活性、别处报道的血清放射性浓度和放射性在各样品中的相对分布估计了浓度。对于在所有时间点的所有受试者，替加环素是,皮检测出的主要的与药物有关的组分，在1小时其占63%的^1射性，在4和8小时分别降到了48和46%(表1)。替加环素的差向异构体是存在的含量第二多的与药物有关的组分，其为放射性的约20%。但是，血清提取物中的大部分替加环素差向异构体可能在提取操作过程中就已经形成了。对提取过程中形成的差向异构体进行校正后，血清样品中差向异构体的量降至5至8。/。，替加环素的量增加至59至80%。在l小时时替加环素葡糖苷酸(M7)占低于l。/。的放射性，但是在4和8小时分别增加至9至12%。在约一半所分析的血清样品中检测出了替加环素差向异构体的葡糖苷酸(M6)，其占低于4%的放射性。在所有血清样品中均检测出了保留时间为4-7分钟的早期洗脱色镨峰(M3a，叔丁基氨基乙酸)，其占10至20%的放射性，图4显示了在血清中检测出的与替加环素有关的化合物的联合LC/SRM色谱图(使用LC/MS/MS、以所选反应监测(SRM)模式收集)，所述与替加环素有关的化合物包括9-氨基米诺环素(M3)、N-乙酰基-9-氨基米诺环素的差向异构体(M8)和N-乙酖基-9-氨基米诺环素(M9)。因为叔丁基氨基乙酰J(J^侧链被切割，所以这些代谢物不带有放射性标记，并且它们不能使用放射性流检测来定量，根据LC/MS分析，它们是血清中的次要代谢物。在"C替加环素给药后48小时内约27%的放射性剂量在尿液中排泄。来自受试者4的在给药后0-4和24-48小时收集的尿液的代表性HPLC放射色镨图显示在图5A-5C中。在受试者之间和在不同时间点，尿液的代谢物概况是类似的。表2提供了放射性在尿液样品中的相对分布和与"C1替加环素有关的各组分在尿液中的估计浓度。表2.由静脉内单次施用50mg剂量^C标记的替加环素的健康男性受试者的尿液样品中放射性的相对分布和估计浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a.相对分布通过来自一式两份样品的HPLC放射色镨图中的峰面积积分来测定。b.在括号中，作为吗-替加环素等同物/收集物的相对浓度通过总尿液放射性(作为吗-替加环素等同物)乘以来自HPLC放射色语图的分布百分比来估计。c.检测限是卯ng等同物/mL.(1.对于受试者6，24-48小时的收集是部分收集.ND.表明未检测出代谢物并指定为O值，根据剂量溶液的比活性、别处报道的尿液放射性浓度和放射性在各样品中的相对分布估计了浓度。作为与["CI替加环素有关的各种组分而在尿液和粪4更中排泄的["C1替加环素剂量的百分数显示在43中。表3.作为与替加环素有关的组分而排泄的"C替加环素剂量的百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a，对于24-48小时的尿液、总尿液、粪便样品和总项目，n=5，因为从6号受试者收集的尿液和粪便是不完全的。b.粪便匀浆提取物中观察到的大部分替加环素差向异构体可能是提取操作的结果ND.表明未检测出代谢物，对于所有受试者，替加环素是在尿液中排泄的主要的与药物有关的组分(表2),在前48小时内约15%的剂量作为未变化的药物在尿液中排泄(表3)。被确定为替加环素差向异构体的尿液放射性的量从0-4小时收集物中的5%;^射性增加至24-48小时收集物中的11%。一些差向异构体可能在膀胱中就已经形成了，如稳定性分析所表明的，该分析表明，当于371C在尿液中孵育时，替加环素降解为差向异构体(图6)。在前48小时内总共2%的放射性剂量作为替加环素的差向异构体在尿液中排泄。代谢物M7仅是0-4小时收集物中的次要组分，但是其在4-8、8-24和24-48小时收集的样品中占约20%的尿液放射性。M3a占15至37。/o的尿液放射性，并Jbf目对于替加环素而言其随时间的推移而增加。在48小时内在尿液中排泄的代谢物M3a和M7的量分别占放射性剂量的6和4%。图7显示了在尿液中检测出的与替加环素有关的化合物的联合质镨图。放射性标记的羟基替加环素代谢物(M1、M2和M4)以及M6被认为是痕量尿液代谢物，它们在尿液中占低于1%的放射性。代谢物M3、M8和M9不带有放射性标记，因此仅能根据LC/MS分析来估计它们的相对量。根据LC/MS数据，M3和M8是次要代谢物，而M9以类似于M7的浓度存在。在放射性给药后48小时内，约24%的放射性在粪便中被回收。来自受试者8的给药后约34小时内收集的粪便提取物的代表性HPLC放射色谦图显示在图8中。在受试者之间和对于收集的所有粪便样品，粪便的代谢物概况是类似的。放射性在粪便提取物中的相对分布和与"C替加环素有关的各组分在粪便中的估计浓度显示在^3中。静脉内单次施用50mg剂量"CI标记的替加环素后从健康男性受试者提取的粪便匀浆物样品中放射性的相对分布和估计浓度受试者l-6.741.8小时(0.56)受试者4-13.924.2小时(0.30)受试者5-7.525.2小时(0.81)受试者5-5.930.0小时(0.55)受试者7-4.232.0小时(0.20)受试者8-6.224.6小时(0.25)受试者8-4.129.8小时(0.49)受试者8-3.934.2小时(0.17)8.9(0.75)21.3(1.8)21.5(1.8)28.1(2.4)13.7(1.2)5.8(0.13)23.5(0.51)11.9(0.26)44,9(0.97)ND4.1(0.44)10.4(1.1)21.8(2.4)39.9(4.3)16.3(1.8)5.6(0.52)13.3(1.2)26.7(2.5)48.3(4.5)ND3.0(0.14)10.4(0.49)22.3(1.0)50.7(2.4)9.4(0.44)ND9.8(0.40)26.3(1.1)47.7(2.0)10.0(0.41)6.8(0.82)21.6(2.6)21.4(2.6)39.1(4.7)7.0(0.84)7.5(0.32)26.3(1.1)23.8(1.0)32.8(1.4)5.7(0.25)相对分布(y。)"和估计浓度(mg-替加环素等同物/收集物)b'eM3aM6M7f:^:d替加环素其它'和间？受收给，a.相对分布通过来自一式两份样品的HPLC放射色i普图中的峰面积积分来测定。b.在括号中，作为1^-替加环素等同物/收集物的相对浓度通过总粪便放射性(作为1^-替加环素等同物)乘以来自HPLC放射色谙图的分布百分数来估计。c.检测限是0.15吗等同物/g匀浆物.d.在粪便匀浆提取物中观察到的大部分替加环素差向异构体可能是提取操作的结果。e.其它色谱峰的保留时间为41至46分钟。ND.表明未检测出代谢物。从受试者6中没有收到粪便样品。根据剂量溶液的比活性、别处报道的粪侵放射性浓度和放射性在各样品中的相对分布估计了浓度。对于所有粪便样品，替加环素是主要的与药物有关的组分，其占粪^^射性的28-51%(表3)。这与在48小时内约10%的放射性剂量作为未变化的药物在粪便中排泄(表2)是一致的。替加环素的差向异构体是粪便提取物中主要的与药物有关的组分，其占粪m射性的12-27%和放射性剂量的5.5%。对于血清，大量替加环素差向异构体在提取操作过程中形成。对在提取操作过程中形成的差向异构体进行校正后，在所有样品中差向异构体的量均降至4氐于12V。，而替加环素的量增加至39至66%。代谢物M7占粪便中放射性的10-26。/。，而M6占至多90/。。在0-48小时的粪便样品中葡糖苷酸代谢物占放射性剂量的约5.5%。M3a占粪便中放射性的4至14%,低于2V。的剂量作为M3a在粪便中排泄。在一些粪便样品中观察到了另外的峰，这些峰占粪^^射性的至多16%和占剂量的约2%。粪便样品的LC/MS分析没有检测到任何另外的代谢物。表4给出了在血清、尿液和粪便中观察到的与替加环素有关的化合物的汇总。表4.静脉内单次施用50mg剂量"CI标记的替加环素后在人血清、尿液和粪便中观察到的与替加环素有关的化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>人血清、尿液和粪便中被鉴定的替加环素代谢物的质镨数据在下文进行讨论。使用LC/MS分析对人血清、尿液和粪便以及大鼠和狗的血浆和尿液中的替加环素代谢物进行了鉴定(表5)。这些代谢物的结构显示在流程图1中。可以预计，可使用标准色镨技术来分离基本上纯的M6或M7。例如，实施例7、8和9中所用的HPLC参数将预计提供基本上纯的M6和M7的等分试样。因此，另一方面，本发明提供了基本上纯形式的如本文所述的替加环素代谢物，例如其纯度^卯％，优选^95%或更高的纯度，例如98%。勤.在人、狗和/或大鼠中检测出的替加环素及其代谢物的质镨数据汇总代谢物物种1MWM+H+的子离子M3a(叔丁基M乙酸)RD，H131132M6(替加环素葡糖苷酸的差向异构体)H761762586,569，513,211，86M7(替加环素葡糖苷酸)H761762586，569，513，211，154，86M8(N-乙6SfeJ-9-^米诺环素的差向异构体)H514515498，456,411,154M3(9-氨基米诺环素)R，D，H472473456M9(N-乙酰基-9-IC^米诺环素)H514515498，456，411，154轻基替加环素RD，H601602585，529，472，211,154，86替加环素的差向异构体RD，H585586569，513，456，411，211，154，86替加环素R，D，H585586569，513，482，456，411，211，154，861R=大鼠，D-狗，H-人在血清、尿液和粪便中观察到了替加环素。研究了替加环素可靠标准的质镨特征以与代谢物进行比较。在替加环素的LC/MS谱中，在m/z586处观察到了质子化的分子离子[M+H广。由替加环素的m/z586的碰撞活化解离得到的MS/MS谱和所提出的碎裂流程图显示在图9中。由m/z586失去NH3产生m/z569子离子。m/z513处的子离子代表从叔丁基氨基乙酰氨基(TBAAA)侧链中失去叔丁基氨基。失去整个TBAAA侧链和随后失去4-二甲基氨基分别在m/z456和411处产生子离子。m/z211处的子离子来源于四环素环系的D环，如在碎裂图中所表明的。m/z86离子代表叔丁基M亚甲基。在血清、尿液和粪便中观察到了替加环素的差向异构体。该产物在m/z586处产生M+H+。图10中所示的m/z586质镨的子离子包括m/z569、513、456、411、211、154和86，对于替加环素它们也存在。根据其相对保留时间短于替加环素的相对保留时间而将其鉴定为差向异构体。在尿液中观察到了痕量的代谢物M1、M2和M4。这些代谢物在m/z602处产生[M+H广。对M2所提出的碎裂流程图和m/z602质镨的子离子显示在图11中。m/z529和472处的子离子分别比替加环素在m/z513和456处的相应离子大16Da。il^明四环素环而不是叔丁基氛基乙酰^是代谢部位。在m/z211处子离子的存在(对于替加环素而言也观察到其存在)消除了四环素的D环作为代谢部位。M1和M4与M2的质谦数据类似，只是对于M1或M4没有观察到m/z211子离子。因此，Ml、M2和M4代谢物是四环素部分氧化的产物。在血清、尿液和粪便中观察到了作为早期洗脱放射色语峰的代谢物M3a。从人尿液中分离该早期洗脱M3a峰，然后用正相HPLC进行LC/MS分析，得到了显示于图12A和12B的放射色谱图和质谱图。在m/zl32和173处分别观察到了M3a的M+H+和MH+CH3CN广，如图13所示。it^明分子量为131。由于失去放射性标记仅通过LC/MS在血清和尿液中观察了痕量的代谢物M3。在m/z473处观察到了代谢物M3的M+H广。m/z473质镨的子离子包括失去NH3所产生的m/z456(数据未显示)，它是与替加环素有关的化合物的特征。在血清样品中，通过监测m/z473^456SRM跃迁观察到了该代谢物，如图14所示。在狗代谢研究中，将M3鉴定为CL-318614(9-氨基米诺环素)。提出已经通过TBAAA侧链的酰胺7JC解产生了代谢物M3，而放射性标记的叔丁基氨基乙酸(M3a)为副产物，在血清、尿液和粪便中观察到了代谢物M6和M7。在m/z762处观察到了M6和M7的[M+H广，其比替加环素大176Da。M6和M7的质镨数据类似。m/z762处的质子化的分子离子峰表明存在替加环素葡糖苷酸代谢物或其相应的差向异构体。M6和M7的m/z762质语的子离子分别显示在图15和16中。M6和M7在m/z586、569、513、211和86处以及对于M7在154处存在子离子。对于M6和M7，中性失去176Da产生m/z586，m/z586也是替加环素的[M+H+，表明是替加环素的葡糖普酸。对于替加环素，也观察到了m/z569、513、456、211、154(对于M7观察到了m/z154，但是对于M6没有观察到)和86处的子离子。根据M6比M7的HPLC保留时间早，提出代谢物M6;UVI7的差向异构体。这与替加环素差向异构体比替加环素的洗脱早是一致的。因此，提出M6和M7分别是替加环素差向异构体和替加环素的葡糖苷酸。仅通过LC/MS在血清和尿液中观察到了代谢物M8和M9。在m/z515处观察到了M8和M9的M+H广(MW514),其比替加环素小71Da。M8和M9的质镨数据类似。M9的m/z515质镨的子离子显示在图17中。由m/z515失去NH3产生m/z498子离子。对于替加环素，也观察到了m/z456、411和154处的子离子，表明四环素环是完整的。对于M8和M9，缺少放射色it^与TBAAA侧链中放射性标记的氣基失去是一致的。形成M9的最可能的机制是酰胺水解产生叔丁基氨基乙酸(M3a，含有放射性标记)和9-M米诺环素(M3，不含"C标记)。提出9-氨基米诺环素的N-乙酰化产生M9。m/z456子离子和分子量(514)之间的58Da的差异与存在非放射性标记的乙酰氨基是一致的。通过加入了合成的N-乙酰基-9-氨基米诺环素(WAY-188749)的尿液提取物的联合色i普法确认了这些代谢物(数据未显示)。根据M8比M9的HPLC保留时间早，提出代谢物M8是M9的差向异构体。这与替加环素差向异构体比替加环素的洗脱早是一致的。因此，M8和M9分别被鉴定为N-乙酰基-9-氨基米诺环素的差向异构体和N-乙酰基-9-氨基米诺环素。图18-21涉及替加环素葡糖苷酸的另外的分析。图18是对替加环素葡糖苷酸所提出的结构和质镨碎裂流程图，其对应于结构I、II差向异构体、III和IV差向异构体。图19A的UV色镨图以及图19B和19C是所选的质镨图，这些图来自施用了替加环素的受试者的人尿液的LC/MS分析。图20A和20B显示了替加环素葡糖普酸的m/z762质镨的子离子，其中图20A是满刻度图，图20B是放大以显示较低强度的子离子的图。图21A-21D显示了LC/MS/MS色i脊图，这些图来自施用了替加环素的受试者的人泉液m/z762分析的子离子，其中图21A-21C是所选的低强度子离子的质镨图，图21D是总离子色谱图。因此，代谢物及其差向异构体的可能结构包括至少一种选自如本文在前面公开的I、II差向异构体、III和IV差向异构体的化合物。在一个实施方案中，本文公开的化合物可以用作抗耐药菌的治疗，已经表明当其它抗生素失效时它们可以发挥作用。例如，其可以有效地抵抗耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、耐青霉素肺炎链球菌、耐万古霉素肠球菌(D丄Beidenbach等人，Z)z'flgwo幼'cM/md/o/ogv/"/ecft》"sZ)/鄉se40:173-177(2001);H.W.Boucher等人，^4ifri附i'ci^6/fl/在CT^/wo^e/*"/^44:2225-2229(2000);尸.A5f"rf/wrfC7iVi.Af!crMiV^iVews/战.26:163-168(2004);D.Milatovic等人，/4wft附iciv6./4ge"ttC7^挑0说w.47:400-404(2003);R.Patel等人，DfVig"细'cAf/c/^6i油^va/irf/"/g"i'omsZ)/sease38:177-179(2000);P丄Petersen等人，y4/ift挑fciv6.々e/iteC7^附Wto.46:2595-2601(2002);和P丄Petersen等人，4油附&^.々e"teCAe附Wto.43:738-744(1999))和抵抗带有两种主要形式的四环素耐药性一_外流和核糖体保护——中任一种的有机体(C.Betriu等人，爿"ri加ici^6.^gewtoC7^附W/^i".48:323-325(2004);T.Hirata等人，爿/fftw/cro6.C7^附W/r化48:2179-2184(2004);和P.J.Petersen等人，^wriw!'Cfo6.jge"teC/ie附W/^f.43:738-744(1999))。在一个实施方案中，本文>^开的化合物可以用于治疗多种细菌感染，例如复杂性^J^内感染(complicatedintra-abdominalinfections,cIAI)、复杂'性皮肤和皮肤结构感染(complicatedskinandskinstructureinfections,cSSSI)、社区获得性肺炎(CAP)和医院获得性肺炎(HAP)征候，这些细菌感染可由革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体、厌氧菌以及对甲氧苯青霉素敏感的和耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌抹(MSSA和MRSA)所引起。此外，本文公开的化合物还可用于在恒温动物中治疗或控制由具有耐TetM和TetK决定子的细菌所引起的细菌感染。本文公开的化合物还可用于治疗骨和关节感染、与导管有关的中性白细胞减少症、产科和妇科感染，或者用于治疗其它耐药的病原体，例如VRE、ESBL、肠道菌、生长迅速的分枝杆菌属(wy;co6fl"e打'a)等。因此，本文公开的实施方案是治疗至少一种细菌感染的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含治疗有效量的至少一种本文公开的化合物及其可药用盐的药物组合物。在一个实施方案中，本文公开的化合物与替加环素相比例如可以减少恶心。如本文所用的"药物组合物"指医药组合物。该药物组合物可以含有至少一种可药用载体。如本文所用的"可药用赋形剂"指适于施用本文提供的化合物的药物栽体或基质，包括本领域技术人员已知适于具体施用方式的任意这类载体。例如，用于胃肠道外、皮内、皮下或局部应用的溶液或混悬液可以包括无菌稀释剂(例如注射用水、盐水溶液、不挥发油等)；天然存在的植物油(例如a油、椰子油、花生油、棉子油等)；合成的脂肪基质(例如油酸乙酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇等，包括其它合成溶剂)；抗微生物剂(例如苯甲醇、尼泊金甲酯等)；抗氧化剂(例如维生素C、亚硫酸氢钠等)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)等)；緩冲剂(例如乙酸盐、枸橼酸盐、磷酸盐等)；和/或张力调节剂(例如氯化钠、葡萄糖等)；或它们的混合物。进一步举例而言，当静脉内施用时，适宜的栽体包括生理盐水、磷酸盐緩沖盐水(PBS)和含有增稠剂和增溶剂如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇等的溶l良它们的混合物。非限制性地举例而言，本文^S开的化合物可以任选与一种或多种可药用赋形剂组合，并且可以以例如片剂、胶嚢剂、可^t粉末、颗粒剂、含有例如约0.05至5。/。助悬剂的混悬剂、含有例如约10至50。/。蔗糖的糖浆剂和含有例如约20至50。/o乙醇的酏剂等形式口月施用，或者以在等张基质中的无菌注射溶液或含有约0.05至5%助悬剂的混悬液形式经胃肠道外施用。这类药物制剂可以含有例如约25至约卯％的活性成分以及载体、更通常约5%至60%重量的载体。其它制剂在U.S.专利号5，494，卯3和5，529，9卯中进行了讨论，其公开内容引入本文作为参考。术语"可药用盐"可以指本公开内容中的化合物的酸加成盐或碱加成盐。可药用盐是保持母体化合物的活性并且不会对其施用的受治疗者和在上下文中其所施用的受试者产生任何有害的或不需要的作用的任意盐。可药用盐包括金属复合物以及无机和有机酸盐。可药用盐包括金属盐，例如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐和复合盐。可药用盐包括酸式盐，例如乙酸盐、天门冬氨酸盐、MJ^磺酸盐、芳基磺酸盐、axetil、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、M酸钩、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、cilexetil、枸橼酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐(edisylic)、十二烷基磺酸盐(estolic)、esyl、乙磺酸盐(esylic)、甲酸盐、富马酸盐、ghiceptic、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、乙醇酰基氨苯胂酸盐、环己磺酸盐、己基resorcinoic、hydrabamic、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟萘甲酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基琉酸盐、粘酸盐、粘康酸盐、萘璜酸盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、朴酸盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、酞酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、7JC杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、^iJ^磺酸盐、对MM酸盐、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、teodic、甲M酸盐等。可药用盐可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。其它可药用盐例如可以在Stahl等人的"药用盐性质、选#^用途"(iV^r附"ce"ft'cfl/Sflto:iVo/7eW/es,^/"ftVm，fl"rff/se，Wiley-VCH;第l版，2002年6月15日)中找到。在一个实施方案中，"治疗有效量"指预防或改善患者的症状或者产生所需生物学结果如改善临床症状、延緩疾病发作、减少和/或增加、淋巴细胞和/或抗体水平等的化合物的量。有效量可以如本文所述来确定.所选的剂量水平将取决于具体化合物的活性、施用途径、所治疗病症的严重性以及所治疗患者的病症和既往病史。但是，以低于获得所需疗效所需要的水平开始施用化合物并逐渐增加剂量直至获得所需疗效在本领域技术范围之内。在一个实施方案中，由测定法得到的数据可以用于制定用于人的剂量范围。对照实施例l研究了["C替加环素在于37X:孵育至24小时的对照血清中的稳定性。在所加入的对照血清的提取物中与"C替加环素有关的放射性百分数经过24小时降低了约9%,即从0小时的卯％降低至24小时的81%(图22)。0时刻的差向异构体百分fci7。/。并且保持恒定至24小时，如对四环素类所报道的那样(RemmersEG，SiegerGM，DoerschukAP.对四环素C.4差向异构化的动力学的一些观测.//^"r附5W.1963;52;752-756;NelisH，DeLeenheerA.米诺环素在人体中的代谢.Afeto61982;10:142-146)，替加环素的差向异构体是差向异构化的产物，并且认为它不是代谢物。其它产物的量增加了约8%，即从0小时的3%增加至24小时的11%。其它产物包括早期洗脱色镨峰(M3a，叔丁基氨基乙酸)，其保留时间为约4分钟。以前在大鼠和狗的血浆和尿液中观察到了该峰.对于0至24小时的受试样品，放射性从所加入的对照中的回收率是完全的。对照实施例2当于37t;孵育时，"C1替加环素在尿液中没有在血清中稳定(图6)。14C1替加环素在所加入的对照尿液中的百分数降低了18%,即从0小时的92%降低至24小时的74%。差向异构体增加了16%,即放射性从0小时的7%增加至24小时的23%。其它次要产物经过24小时从0时刻的1%增加至3%.在用于研究样品的提取方法过程中，研究了"C替加环素在对照血清和粪便匀浆物中的稳定性。在加入和提取样品之前，"Cj替加环素在血清样品中占94%的放射性。提取操作后，["C替加环素的量由24。/o的放射性降低至70%。在其它放射性组分、主要是替加环素的差向异构体中有相应的增加，替加环素的差向异构体从提取前的4%增加至提取后的22%。包括M3a在内的其它次要产物从提取前的2%增加至提取后的8%。对照实施例3将["C替加环素从对照粪便匀浆物中提取后观察到了类似的结果。在这些样品中，["Cl替加环素在提取前占94。/o的放射性，在提取后占68%的放射性。在替加环素的差向异构体中有相应的增加，其在提取前占4%的放射性，在提取后占23%的放射性。在提取过程中，M3a的量也增加了40/。，即从1%增加至5%。其它次要产物在提取前占小于1%的放射性，在提取后占4%的放射性。实施例实施例l在6名健康男性志愿者中进行了开放标记、入院病人、多剂量替加环素、单剂量"C替加环素代谢处置和质量平衡的研究。临床方案需要12名受试者。在这12名受试者中，6名受试者接受放射性剂量(受试者1、4、5、6、7和8,后来受试者8退出了4^研究)。根据纳A/排除标准、医疗史、体格检查和研究方案中所述的另外的操作来选择合格的受试者。每名受试者在第1天的早晨接受100mg负荷剂量，然后每12小时接受另外5个剂量的50mg维持剂量。在研究的第4天早晨，6名受试者接受单次50mg剂量的["C替加环素(50nCi)。通it30分钟静脉内输注来施用每个替加环素剂量。6名健康男性志愿者接受["C标记的替加环素，平均剂量为45.9±0.9[1(:1(范围为44.3至47.0^Ci)。在给药时l"Cl替加环素的放射化学纯度被报告为98.6。/。，其中0.4%的放射性被鉴定为替加环素差向异构体，比活性为1.00nCi/mg,在替加环素给药前以及在"CI标记的剂量给药后1、4、8、24和48小时收集血清样品以进行代谢物分析。对于代谢物分析，在0-4、4-8、8-24和24-48小时收集尿液样品，在"CI标记的剂量给药后至48小时收集粪^更样品。将血清和尿液样品以及粪便匀浆物在干冰上运送到"药物安全和代谢生物转化部门"(WyethResearch,Collegeville，PA)。样品收集和样品^4的详情在本研究的质量平衡(massbalance)部分中有描述。6号受试者的24-48小时的尿液和粪便样品是不完全的，因为该受试者退出了本研究。虽然来自该受试者的样品用于代谢物分析，但是其样品不被包括在质量平衡计算中。M究的临床部分中所用的未标记和["q标记的替加环素以及剂量的制备和这些批次的分析的详情在本研究的质量平衡部分中有描述。施用于受试者的l"C替加环素(制剂号0931854J,批号7981703)的比活性为1.00i!Ci/mg(5(^Ci/50mg剂量)。用于评价"Cj替加环素在血清、尿液和粪4更匀浆物中的稳定性的另一批["CI替加环素(批次CFQ13389，95.3pCi/mg，97.2%放射化学纯度)从AmershamPharmaciaBiotech(Buckinghamshire,英国)获得。替加环素参比标准品(批次RS738-4，纯度为98.4%)、9-^米诺环素参比标准品(CL-318614，批号14800B-89A)和N-乙酰基-9-氨基米诺环素(WAY-188749,批号L23566-162)从WyethResearch(PeaiiRiver，NY)获得。"C替加环素的结构如下所示，放射性标记的位置标为(*)。丙酮、乙腈、水醋酸和甲醇由EMD化学公司(Gibbstown，NJ)获得。乙二胺四乙酸(EDTA)和三氟乙酸由Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得。乙酸铵由MallinckrodtBaker(Phillipsburg,NJ)获得。所有试剂均是分析絲更高级别。静脉内单次100mg剂量施用替加环素、然后施用5个50mg剂量替加环素和单次50mg剂量的"C替加环素通常是安全和耐受良好的。所报道的最常见(>10%)的不^^应是恶心(75%)、呕吐(50%)、消化不良(17%)和注射部位炎症(17%)。替加环素C29H39N5O8未标记化合物的阜同位素MW-585.3实施例2使用Tri-Carb型3100TR液体闪烁计数器(PerkinElmer，Wellesley，MA)、使用UltimaGold，闪烁液(PerkinEImer)和UltimaGold标准曲线进行放射性测定以计算提取效率。通过使用放射性已知的外标将每分钟计数(CPM)转化为每分钟衰变数(DPM)。通iti^射性外标的转化能镨指数(tSIE)测定各标准品的淬灭。使用T叩CountNXT放射性微板读数器(PerkinElmer)来分析被收集到96孔深孔Luma板(PerkinElmer)中的HPLC级分。实施例3对在["C1标记的替加环素给药后1、4和8小时收集的单独的血清样品进行分析以用于代谢物概况。对24和48小时的样品没有进行分析，因为放射性的浓度太低(范围为0至18ng等同物/mL)。为了将样品体积减少到最小，M份血清样品分成等体积的两份样品(每份约9M1)，单独对其进行提取和分析.将EDTA(80^L0.5MEDTA/mL样品)加入到每份样品中，将样品涡旋混合。将3体积丙酮加入到每份样品中，然后使用多管涡旋混合器将样品混合1分钟。在2500rpm和4。C下、在SorvallSuperT21离心机(Sorval1Inc.，Newtown，MA)中将样品离心15分钟。将上层液转移到含有20^iL水醋酸的新管中。用2mL水、160inL0.2MEDTA和6mL丙酮将沉淀物重新提取2次，如前所述进行^t作。合并来自#样品的上层液，使用TurbovapLV型蒸发仪(Zymark，Hopkinton，MA)在氮气流下将其蒸发至千。将残余物在300pL乙腈/水(l:9)中重构，在14，000rpm和室温下使用5415C型E卯endorf离心机(BrinkmannInstruments,Westbury，NY)离心10分钟，通过HPLC对放射性进行分析。所选的样品还通过LC/MS进行了分析。在加有["C替加环素(以3ng/mL加入)并于37匸孵育的对照人血清中测定了["C1替加环素的稳定性。使用该浓度是因为其接近对本研究报道的C咖x值。在0、1、4、8和24小时取出等分试样(500nL)，置于新小瓶中。加入EDTA(40pL0.5M),在14，000rpm和室温下将样品离心IO分钟(Eppendorf离心机，5415C型)。将上层液转移到HPLC小瓶中，通过HPLC用放射性流动检测进行分析。如上所述制备另外的血清样品并提取。这样做是为了测定提取操作对["C替加环素稳定性的影响(如果有的话)。通过HPLC用放射性流动检测分析了这些样品，如实施例6中所述。实施例4使用以前研究的并用于大鼠和狗的尿液样品的方法如下所述提取用于代谢物分析的尿液样品。在提取前，将在"CI替加环素给药后不同间隔至48小时收集的尿液样品在冰上解冻。将单独的尿液样品的等分试样(lmL)转移到干净的管中，加入0,2MEDTA，EDTA的终浓度为40mM。pH保持恒定在4.5-5.5,将样品混合，离心，通过HPLC放射色谱法分析上层液的代谢物，所选的样品还通过LC/MS进行了分析。来自8号受试者的另外的尿液用于分离代谢物M3a。使用如上所述的相同方法处理该尿液样品。使用HPLC法并在样品注射后2至5.5分钟收集HPLC流出物来分离M3a峰。在氮气流下使用TurbovapLV型将混合的级分浓缩。然后将样品离心，通过LC/MS分析.在加有"Cl替加环素(以5ng/mL加入)并于37t:孵育的对照A^液中测定了"C1替加环素的稳定性。使用该浓度是因为其处于本研究的"C替加环素在尿液中的浓度范围之内。在0、1、4、8和24小时取出等分试样(500jxL)，置于新的小瓶中。如在对照实施例2中对血清所述对这些尿液样品进行处理和分析。实施例5由在["C标记的替加环素给药后至48小时收集的各粪便样品制M有大于8000dpm/g的单独的粪便样品匀浆物，然后对其进行分析以用于代谢物概况，粪便样品匀浆物的制备在本研究的质量平衡部分中有详细描述。简言之，在ABC实验室(Columbia，MO)将粪便样品按重量用3至4体积的水水进行匀浆化，冷冻运送到"药物安全和代谢生物转化部门"(WyethResearch,Collegeville，PA)。对于放射性的提取，将粪便匀浆物在水上解冻，将等分试样(约lg)转移到15mL管中。加入3体积丙酮，使用多管涡旋混合器将样品混合l分钟。在2500rpm和^C下、在SorvallS叩erT71离心机中将样品离心15分钟。将上层液转移到新管中，将沉淀物用lmL水和80nJL0.5MEDTA重新混悬，如前所述重新提取。按这种方式将沉淀物总共重新提取3次，将上层液混合。使用TurbovapLV型在氮气流下将上层液蒸发至干。将残余物重新混悬于500nL水中，在14，000rpm和室温下使用5415C型Eppendorf离心机离心10分钟。将上层液转移到HPLC小瓶中，使用HPLC用放射性检测对放射性和代谢物概况进行分析。所选的样品还通过LC/MS进行了分析。在加有"Cl替加环素(以5將/g匀浆物加入)的对照人粪便匀浆物中测定了["CI替加环素在提取过程中的稳定性。使用该浓度是因为其处于来自本研究的"C1替加环素在粪便匀浆物中的浓度范围之内。将样品提取，通过HPLC用放射性流动检测对样品进行分析。实施例6如下进行HPLC分析4吏用Waters2695AllianceSeparationModule(WatersCorp.，Milford，MA)，Waters2487型双波长UV吸收检测器，设置在监测器350nm,与以20秒间隔收集级分而配备的Gilson215液体处理机(Gilson，Middleton，WI)联机。将级分收集到96孔深孔Luma板中，使用TopCountNXT进行分析。将自动采样器的温度设置在4X:。在装配有PhenomenexSecurityGuar(P^护柱(5jLim)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.0mm，5jim;Phenomenex,Torrance,CA)上4吏用两种流动相A和B的线性梯度来分离替加环素和药物衍生的产物.柱处于约20t:的环境温度下。流动相A是10mM乙酸铵水溶液，流动相B是乙腈。流动相的流速为0,2mL/分，如下所示进行输送。表6:HPLC梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>实施例7-9液相色谱法/质谱法分析用于质谱法分析的HPLC系统是WatersAlliance2695型HPLC系统。其装配有内装式自动采样器和996型二极管阵列UV检测器。在本研究中，在LC/MS分析中使用了3种HPLC糾。LC/MS糾1用于代谢物鉴定的大多数样品分析和用于从尿液中分离代谢物M3a。LC/MS条件2用于所选的物M8和M9的鉴定。LC/MS条件3用于分析^A尿液中分离的极性代谢物M3a。实施例7LC/MS条件1将UV检测器设置在监测器340-360nm。在带有UniguardC18保护柱(10x2mm)(ThermoHypersil-Keystone，Bellefonte，PA)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.0mm，5nm)上完成分离以用于代谢物鉴定，$組为0.2mL/分。在LC/MS样品分析过程中，在评价代谢物之前将直至2分钟的起始流出物^f^^中移开。流动相A是10mM乙酸铵水溶液，流动相B是乙腈。线性流动相梯度如下所示。表7:LC/MSHPLC梯度1时间(分钟)流动相A(%)S流动相B(%)10303022类似的HPLC条件用于收集含有代谢物M3a的级分。流动相和线性梯度相同。所用的柱是SupelcoDiscoveryC18柱(25cmxl0mm，5pm;Supelco，BeHefonte，PA),流速为4.7mL/分。使用FC204型GHson级分收集器(Gilson)收集级分。实施例8LC/MS糾2将UV检测器设置在监测器210-400nm。在带有UniguardC18保护柱(10x2mm)(ThermoHypersH-Keystone)的PhenomenexLunaC18(2)柱(250x2.0mm，5ixm)上完成分离，$組为0.2亂/分，在LC/MS样品分析过程中，在评价代谢物之前将直至0.5分钟的起始流出物^#^中移开。流动相A是0.02。/o三氟乙酸水溶液(v/v)，流动相B是0.02。/。三氟乙酸的乙腈溶液(v/v)。线性流动相梯度如下所示。表8:LC/MSHPLC梯度2时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)7615857798297982实施例9LC羅条件3在WatersAtlantisHILICSilica柱(150x2.1mm，5pm)上完成分离。流速为0.211117分。流动相A是0.02Q/。三氟乙酸的乙腈溶液(v/v)，流动相B是0.02。/。三氟乙酸水溶液(v/v)。线性流动相梯度如下所示。表9:LC應HPLC梯度3时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)01000101000206634253466403466411000651000实施例IO质i瞽法以正离子化模式操作MicromassQuattroUltima三联四极质镨仪(Waters公司)。使用Z^喷雾界面、用电喷射离子化(ESI)进行LC/MS分析。通过直接输注到纳喷雾界面对来自所选样品的单独级分进行ESI-MS分析。质镨仪的设置列在下表中。表10:Microinass质i普仪设置ESI喷雾2.75KV锥孔电压44V扫描质量分析器的质量分辨率一半高度处宽度为0.7Da±0.2Da用于MS/MS的非扫描质量分析器的质量分辨率去溶剂化气流锥孔气流整体源温(Sourceblocktemp.)去溶剂化气体温度碰撞气压碰撞补偿(coHisionoffset)一半高度处宽度为l-2Da850-950L/hr35-45L/hr80"C250匸0.9画l.lxl(T3mbar-30eV通过对具有替加环素特征的子离子的前体进行LC/MS/MS分析，从而分析了尿液和粪便样品中的替加环素代谢物。此外，根据来自以前在动物和人中研究的结果，在LC/MS数据中寻找了可能的替加环素代谢物。通过LC/MS/MS、以可减少内源性组分干扰的所选反应监测(SRM)模式(LC/SRM)分析了血清提取物中的替加环素和所选的代谢物。将停留时间设置在200ms进行这些实验。监测了以下与替加环素有关的组分。表ll:替加环素代谢物的LC/SRM分析前体离子子离子化合物(m/z，标称质量)(m/z，标称质量)替加环素及其差向异构体586513羟^^替加环素(M1、M2、M4)和替加环素N-氧化物60258沐472替加环素葡糖苦酸(M6和M7)762569N-乙酰基-9-^jL米诺环素(M8515498和M9，不带有放射性标记)9-M米诺环素(M3，不带有473456放射性标记)对于稳定性分析和代谢物概况，采用Flo-One分析软件(3.65版)积分放射峰。使用MicrosoftExcel2000电子表格计算均值和标准偏差。用于LC/MS数据分析的软件是MicromassMassLynx(4.0版，Waters公司)。实施例ll材料乙酸铵购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和FisherScientific(Fairlawn，NJ)。HPLC级的水和溶剂购自EMDChemicals(Gibbstown，NJ)。方法尿液样品的制备使用VirTisSentry35XLFreezemobHe(VirTis公司，Gardiner,NY)将来自接受替加环素的受试者的尿液样品(300mL)冷冻干燥至干.将残余物重新混悬于水中，将容器用水洗涤。终体积为3,5mL。在14，000rpm和室温下寸吏用5415C型Eppendorf离心机(BrinkmannInstruments,Westbury,NY)将样品离心10分钟。然后使用0.2或0.45/1111孔径的(:0818『SpinXHPLC尼龙微型离心机滤器(CorningIncorporated,Corning,NY)将样品过滤。用IECCentraGP8R型离心机(ThermoElectron公司)在2400rpm^:作下进行过滤离心。将所得粗尿液提取物通过如下所述的具有级分收集的HPLC进行处理。通过半制备型HPLC分离替加环素葡糖苷酸将含有替加环素葡糖苷酸的尿液提取物转移到4mL自动采样器小瓶中。分离代谢物的HPLC设备包括WatersPrep4000HPLC系统、Waters2767样品管理程序(SampleManager)、WatersColumnFluidicsOrganizer和Waters996二极管阵列UV检测器(Waters公司，Milford，MA)。用DiscoveryC18柱(200xl0mm，5pm)(Supelco，Bellefonte，PA)完成分离.将UV检测器设置在监测器210和450nm。流动相A是10mM乙酸铵水溶液，流动相B是乙腈。将线性流动相如表12中所述进行输送。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>通过带有FractionLynx模块的MicromassMassLynx软件(4.0版，Waters公司)来控制用于级分收集的HPLC设备。使用FractionLynx,根据在350nm处监测UV吸收来收集代谢物级分。级分收集后，通过如下所述的MS来分析所选级分的等分试样，以确定替加环素葡糖苷酸的存在。然后如上所述将含有替加环素葡糖苷酸的级分冷冻干燥至干，重新溶解，通过LC/MS分析以确定替加环素葡糖苷酸已经被分离。液相色谱法/质谱法用于替加环素代谢物分析的HPLC系统包括包含双泵和二极管阵列UV检测器的Agilent1100型HPLC系统。HPLC分离条件如以上对代谢物分离的级分收集所述，除了流速是0.2mL/分和HPLC柱的内径是2.1mm。在冷冻干燥之前，不用HPLC柱而是通过将级分的等分试样直接输注到质谱仪中进行代谢物级分的分析。用于代谢物鉴定的质谱仪是FinniganLCQ离子阱质谱仪(ThermoEiectron公司，SanJose，CA)。其装配有电喷雾电离(ESI)界面并且在正离子化模式下进行操作。用Xcalibur软件(l，3版，ThermoElectron公司)分析LC/MS数据。替加环素葡糖苷酸的质谱通itA尿液的HPLC分级收集替加环素葡糖苷酸。在m/z762处观察到了替加环素葡糖苷酸的M+H+,其比替加环素大176Da。替加环素葡糖苷酸的m/z762质镨的子离子显示在图23A和23B中。中性失去176Da产生了m/z586,m/z586也是替加环素的[M+H+，表明它是替加环素的葡糖普酸。冷冻千燥和重构后替加环素葡糖苷酸级分的LC/MS分析提供了MS和MSn语，它们显示在图24A-24D中。这些质镨数据也表明是替加环素葡糖苷酸。本实施例表明可以从IV施用替加环素剂量的人受试者的尿液中分离出替加环素葡糖苷酸。实施例12本实施例研究了单次静脉内施用替加环素后在小鼠和兔中存在的替加环素的两种代谢途径(母体化合物的葡糖苷酸化和9-氨基米诺环素的N-乙酰化)的可能性。收集并通过LC/MS分析来自各物种的血清样品以确定存在或不存在这些代谢物，可能的话可估计它们的浓度。还收集了来自小鼠的尿液样品以研究替加环素代谢物的存在。材料用于制备对小鼠和兔进行静脉内给药的溶液的替加环素(批号A96559，纯度100%)、替加环素参比标准品(批次RS738-4，纯度98.4%)、氖化的(叔丁基-d9)替加环素(WFQ0159;用作内标)、9-氨基米诺环素参比标准品和N-乙酰基-9-H^米诺环素由WyethResearch(PearlRiver，NY)获得。对照兔和小鼠血清由BioreclamationInc.(Hicksville，NY)获得。乙腈和甲醇由EMDChemicalInc.(Gibbstown，NJ)获得。乙二胺四乙酸(EDTA)由Sigma化学公司(St.Louis，MO)获得。乙酸铵由MallinckrodtBaker(PhilHpsburg，NJ)获得。所有试剂均是分析级或更高级别。小鼠和兔研究设计动物使用15只雄性CD-1小鼠，给药时其平均体重为31,3g。动物自由取食和饮水。将0.5和2小时血液收集组的小鼠在标准笼中喂养，而将4小时血液收集组的小鼠在代谢笼中喂养以收集尿液。由WyethResearch的生物资源部门(CollegevilIe，PA)对小鼠进行给药。使用3只雌性新西兰白兔，给药时其体重在3.9和4.3kg之间。动物自由取食和饮水。将动物在标准笼中单独喂养。在WyettiResearch(Chazy，NY)对兔进行给药，将样品冷冻运送到WyethResearch生物转化部门(CoHegeville，PA)。给药对于小鼠和兔,通过将50mg替加环素溶解于5.0mL0.9%无菌盐水溶液中来制备工作储备液而制备静脉内给药溶液。用0.9%无菌盐水溶液将工作储备液稀释至0.5mg/mL(对于小鼠)和4mg/mL(对于兔)'通i^C静脉将小鼠剂量(5mg/kg，10mL/kg)作为单次快速静脉注射液来施用。通过耳缘静脉将兔剂量(4mg/kg，lmL/kg)作为单次快速静脉注射液来施用。样品收集对于小鼠(11=5/时间点)，在施用替加环素后0.5、2和4小时通过心脏穿刺收集血液(约0.7mL)。对于兔，在替加环素给药后0.5、2和6小时通过耳静脉收集血液(约7mL)。于室温形成血块和在4X:和3000rpm下离心15分钟后分离血清。将血清转移到新管中，于约-70匸保存直至进行如下文"用于LC/MS分析的血清样品制备"中所述的分析。此外，从4小时血液收集組的小鼠中收集尿液，于约-70^;*直至进行如下文"用于LC/MS分析的尿液样品制备"中所述的分析。N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的纯度的估计通过HPLC、用UV检测来估计^研究中所用的N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的纯度，如下文"液相色谦法/质镨法分析"中所述。根据M9的色谙峰面积、作为在100ng/^L样品中占与M9有关的组分的总UV色谱峰面积的百分比来确定M9的纯度。假定M9和其它有关组分具有相同的UV摩尔吸光度并且不存在其它与M9有关的物质。以低于37.6分钟的峰的相对量(总面积的2.8%)而存在的单独组分,皮认为是痕量组分并且不包括在本纯度的估计中。在合成的物质中，通过LC/MS仅鉴定了M9及其差向异构体；没有鉴定其它降解物。根据由本方法得到的M9纯度的估计值来调整M9在各标准曲线样品中的实际浓度。用于LC/MS分析的尿液样品的制备将小鼠尿液解冻，将等分试样(lmL)转移到新管中。使用5415C型Eppendorf离心机(BrinkmannInstruments,Westbury，NY)在14，000rpm和室温下将样品离心10分钟以除去任意颗粒。然后将样品转移到新管中，如下文"液相色谱法/质镨法分析"中所述通过LC/MS进行分析。用于LC/MS分析的血清样品的制备将各收集时间的小鼠和兔血清样品混合，对替加环素、其差向异构体、替加环素葡糖苷酸(M7及其差向异构体M6)、9-ILi米诺环素(M3)和N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9及其差向异构体M8)进行分析。将血清的等分试样(500/tl)转移到新管中，加入氘化的替加环素(终浓度为30ng/mL)作为内标(仅定量分析)。将EDTA(40nL0,5MEDTA)加入到各样品中，将样品涡旋混合。将乙腈(500^iL)加入到各样品中，将样品涡旋混合，通过使用5415C型Eppendorf离心机(BrinkmannInstruments)在14，000rpm和室温下离心IO分钟来分离变性蛋白。将上层液转移到新管中，4吏用TurbovapLV型蒸发仪(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)在氮气流下蒸发溶剂，如下文"液相色谦法/质谱法分析"中所述通过LC/MS分析剩余的水溶液，用对照兔血清将一些兔血清样品稀释5或50倍以保证分析物的响应在标准曲线的范围之内。用兔血清制备替加环素、M3和M9的标准曲线。通过将内标以及合成的替加环素和代谢物标准品加入到对照血浆中来制备标准曲线。在所制备的标准曲线样品中，替加环素的浓度为O、10、20、50、100、200、500和1000ng/mL，线性范围为5至200ng/mL。对于9-氨基米诺环素(M3)，其浓度为O、1、5、10、20、50、100和200ng/mL,线性范围为10至200ng/mL。对于N-乙酰基-9-絲米诺环素(M9)，其浓度为1.6、3.2、6.4、16、32、64和96ng/mL，线性范围为3.2至96ng/mL。如上所述对这些样品进行处理和分析。将含有M7(替加环素葡糖苷酸)的人尿液样品的等分试样加入到混合的2小时兔血清中以确定在兔中观察到的葡糖苷酸是否与在人中观察到的葡糖苷酸相同。如下文"^f目色镨法/质镨法分析"中所述通过LC/MS分析该样品。液相色谱法/质谱法分析用于质谱法分析的HPLC系统是WatersAlliance2695型HPLC系统(Waters公司，MHford，MA)。其装配有内装式自动采样器和996型二极管阵列UV检测器。将UV检测器设置在监测器210"400nm,在装配有KeystoneUniguardC18保护柱(10x2.1mm)(ThermoElectron公司，Bellefonte，PA)的PhenomenexLunaC18(2)柱(150x2.1mm，5pm)(Phenomenex，Torrance,CA)上完成分离以用于代谢物鉴定。柱温为25X:,流速为0.211117分。流动相A是10mM乙酸铵水溶液，流动相B是乙腈，使用两种线性流动相梯度，其显示在^2.2.5-1和2.2，5-2中。梯度l用于代谢物的鉴定(定性分析)。梯度2用于兔血清样品的半定量分析。在LC/MS样品分析过程中，在评价代谢物之前将直至10分钟的起始流出物M镨仪中移开。梯度1和梯度2的LC/MSHPLC数据显示在表13和14中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>所用的质镯长是MicromassQuattroUltima三联四WH糾(Waters公司)。其装配有电雾化界面并且在正离子化模式下进行操作。质#^的设置列在表15中。表15:Micromass质镨仪设置ESI喷雾~~2.5kV锥孔电压50V扫描质量分析器的质量分辨率一半高度处宽度为0.7Da±0.2DaMS/MS实验的非扫描质量分析主古糸补脊牵4，，n器的质量分辨率—半肉度处宽度为l-2Da去溶剂化气流950-1100L/hr锥孔气流40-60L/hr整体源温去溶剂化气体温度碰撞气压碰撞补偿250x:1.0-1.2x103mbar國30eV还对血清提取物进行了在所选反应监测(SRM)模式(LC/SRM)下的LC/MS/MS分析，以筛选样品中的替加环素代谢物并获得替加环素代谢物的估计浓度。将停留时间设置在200咖进行这些实验。SRM分析条件总结在表16中。对于定性分析，没有使用或监测内标。表16:替加环素及其代谢物的SRM分析条件<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>数据分析和计算MicromassMassLynx(4.0版，Waters公司)用于分析LC/MS数据。根据与兔血清产生的标准曲线相比、样品中分析物与内标的峰面积比来计算血清中替加环素、9-^米诺环素(1\13)和]\-乙SL^-9-M米诺环素(M9)的浓度。N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)合成标准品的纯度来自合成的N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的HPLC分析的UV色谱图显示在图25中。M9及其降解物的UV色谱峰面积显示在表17中。表17:N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的纯度的估计<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>M9差向异构体是含量最多的与化合物有关的组分，其占合成的N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的约5iy。。N-乙,-9-#^米诺环素的估计纯度为32%。小鼠的血清和尿液以及兔血清中的代谢物在小鼠血清中，通过LC/MS分析观察到了替加环素、替加环素的差向异构体、9-氨基米诺环素(M3)和替加环素葡糖苷酸(M7及其差向异构体M6)。没有研究这些组分在小鼠血清中的浓度。在小鼠血清中没有观察到N-乙S^-9-t^米诺环素，在小鼠尿液中观察到了相同的与替加环素有关的组分。在兔血清中，通过LC/MS分析观察到了替加环素、替加环素的差向异构体、9-氨基米诺环素(M3)、替加环素葡糖苷酸(M7及其差向异构体M6)和N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)。在兔中替加环素葡糖苷酸的鉴定与在人中所观察到的相同，使用已知含有M7的人尿液所进行的联合色谙法实验(数据没有显示)证明了这一点。替加环素在兔血清中的估计浓度从l小时的2020ng/mL降低至2小时的1040ng/mL和6小时的287ng/mL(表18)。M3的浓度也随时间而降低，在0.5、2和6小时其浓度分别是545、312和卯.2ng/mL。但是，M9的浓度随时间而增加，从0.5小时的5.5ng/mL分别增加至2小时和6小时的8.1和20ng/mL。表18:静脉内施用替加环素后雌性新西兰白兔的血浆样品中替加环素、9-氨基米诺环素(]^3)和]\-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)的估计浓度wi…浓度(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>通过液相色谱法/质谱法进行的代谢物鉴定对来自CD-1小鼠和兔的血清提取物以及对来自CD-1小鼠的尿液进行了LC/MS分析。在这些样品中观察到的与替加环素有关的化合物的汇总显示在表19中。替加环素及其代谢物的质谱数据在下文进行讨论。表19:CD-1小鼠血清和尿液以及兔血清样品中鉴定的替加环素代谢物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>a.从LC/MS数据文件UL一063005J)006和ULJ)70105—0005中得到的保留时间b.TBAAA喊丁基絲乙耽城c.M，小鼠；R兔；S，血清；U，尿液替加环素在小鼠的血清和尿液以及兔血清中观察到了替加环素。研究了替加环素可信标准品的质语特征以与代谢物进行比较。在替加环素的LC/MS镨中，在m/z586处观察到了质子化的分子离子M+H+。由替加环素的m/z586的碰撞活化解离得到的MS/MS镨显示在图26A中，所提出的碎裂流:程图显示在图26B中。所提出的碎裂流程图与由Kamel和同事对有关的四环素类抗生素所提出的流程图(A.M.Kamel等人，通过电喷射离子化、H/D交换和多阶段质镨法进行的四环素的质镨鉴定./爿附&"加附，13:543-557，2002)—致。由m/z586失去NH3产生了m/z569。m/z513处的子离子表示从叔丁基氨基乙酰氨基(TBAAA)侧链中失去叔丁基氨基。失去整个TBAAA侧链产生m/z456。m/z211和154处的子离子来源于四环素环系的D环，如在图26B的碎裂流程图中所表明的。m/z86离子表示叔丁基M亚甲基。替加环素差向异构体在小鼠的血清和尿液以及兔血清中观察到了替加环素的差向异构体，其在m/z586处产生M+Hl+。图27A和27B中所示的m/z586质谱的子离子包括m/z569、513、456和86，对于替加环素它们也存在。根据其相对保留时间短于替加环素的相对保留时间而将其鉴定为差向异构体。代谢物M3在小鼠的血清和尿液以及兔血清中观察到了代谢物M3。在m/z473处观察到了代谢物M3的M+H+。M3的m/z473质谱的子离子显示在图28A和28B中。m/z473质镨的子离子包括由分别失去甲基和NH3而产生的m/z458和456。对于替加环素，还观察到了m/zl54处的子离子，it^明D环没有变化。由m/z458失去H20和NH3产生m/z423.随后失去两个CO分子产生m/z367。失去CO和CH3-N-CH2两者产生m/z352。该碎裂行为和与米诺环素有关的化合物(A.M.Kamd等人，通过电喷射离子化、H/D交换和多阶Mi普法进行的四环素质镨鉴定./5WrMassSpe"nwi，13:543-557，2002)以及和将M3鉴定为9-氨基环素是一致的。通过将M3的HPLC保留时间和MS/MS镨数据与合成的9-氨基米诺环素(数据未显示)相匹配而得以证实。代谢物M6和M7在小鼠的血清和尿液以及兔血清中观察到了代谢物M6和M7。在m/z762处观察到了M6和M7的[M+H+，其比替加环素大176Da。M6和M7的质"i普数据类似。M7的m/z762质镨的子离子显示在图29A和29B中。中性失去176Da产生m/z586，m/z586也是替加环素的M+H广，表明它是替加环素的葡糖苷酸。对于替加环素，还，见察到了m/z569、513、456和154处的子离子，但是没有表明结合部位。通过环C的碎裂而形成了551处的子离子，如碎裂流程图中所表明的，il^明环A或C上的羟基是葡糖苷酸化的部位。洛索蒽醌(一种具有类似于替加环素的环A的酚环的三环化合物)被代谢为酚葡糖苷酸(RennerUD，PiperopoulosG，GebhardtR，EhningerG，ZellerKP.洛索蒽醌的氧化生物转化(CI-941).DrugMetabDispos30:464~478，2002)。it^明环A的羟基是替加环素葡糖苷酸化的最可能的部位。根据M6比M7的HPLC保留时间早，提出代谢物M6^M7的差向异构体。这与替加环素差向异构体比替加环素的洗脱早是一致的(见上文"替加环素差向异构体"部分)。兔血清提取物和A^液提取物的联合色镨表明这两种样品含有相同的替加环素葡糖苷酸(M7)(数据未显示)，因此，提出M6和M7分别是替加环素差向异构体和替加环素的葡糖苷酸。代谢物M9通过LC/SRM分析在兔血清中观察到了代谢物M9。在小鼠的血清或尿液中没有观察到该代谢物。图30显示了兔血清中替加环素及其代谢物的单独的LC/SRM色镨图，在m/z515-^498迹线中显示了M9。兔血清的联合LC/SRM色i脊图显示在图31中，将["C1替加环素静脉内施用于健康男性志愿者后，替加环素是血清中主要的放射性标记的组分。但是，在大鼠或狗中没有观察到替加环素在人体内代谢的两种途径9-#^米诺环素的1\-乙酰化和母体化合物的葡糖苷酸化。本实施例中给出的研究考察了这些替加环素代谢途径是否存在于小鼠和/或兔中。根据以前的代谢数据和来自本研究的数据，所提出的替加环素在小鼠、大鼠、兔、狗和人中的代谢途径显示在图32中。在兔和小鼠中均观察到了替加环素的葡糖苷酸化。存在的葡糖苷酸代谢物的量不能被测定，因为不能得到合成的标准品。在使用施用替加环素后收集的人尿液所进行的联合色镨法实验中，表明人尿液和兔血清中的葡糖苷酸具有相同的保留时间。虽然没有使用小鼠血清进行联合色镨法，但是小鼠血清中的葡糖苷酸的保留时间与兔和人中所观察到的相似，并且推测是M7。在兔血清中观察到了N-乙酰基-9-iJ^米诺环素(M9)，但是在小鼠血清中没有观察到。M9在兔血清中的估计浓度从5.5ng/mL增加至20ng/mL(给药后0,5至6小时)。这些浓度与以前报道的多次施用替加环素后M9在人血清中的浓度(3-15ng/mL)类似。此外，在兔血清中还观察到了9-氨基米诺环素(M3)的浓度可高ii545ng/mL。虽然已经在来自小鼠、大鼠、狗和人的血清中观察到了该代谢物，但是在这些物种中该代谢物仅是痕量代谢物。明在兔中M3是主要的代谢物，相对于替加环素而言其浓度可一直^30%。总之，给小鼠和兔单次静脉内施用替加环素，然后在给药后不同时间收集尿液(仅小鼠)和血液以制备血清。给雄性CD-1小鼠施用5mg/kg替加环素，在给药后0.5、2和4小时收集血液，而在给药后04小时收集尿液。雌性新西兰白兔接受4mg/kg替加环素，在给药后0.5、2和6小时收集血液。在通过LC/MS、以所选反应监测模式进行分析之前，按时间点和物种将血清样品混合。研究了替加环素(及其差向异构体)、9-氨基米诺环素(M3)、替加环素葡糖苷酸(M7及其差向异构体M6)和N-乙跣基-9-氨基米诺环素(M9及其差向异构体M8)的存在。使用未确认的LC/MS方法、合成的标准品和内标估计了M3、M9和替加环素在兔血清中的浓度。在兔血清中检测到了替加环素、替加环素的差向异构体、M3、M6、M7和M9。替加环素在0.5、2和6小时的血清样品中的估计浓度分别为2020、1040和287ng/mL。M3的浓度也随时间而降低，从0.5小时的545ng/mL降低至6小时的卯.2ng/mL。M9的估计浓度随时间而增加，从0.5小时的5.5ng/mL增加至2小时的8.1ng/mL和6小时的20ng/mL。M6和M7的浓度不能,皮测定，因为缺少合成标准品。在小鼠的血清和尿液中检测到了替加环素、替加环素的差向异构体、M3、M6和M7。这些化合物在小鼠血清和尿液中的浓度没有被测定。在小鼠血清或尿液中没有观察到M9。总之，给兔和小鼠单次静脉内施用替加环素后，在来自这两个物种的血清中均观察到了替加环素、其差向异构体、9-氨基米诺环素(M3)和替加环素葡糖苷酸(M7及其差向异构体M6)。此外，在兔血清中观察到了N-乙酰基-9-氨基米诺环素(M9)。在人中还观察到了替加环素被葡糖苷酸化为M7和M3被W-乙酰化为M9，但是在大鼠或狗中没有观察到。这些化合物可以通过上文所述的方法来分离。考虑到本文所公开的发明的说明和实践，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。该说明和实施例仅仅应当被认为是示例性的，本发明的真正范围和宗旨通过随后的权利要求进行了说明。权利要求1.通过用替加环素治疗人而制备的替加环素葡糖苷酸代谢物。2.通过用替加环素治疗人而制备的替加环素葡糖苷酸代谢物的差向异构体。3.权利要求l的代谢物，在m/z762处显示质镨峰。4.权利要求2的差向异构体代谢物，在m/z762处显示质镨峰。5.权利要求3的代谢物，进一步在586、569、513、211、154和86处显示质^普峰。6.权利要求4的差向异构体代谢物，进一步在586、569、513、211和86处显示质镯峰。7.制备替加环素葡糖苷酸代谢物的方法，该方法包括如下步骤a.给人提供替加环素的剂量；b.从所述的人获得血清、尿液或粪便样品；c.提取所述样品以获得替加环素葡糖苷酸代谢物。8.权利要求7的方法，其中代谢物在m/z762处显示质镨峰。9.制备替加环素葡糖苷酸代谢物的差向异构体的方法，该方法包^下步骤a.给人提供替加环素的剂量；b.获得粪便或血清样品；c.提取所述样品以获得替加环素葡糖苷酸代谢物的差向异构体。10.权利要求7的方法，其中葡糖苷酸的差向异构体在m/z762处显示质i脊峰。11.化合物，选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>差向异构体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>差向异构体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>12.13.可以通过从用替加环素治疗的人的血清、尿液或粪便中提取得到的替加环素代谢物，其特征在于该代谢物在m/z762处显示质镨峰。14.可以通过从用替加环素治疗的人的血清、尿液或粪便中提取得到的替加环素代谢物，其特征在于该代谢物在762、586、569、513、211、154和86处显示质镨峰。15.基本上纯的形式的根据权利要求1至6和11至14中任一项的化合物，16.药物组合物，包含如权利要求1至6和11至15中任一项所要求的化合物和可药用栽体。17.化合物，选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>18.根据权利要求17的化合物，选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>19.根据权利要求17的化合物，选自:差向异构体和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>20.根据权利要求17的化合物，选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>差向异构体21.22.23.根据权利要求17的化合物，选自:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>24.治疗至少一种细菌感染的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用包含治疗有效量的至少一种选自如下的化合物及其可药用盐的药物组合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向异构体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向异构体和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>差向异构体。25.根据权利要求24的方法，其中至少一种化合物选自I、II差向异构体、III和IV差向异构体。26.根据权利要求24的方法，其中至少一种细菌感染选自复杂性腹腔内感染(cIAI)、复杂性皮肤和皮肤结构感染(cSSSI)、社区获得性肺炎(CAP)、医院获得性肺炎(HAP)征候、由具有耐TetM和TetK决定子的细菌所引起的细菌感染、骨和关节感染、与导管有关的中性白细胞减少症、产科和妇科感染以及由VRE、ESBL、肠道菌和生长迅速的分枝杆菌属所引起的细菌感染。全文摘要已经在用替加环素治疗的人中鉴定了替加环素葡糖苷酸代谢物及其相应的差向异构体。质谱数据已经用于鉴定这些结构。文档编号A61K31/44GK101132799SQ200580045955公开日2008年2月27日申请日期2005年11月3日优先权日2004年11月5日发明者M·霍夫曼,R·A·知唐,W·德迈欧申请人:惠氏公司