专利名称：一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物及其药盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗领域，具体地说，是涉及一种治疗勃起功能障碍
症(Erectile Dysfunction，简称ED)的基因治疗药物及其药盒，更具体地说， 是涉及一种大钾通道(maxi-K)基因-腺相关病毒(AAV)载体重组体的基 因治疗药物及其药盒。
背景技术：
北京人民医院在2004年进行的一项为期6个月的对1000多名成年男 性的调查表明，40岁以上的中国男性52.5%患有程度不等的阳痿。美国的 一项调査研究也表明，40-50岁的男性中，40。/。的人曾发生过ED;而60-70 岁的男性则为70%。最近统计美国约有超过三千万ED患者，全球约有一 亿以上患者。随着生活节奏的加快和社会老龄化，ED患者将逐年增多。 过去将男性性功能障碍症称之为"阳痿"，近年来，医学界改称其为"勃起功 能障碍"，英文为Erectile Dysfunction,简称ED。治疗勃起功能障碍的方 法很多，目前，临床上以物理、心理和药物治疗为主。药物治疗中以口月艮 药物较受欢迎，典型的例子是柠檬酸昔多酚(Sildenatil Citrate,商品名为 Viagra,国人称伟哥)，美国辉瑞公司在1992年开发治疗心绞痛药物时， 在临床试验中，其治疗心绞痛效果不理想，而病人发现，对性功能提高有 帮助，经病理生理学和药理分析，它是一种阴茎动脉扩张剂，有助阴茎在 应激情况下勃起。经重新申报新用途后，美国FDA于1997年3月批准上 市，至今，该药是世界上公认的较成功的ED治疗药物。目前，全球有多 家公司在开发ED的治疗药物，可以预测，今后几年内类似伟哥的产品将 会相继上市。
尽管伟哥的起效快，有效率较高，颇受消费者欢迎，但它同样存在其 它合成药的弱点。在上市以来几年中相继有500多人服后死亡或出车祸的报道，故医学界认为伟哥有毒副作用，特别对血压异常和心脏病人不能随 便使用；而且伟哥价格不菲，在国内很多人消费不起，即使在国外也会让 很多人负担不起。英国等国家对伟哥的销售采取严格的管制措施，对消费 者来说，这无疑是一种消极负面的影响。寻找和开发一种功能类似伟哥而 无副作用且不要每次服药的长效药物倍受瞩目，而基因治疗药物是研发热 门。
基因药物是指利用有治疗效果的目的基因，用高通量功能筛选和体内 外药效研究开发得到，经生物信息学分析、动物实验研究其表达的蛋白有 治疗作用。基因药物治疗可以说是现代医疗技术上的一次革命，相对于传 统的化学合成药物的治疗，基因药物有着特有的优势(l)高疗效和长疗效， 好的载体能使治疗基因在细胞内长期稳定表达治疗蛋白，从而达到一劳永 逸的效果而传统药物代谢快，需经常服用。(2)副作用少，与传统药物的 全身性作用相反，基因治疗药物的靶向性极强，可特异性地作用于某类组 织及细胞上；P)针对性强，基因治疗可以解决那些对传统药物效果不好的 疾病，如各类肿瘤、遗传性疾病以免疫相关的疫病等。
基因疗法是指将正常基因植入靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基 因，或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和医疗疾病目的的一种临 床医疗技术。基因治疗中最重要的一个环节是选择适当的基因载体 (Vector)。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。病毒载体具 有天然的感染能力，转染效率高，常用的有单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷 病毒、逆转录病毒、腺病毒(Adeno virus,Ad )和腺相关病毒 (Adeno-Associated virus, AAV)等载体。
2004年10月19日，国际性阳痿研究协会召开的一次会议宣布了一个 消息，三名志愿者参与的一项基因治疗ED的试验证明，基因疗法治疗ED 不仅有效，而且不会产生与治疗相关的副作用。这项研究是由美国纽约爱 因斯坦医学院的阿尔伯特.梅尔曼博士等支持进行的，他们对病人采用一种 称为大钾(maxi-K)基因阴茎注射液，试验其疗效，也评价其安全性。
进行这项试验的机理是，人的阴茎细胞结构里有一种大钾离子通道， 这种通道参与了缓解阴茎平滑肌收缩的过程，而正是由于阴茎平滑肌的舒
4缓才使得血液能充盈阴茎，使阴茎能正常勃起。研究人员在人体试验前，
对小鼠进行了试验，结果表明能有效增加性功能和减少小鼠的ED。参与 这项试验的三名志愿者有中度到重度不同的ED，他们接受了低剂量由腺 病毒作载体的大钾基因注射液，在以后的1-5月没有人出现任何副作用。 这种基因药物疗法最大的好处是比较长效， 一次注射可以让男性性功能改 善6个月。基于这次研究结果的鼓舞，梅尔曼博士在2004年再招募6人以 上的志愿者进行试验。现已申报临床三试验。
尽管梅尔曼博士的研究计划很完美，仍有几个棘手问题需要解答1. 由腺病毒(Ad)作载体，Ad有潜在的安全性问题和副作用，不能轻易回 避；2.腺病毒的缺点是，表达外源基因时间短，免疫原性强，可引发机体 产生强烈的毒性反应和免疫反应，毒性大，免疫反应重，有抗药性，不能 多次注射；3.注射剂直接在阴茎上注射，使用者会产生害怕心理。
腺相关病毒(AAV)是微小病毒科成员，基因组为4682个核苷酸组成 的单链DNA，用于基因治疗的载体，它有一定的优势AAV本身不引起 任何人类疾病。腺相关病毒病毒本身只有两个基因，即复制基因Rep和编 码基Cap,后者易于清除或降低细胞的毒性及T淋巴细胞反应的危险性。 AAV感染人体后，可在19号染色体上进行位点特异性整合，如果没有辅 助病毒如腺病毒、疱疹病毒或水痘病毒等共感染，野生型就潜伏在19号染 色体上的特定部位(无功能区)，直到辅助病毒出现才复制；腺相关病毒的 DNA能够稳定有效整合到人细胞基因组，而且有宽广的宿主范围，能潜伏 感染非分裂细胞，研究表明AAV能有效转导脑、骨骼肌、肝脏、肺、皮肤、 视网膜、血管内皮、胃肠道粘膜，在猴子的实验中表达可持续6年以上。 因此，AAV被认为是一种用于人类基因治疗的很有前途的安全载体。
因此，本发明采用腺相关病毒(AAV)做载体，提供一种更安全有效， 能长期使用，无抗药性，且不用注射，直接涂抹在阴茎龟头表皮或尿道口 滴入就能导入治疗基因的更为理想和符合需要的药物。当然，本发明也包 括注射剂。此外，本发明还提供包括上述药物的药盒。
发明内容
为实现本法的目的，本发明的技术方案如下
本发明提供一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物，其中，所述的
药物为大钾通道(maxi-K)基因-腺相关病毒(AAV)载体重组体的水剂、 油剂、注射剂或滴入剂。本发明的大钾通道基因具有SEQIDNO: l所示
的序列。
根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的水剂、注射 剂或滴入剂还包括作为保护液的5%的山梨醇或甘露醇。
根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的油剂还包括 动物油或植物油(如甘油或油脂等)。
根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的腺相关病毒 (AAV)载体是各种血清型的AAV载体。本发明采用的腺相关病毒载体 (AAV)，根据转染或感染皮肤和尿道内膜的转染率不同，从AAV1-AAV8 中筛选感染率高的血清型AAV，优选的是AAV2型。
本发明还提供一种药盒，其中，所述的药盒包括上面所述的药物和说 明书。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为水剂，其组成 还包括作为保护液的5%的山梨醇或甘露醇。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为滴入剂，其组 成还包括作为保护液的5%的山梨醇或甘露醇。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为注射剂，其组 成还包括作为保护液的5%的山梨醇。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为油剂，其组成 还包括动物或植物油(如甘油、油脂等)。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的说明书记载内容如下
(1) 药物使用方法为涂抹在龟头表皮、滴入尿道口或阴茎注射；
(2) 药物在4"C或-20'C储存。
(3) 药物使用前先行排尿。 本发明大钾通道基因一rAAV重组体大规模生产工艺可采用下面的方法
(1) 细胞种子扩大
取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专 用发酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37。C，用二氧化碳来平衡培养 液的pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标(如氧分压、二氧 化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等)，细胞在发酵 罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密度， 中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血清培 养液。
(2) 质粒转染(符合GMP标准的三质粒共转染技术)
重组Maxi-K基因的腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因 功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap;腺相关病毒的辅助系统质 粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转 染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80%左右，历时 5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将 转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时， 再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作， 使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。 必须有充足的营养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子； 保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适 宜细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分庄、 二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等(具体条件指明，或方法来源的文献)， 保持合适的细胞密度。
(3)营养更新(介质更新)
细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出 代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等， 也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新 和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率， 进一步提高产量。(4) 细胞收集
当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收 集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告 基因Lacz，或肉眼观察见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。将收集 的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。
(5) 细胞破壁和纯化
富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作 过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析 袋，在4°(:下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条 件下重组腺相关病毒载体的产品。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果
(1) 本发明采用腺相关病毒(AAV)做载体，更加安全而无毒副作
用；
(2) 本发明的水剂和滴入剂临床用药更加方便，而顺应性好的患者也 可以选择注射剂，效果更快些，便于患者选用；
(3) 本发明采用三质粒共转染的生产工艺，便于工业化、规模化生产；
(4) 本发明的药物药效持久、且与现有药物相比比较经济廉价。
具体实施例方式
下面参照实施例，更具体地说明本发明内容。应当理解，下面的实施 例用于说明本发明的内容，而非限定本发明的内容，任何形式上的变动和/ 或变通，将落入本发明的保护范围。 实施例1
本发明基因治疗药物——水剂的生产工艺如下 (1)细胞种子扩大
取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专用发 酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37。C，用二氧化碳来平衡培养液的 pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标，如氧分压、二氧化碳 分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等。细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密度，中间的 培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血清培养液。
(2) 质粒转染
重组Maxi-K基因的腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因 功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap;腺相关病毒的辅助系统质 粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转 染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80%左右，历时 5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将 转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时， 再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作， 使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。 必须有充足的营养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子； 保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适 宜细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、 二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等，保持合适的细胞密度。
(3) 营养更新(介质更新) 细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出
代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等， 也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新 和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率， 进一步提高产量。'
(4) 细胞收集
当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收 集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告 基因Lacz，或肉眼观察见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。将收集 的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。
(5) 细胞破壁和纯化
富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作 过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析袋，在4。C下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条 件下重组腺相关病毒载体的产品。 (6)包装和储存
收集到重组大钾基因maxi-K产品后，在4^C包装，加入5%山梨醇或 5%甘露醇作为保护液，包装为所需的水剂，在^C或-2()GC低温保存。
实施例2
本发明基因治疗药物——滴入剂的生产工艺如下 除了步骤(6)包装为滴入剂外。 其他操作同实施例1。
实施例3
本发明基因治疗药物——注射剂的生产工艺如下 除了步骤(6)包装为注射剂，加入5%山梨醇作为保护液。 其他操作同实施例1。
实施例4
自愿受试者三人，男性，年龄分别为47、 55、 65岁，有ED症状，使 用本发明制备的水剂，从阴茎尿道口滴入1毫升水剂，每天一次，连续使 用二周。五个月后阴颈勃起功能明显改变，性交时间延长。受试者非常满
10<formula>formula see original document page 11</formula>
权利要求
1、一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物，其特征在于，所述的药物为大钾通道基因—腺相关病毒载体重组体的水剂、油剂、注射剂或滴入剂，所述大钾通道基因具有SEQ ID NO1所示的序列。
2、 如权利要求l所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的水剂、注 射剂或滴入剂还包括5%的山梨醇或甘露醇。
3、 如权利要求l所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的油剂还包 括动物油、甘油或油脂。
4、 如权利要求l所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的腺相关病 毒载体是各种血清型的腺相关病毒载体，其中所述的腺相关病毒载体根据 转染或感染皮肤和尿道内膜的转染率不同，优选AAV1-AAV8中感染率高 的血清型AAV，最优选的是AAV2型。
5、 一种治疗勃起功能障碍症的基因治疗药物药盒，其特征在于，所述 的药盒包括如权利要求1所述的药物和说明书。
6、 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为水剂，其组 成还包括5%的山梨醇或甘露醇。
7、 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为滴入剂，其 组成还包括5%的山梨醇或甘露醇。
8、 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为注射剂，其 组成还包括5%的山梨醇。
9、 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药物为油剂，其组 成还包括动物油、甘油或油脂。
10、 如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的说明书记载内容 如下(1)药物使用方法为涂抹在龟头表皮、滴入尿道口或阴茎注射；(2) 药物在4'C或-2(TC储存。(3) 药物使用前先行排尿。
全文摘要
本发明提供一种治疗勃起功能障碍症的基因药物，所述的药物是大钾通道基因-腺相关病毒载体重组体的水剂、油剂、滴入剂和注射剂，经由rAAV的大规模生产化培养，采用三质粒共转染方法，分离、纯化制成。本发明还提供包括上述药物的药盒。本发明的药物在使用上简单方便，可有效改善或治疗ED，且药效持久，安全无毒副作用，有巨大的社会和经济效益。
文档编号A61K48/00GK101444628SQ200810177469
公开日2009年6月3日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月30日
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司