专利名称：抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白b的人源化单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体。
背景技术：
人巨细胞病毒(HCMV，human cytomegalovirus)是疱疹病毒科β亚科中基因组最大的DNA病毒，所编码的蛋白质超过227种，具有种属特异性。在发达国家人群感染率为40％～60％，发展中国家感染率更高，我国成人感染率为70％～90％。HCMV感染可以侵袭多个器官，造成严重疾病。HCMV感染是最常见的宫内感染，是导致新生儿先天畸形、进行性耳聋和智力低下的首要原因。我国每年因HCMV感染造成的先天畸形患儿约4万人。同时HCMV感染是目前导致骨髓和器官移植失败的重要原因之一，接受器官移植的HCMV血清抗体阴性患者，HCMV感染率为53％～73％。因而抗HCMV感染的研究日益受到重视。目前在临床上治疗CMV的常用药物，如ganciclovir等是核苷酸的衍生物或类似物，虽然能够竞争抑制病毒利用宿主细胞的DNA复制和转录的相关酶类，对病毒的复制和增殖具有较好的阻止作用，但同时对宿主细胞本身所需要的DNA复制和转录过程也产生不可避免的干扰，对机体细胞的负作用也是显而易见的。因此感染CMV的免疫低下病人、孕妇和新生儿的治疗缺乏高效的特异性药物。鉴于上述抗病毒药物的缺陷，人们一直在寻求新的方法对HCMV感染进行防治。
HCMV通过吸附、侵入细胞、复制及释放这一循环方式在人体内存活。病毒吸附到宿主细胞上是病毒感染的起点，阻断病毒吸附毫无疑问是预防和治疗病毒感染首选目标。gB蛋白在病毒吸附和侵入的过程中起重要作用。目前已经知道，HCMV gB为HCMV包膜中最丰富的糖蛋白，占包膜蛋白的50％以上，由开放阅读框UL55基因编码。gB是由跨膜亚基因gp55和表面亚基因gp116组成的I型膜糖蛋白。gB蛋白经转录翻译后糖基化，形成150KD的gB前体，接着从内质网运输进入高尔基体，在第460氨基酸位点分裂为以二硫键相连的gp55-gp116复合物，即gB。gp55位于羧基端，gp116位于氨基端，两者均含抗原决定簇，复合物总长为906个氨基酸，gB被送至感染细胞的浆膜上并组成病毒体丰富的包膜成分。HCMVgB抗原性的研究已较为清楚，已发现的三个线性抗体结合位点中，其中两个是病毒中和抗体的靶位。AD1是gB中首要的抗原决定簇，位于560-640氨基酸之间，人血清中gB特异性抗体反应中50％以上直接对AD1；gB的第二重要的抗原决定族为AD2，位于68-77氨基酸之间，人血清中30％含有与此表位反应的抗体。电镜分析显示，抗体中和的HCMV病毒体滞留在细胞表面，细胞内的病毒颗粒减少。抗体能通过限制感染细胞病灶阻断感染的扩散。这些结果表明gB的主要致病机制在于提高病毒体穿透，促进细胞间感染的扩散。表明gB蛋白在人巨细胞病毒吸附人体细胞的过程中具有至关重要的作用。
对于HCMVgB这样的病毒包膜糖蛋白靶标，很自然会首先想到免疫方法进行针对性的治疗。通常免疫治疗可分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗通常采用疫苗激发机体特定抗原的免疫力。由于HCMV感染发病患者通常免疫水平低下，机体的免疫能力难以被充分激发，通过疫苗来防止HCMV感染或活化在时间和免疫的效果上不易得到良好的保证。被动免疫通过给予患者特定抗原的中和抗体能帮助患者立刻获得针对特定抗原的免疫力，因为中和抗体能阻断病毒与宿主细胞的结合；对于重新活化的病毒，也能够阻止HCMV的进一步扩散。1998年，美国MedImmune公司的Cytogam通过FDA审批，这是目前唯一用于治疗人巨细胞病毒感染的抗体类药物，在骨髓移植和器官移植患者中有确切的疗效。它是从人巨细胞病毒抗体高滴度的患者血液中提取纯化的血液制品，来源极为有限，同时存在两个主要的缺陷，一方面是因为来源于血浆，存在传播血源性病毒感染的隐患；另一方面其抗体的序列结构尚不清楚，难以进一步扩大其来源。Cytogam的疗效证明抗人巨细胞病毒人源化抗体的有效性，迫在眉睫的问题是设法找到序列明确的抗人巨细胞病毒抗体，为后续通过生物工程大量获得抗人巨细胞病毒人源化抗体打下基础。
1984年单克隆抗体OKT3开始应用于临床，由于它是通过杂交瘤技术制备的鼠源性单克隆抗体，很快就发现存在由于免疫原性引起抗免疫球蛋白反应的问题。从此抗体预防和治疗应用的核心问题就一直是如何才能降低抗体在体内应用时的免疫原性，也就是人源化问题。获得能够阻止HCMV粘附到宿主细胞的人源化抗体无疑具有良好的应用前景。那么，怎样才能来获得这样的人源化抗体呢？目前两种技术能够有效地解决抗体的人源化问题，一种是噬菌体抗体库技术，另一种是转基因抗体技术。噬菌体抗体库技术使得体外获得抗体多样性成为可能，转基因抗体技术则能让动物体内产生人源化的抗体。虽然转基因抗体技术是目前获得人源化抗体最理想的途径，但是其技术难度大，对实验室设备和经费的需求非常高。噬菌体抗体库技术费用低廉得多，而且在普通实验室即可完成，便于实施；噬菌体抗体库技术另一个优点在于因为没有B细胞成熟过程中的选择和淘汰，在体外获得的多样性可以远远大于体内B细胞产生抗体的多样性，同时所获得的序列均为人体来源，临床应用不必再顾虑免疫原性问题。
发明的内容本发明的目的是提供一种能够用于制备临床上用于预防和治疗人巨细胞病毒感染药物的抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体。
为实现上述目的采用的技术方案是这样的即选择噬菌体抗体库技术对人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体进行了研究。首先采集了临床血液标本，通过ELISA检测试剂盒鉴定出HCMVIgG阳性标本；然后提取阳性外周血标本中的淋巴细胞RNA，用RT-PCR共扩增获取了抗体重链可变区基因编码片断、kappa链可变区编码基因和lamda链可变区编码基因；通过overlap-PCR技术，将重链和轻链装配成ScFv片段；经电转化后构建大库容量噬菌体抗体库；将抗体库经过多次筛选后，随后对阳性克隆进行了初步鉴定，获得了具有良好的特异性的抗人巨细胞病毒增殖能力的人源化抗体。
所获得的抗人巨细胞病毒人源化抗体的特征是1)、由蛋白质一级序列SEQ IDNO1表示，该序列表示如下Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr1 5 10 15 20Ser Gly Met Cys Val Ser Trp Thr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala21 25 30 35 40Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile41 45 50 55 60Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Val Thr Asn Met Asp Pro Val Asp61 65 70 75 80Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg Asp Met Val Arg Gly Val Lys Tyr Tyr81 85 90 95 100
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly101 105 110 115 120Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Glu Asn Asn121 125 130 135 140Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr Thr141 145 150 155 160Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala161 165 170 175 180Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp181 185 190 195 200Asp Asp Ser Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser201 205 210 215 220Gly Ile Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu221 225 2302)、具有识别人巨细胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨细胞病毒感染的中和活性。
根据本发明上述抗人巨细胞病毒人源化抗体蛋白，通过现有生物工程技术，就能够找到与之对应的核苷酸编码序列，所述序列能在原核细胞、真核细胞以及任何重组病毒表达系统中表达。
为此，本发明的保护还涉及与抗人巨细胞病毒人源化抗体所对应的核苷酸编码序列。
本发明的优点在于所涉及的抗人巨细胞病毒人源化单链抗体，对人体没有物种差异，不会导致免疫损伤；而且特异性好，具有良好的结合能力，可以为将来临床抗病毒预防和治疗提供可行的特异性抗体类药物。
附图1为临床患者外周血淋巴细胞RNA电泳图；附图2为抗体重链编码区RT-PCR结果。在400bp处出现明显亮带，与预计的扩增片段大小相符；附图3为抗体kappa链编码区RT-PCR结果。在350bp左右出现明显亮带，与预计的扩增片段大小相符；附图4为抗体lamda链编码区RT-PCR结果。在350bp左右出现明显亮带，与预计的扩增片段大小相符；附图5为重链轻链装配结果；附图6为噬菌体单链抗体库单个克降筛选结果；附图7为人源化单链抗体HCMV-scfv-1的中和试验结果。
具体实施例方式
以下通过实例对本发明作详细说明实例1、临床患者外周血淋巴细胞分离和RNA提取取15ml离心管；每管加淋巴细胞分离液8ml。将每个标本的4ml血液轻轻叠加在分离液上；3000rpm离心20分钟；轻轻吸取分层界面的淋巴细胞层，3000RPM离心20分钟；轻轻吸去上清，加入0.5ml Tripure混匀，提取RNA。RNA提取结果见图1实例2、人源化单链抗体基因片段的扩增将实例1中提取收集样本的RNA，通过逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出抗体重链和轻链可变区的基因编码片段，并将重链和轻链可变区通过overlap-PCR装配在一起。其中，逆转录反应条件30℃10min；42℃60min；99℃5min；4℃5min。PCR条件94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循环35次；72℃10min；4℃10min。overlap-PCR条件94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，循环25次；72℃10min；4℃10min。所得的结果如图2-图5所示。
实例3、抗体库的构建将回收纯化的overlap-PCR产物用和载体质粒pComb3X分别用SfiI酶切，将酶切后的单链抗体片段和载体回收纯化后，用DNA连接酶连接，室温孵育4小时至过夜。将连接样品和相应数量电转杯冰浴10min。同时取电感受态细菌，冰上溶解。将连接后的样品与感受态细菌混合，加入电转杯。冰浴1分钟，电转仪设定为25μF，2.5kV，200Ω，持续时间约4-5毫秒。分次用1、2、2mlSOC培养基立即冲洗电转杯，在50ml试管中混合洗液，37度250rpm振荡1小时。加入10ml预热的SB培养基，3ul100mg/ml羧苄(如果用XL1-blue，同时加入30ul5mg/ml四环素。计算转化滴度时，取2ul培养液稀释到200ulSB培养基中，，分别取100和10ul在LB羧苄平板上推板。37度过夜。总转化数等于菌落克隆数X培养液体积/推板液体积)。250rpm振荡15ml培养液，37度1小时。再加入4.5ul100mg/ml羧苄，再振荡培养1小时。加入2mlVCSM13辅助噬菌体(1012-1013pfu/ml)，加入183ml37度预热的SB培养基，92.5ul100mg/ml羧苄，(如果用XL1-blue，同时加入370ul5mg/ml四环素)。300rpm振荡培养液，37度1.5-2小时。加入280ul50mg/ml卡那霉素，300rpm振荡培养液，37度过夜。构建噬菌体抗体库容量约为6.5*108。
实例4、抗体库筛选用2ug/100ul的抗原包被96孔板，每孔100ul。用胶膜封好后，4℃过夜。排干包被液，用150ul 3％BSA封阻液，用胶膜封好后，37℃孵育1hours。拍干包被液，加50ul准备好的抗体库/孔，用胶膜封好后，37℃孵育2hours。同时取12ml试管加入2ml SB培养基，2ul XL1-Blue，37℃培养1.5-2.5hours，振荡速度250rpm，到菌液OD600nm接近1时取出。拍干噬菌体液，加150ul 0.5％TBS溶解，快速上下冲洗5次，静置5分种后，排干液体，重复洗涤5次。拍干最终洗脱液后，每孔加入50ul新鲜配制的胰蛋白酶，封口孵育37℃0.5hours，猛烈冲洗10次，将洗脱液转入准备好的2mlEcoli中，室温孵育15min。加入37℃预热的6ml SB培养基，1.6ul100mg/ml羧苄，12ul5mg/ml四环素，将培养液移到50ml离心管中，37℃培养1hours，振荡速度250rpm。加入2.4ul100mg/ml羧苄，37℃培养1.5-2.5hours，振荡速度250rpm。加入1mlVCSM13(1012-1013)到8ml培养液中，移入500ml摇瓶，加入91ml37℃预热SB，46ul100mg/ml羧苄。37℃培养1.5-2.5hours，振荡速度300rpm。加入140ul50mg/ml卡那霉素，37℃培养过夜，振荡速度300rpm。4℃，3000g离心15min，取上清收获噬菌体，将上清加入一个干净的500ml离心瓶，加入4gPEG8000，3gNaCl，37℃培养5min，振荡速度300rpm，溶解固体。冰浴保存30min。4℃，15000g离心15min，沉淀PEG，弃上清，倒置用吸水纸吸干管壁上的液体。用2ml1％BSA轻柔悬浮噬菌体沉淀，4℃15000g离心5min。将上清用0.2um滤膜过滤，进入新一轮筛选。随着筛选轮数的增加，逐步提高筛选严谨度。将1-5轮筛选后的噬菌体抗体库液做ELISA，分析阳性抗体的富集程度。挑选单个克隆的噬菌体抗体作ELISA实验，结果如图6所示。将阳性克隆送公司测序并分析抗体序列。
实例5、单链抗体中和试验为了避免传统的噬斑减少试验不易于定量和标准化的缺点，我们以空白噬菌体为对照，用噬菌体抗体和病毒共同孵育后24小时内感染细胞内病毒糖蛋白B含量的变化来观察单链抗体抗体的抑制效果。从图7中的变化趋势可以看出本发明单链抗体的抑制效果良好，与对照组相比人巨细胞病毒包膜糖蛋白B表达量下降了36％。
权利要求
1.一种抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体，其特征在于1)、由蛋白质一级序列SEQ ID NO1表示；2)、具有识别人巨细胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨细胞病毒感染的中和活性。
2 与权利1所列出的单链抗体序所对应的核苷酸编码序列，所述序列能在原核细胞、真核细胞以及任何重组病毒表达系统中表达。
3.权利1所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体在制备临床上用于预防和治疗人巨细胞病毒感染药物中的应用。
全文摘要
本发明的目的是提供一种抗人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的人源化单链抗体，其特征是1)由蛋白质一级序列SEQ ID NO1表示；2)具有识别人巨细胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨细胞病毒感染的中和活性。本发明还保护与所述人源化单链抗体序列所对应的核苷酸编码序列。本发明的优点在于所涉及的抗人巨细胞病毒人源化单链抗体，对人体没有物种差异，不会导致免疫损伤；而且特异性好，具有良好的结合能力，可以为将来临床抗病毒预防和治疗提供可行的特异性抗体类药物。
文档编号A61P3/00GK101054415SQ200710078440
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者顾长国, 李磊, 王正国, 刘琛 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所