专利名称：一种非注射用的基因治疗药物及其药盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗领域，具体地说，是涉及一种非注射用的基因治 疗药物给药途径及其药盒，更具体地说，是涉及一种以重组腺相关病毒为 载体制备的水剂、油剂或水油混合剂给药途径及其药盒。
背景技术：
基因疗法是指将正常基因植入靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基 因，或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和医疗疾病目的的一种临
床医疗技术。在治疗遗传性疾病、恶性肿瘤、癌症、艾滋病病毒(HIV)、 关节炎、糖尿病、腺苷脱氢酶(ADA)缺陷症、神经系统紊乱、心脏病等疾 病方面，基因疗法发挥着越来越重要的作用。
基因治疗的最早提出是针对单基因缺陷的遗传病，其原理是用一个正 常的基因来置换缺陷的基因或补救缺陷基因。1990年美国国家卫生院 (NIH)研究的Blas6RM禾卩Anderson WF用ADA (腺苷酸脱氨酶)基因 治愈了一位因ADA基因缺陷导致严重免疫缺失(SCID)的4岁女孩，使 世界各国掀起研究基因的热潮。至今，基因治疗的研究内容也从单基因的 遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系统疾病、自身免 疫性疾病、内分泌以及老年性疾病上。近来，基因载体的技术，外源基因 的表达调控等研究的突破性进展，使基因治疗在人体内应用的安全性和靶 向性大大提高。从2005年7月以来，已有1076项基因试验在全世界20 多个国家开展，治疗病例6000多例。
基因治疗是一把双刃剑，基因治疗中最重要的一个环节是选择适当的 基因载体(Vector)。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。目 前在基因治疗研究或临床试验上，85%是使用病毒载体，2000年时，美国 宾州大学有病人在基因治疗中死亡，2003年法国又发生先天免疫不全症，
3基因治疗临床试验发生类白血病的副作用。这两种失败的案例，被归于病 毒载体的安全性低，据了解，均是由于逆转录病毒作为基因载体所引起的。 因此，逆转录病毒载体逐渐被淘汰。而今用腺病毒和腺相关病毒，腺病毒 的缺点是表达外源基因时间短，免疫性强，可引发机体产生强烈的炎症反 应和免疫反应，毒性大，免疫反应重， 一次使用后产生抗原抗体反应，重 复使用无效。
目前，被看好的基因治疗载体是腺相关病毒AAV，它具有病毒基因组 小，如2型腺相关病毒是4681核苷酸组成的单链DNA，可感染分裂静止 期细胞，当辅助病毒不存在时，AAV能整合到宿主细胞基因组的特定区域， 无致病性，免疫原性弱，可以感染宿主组织细胞肝、肺、肾、脑、胃肠 道黏膜、视网膜、皮肤、肌肉等组织，在猴子的实验中，六年持续表达目 的蛋白，它无毒高效，是目前理想的基因治疗载体。构建重组AAV(rAAV) 涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组 包装到一个有感染性的病毒颗粒里。
我国的预防科学院病毒研究所与本元正阳基因技术公司和国内多个单 位合作，用重组腺相关病毒(rAAV)载体开展肿瘤和遗传病的基因治疗项 目。复旦大学遗传所和本元正阳基因技术公司合作重组AAV (携带凝血因 子)的血液病治疗项目已进入临床2期。第一军医大学南方医院肿瘤中心 采用腺相关病毒为载体，将人乳头状病毒的E-6和E-7及GM-CSF病毒转 染DC用于宫颈癌的治疗。可以预见在近几年，国外和国内将会有很多的 基因治疗方案采用AAV做载体。由于基囟治疗针对的脏器和疾病的不同， 特别是深部器官内的靶向性的问题至今无突破，使基因治疗效果受到影响。 一味采用肌肉注射或静脉注射可能影响治疗效果，如胃肠道或直肠疾病(消 化器官癌症或其他疾病)，可能使用胃肠道给药药效会更好；如皮肤疾病或 其他疾病，可能经皮转录目的基因，比常规肌肉注射和静脉注射会发挥更 好的治疗作用；如生发类的基因治疗药物如果可以直接涂抹在头皮表面， 局部用药浓度更高；治疗ED基因药物采用尿道或皮肤给药比阴颈注射方 便多，上述用药有非常重要的临床意义。将注射类药物改为口服剂或涂 抹剂，将会使基因治疗药物更易进入临床以及降低诸多生产成本和测试成本。
因此，本发明旨在提供一种非注射用的基因治疗药物。本发明还提供 包括上述药物的药盒。
发明内容
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下-
本发明提供一种非注射用的基因治疗药物，所述的药物是目的基因-腺相关病毒重组体制备的水剂、油剂或水油混合剂。
根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的药物重组体 的目的基因包括各种对癌症、心脑血管、老年性疾病、内分泌疾病、自身 免疫性疫病、血液性疾病或遗传性疾病有治疗作用的基因。
根据本发明所述的基因治疗药物，其中较好地是，所述的腺相关病毒 包括所有血清型的腺相关病毒。
本发明还提供一种药盒，所述的药盒包括如上所述的基因治疗药物和 说明书。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的基因治疗药物重组体 的目的基因包括各种对癌症、心脑血管、老年性疾病、内分泌疾病、自身 免疫性疫病、血液性疾病或遗传性疾病有治疗作用的基因。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的药物为水剂、油剂或 水油混合剂。口服首选水剂，药物通过胃肠道、直肠黏膜转染导入体内， 水剂更利于疾病的治疗，也可使用油剂或水油混合剂；皮肤涂抹首选油剂， 在表皮、头发、阴茎龟头、尿道口内粘膜、阴道内膜等皮肤涂抹，也可使 用水剂或水油混合剂。
根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的基因治疗药物还包含 调整胃肠道、直肠pH值的溶剂(选自细胞培养液、细胞保护液、酸性水 溶液或碱性水溶液)。药物口服后通过胃肠道、直肠粘膜转染导入，为配合 腺相关病毒在最佳pH值8中得到最高转染率，要随时改变胃肠道、直肠 的pH值，本发明使用的溶剂是培养条件的pH值，不影响腺相关病毒导入 体内的生物活性功能。根据本发明所述的药盒，其中较好地是，所述的说明书记载的内容如下
(1) 基因治疗药物采用口服或皮肤涂抹的方法给药。
(2) 调整胃肠道、直肠pH值的细胞培养液、细胞保护液、酸性水溶 液或碱性水溶液单独在用药前使用。
(3) 调整胃肠道、直肠pH值的细胞培养液、细胞保护液、酸性水溶 液或碱性水溶液混合在含有目的基因的腺相关病毒载体中使用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果
(1) 本发明药物选用腺相关病毒为载体，安全无毒副作用；
(2) 本发明药物成本与注射剂相比较低，根据不同病情选择适用的剂 型，可达到更好的治疗效果；
(3) 本发明的药物给药方便、可多次重复，病人易于接受，给病人带 来方便的同时亦有相当大的实用价值。
具体实施例方式
下面参照实施例，更具体地说明本发明内容。应当理解，下面的实施 例用于说明本发明的内容，而非限定本发明的内容，任何形式上的变动和/ 或变通，将落入本发明的保护范围。 实施例1
本发明基因治疗药物——水剂的生产工艺如下 一、细胞种子扩大
取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专 用发酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37。C，用二氧化碳来平衡培养 液的pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标(如氧分压、二 氧化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等)，细胞在发 酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密 度，中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血 清培养液。培养工艺中本发明改由转瓶到发酵罐大容量悬浮培养和无血清 培养，用悬浮培养方法代替贴壁培养，使大规模培养更易操作，也降低了 培养液自身带来的动物源性污染，提高产品的安全性。二、 质粒转染(符合GMP标准的三质粒共转染技术) 重组Maxi-K基因的腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因
功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap;腺相关病毒的辅助系统质 粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转 染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80%左右，历时 5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将 转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时， 再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作， 使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。 值得一提的是HEK293在发酵罐中培养的基本条件，尽量提供与体内生活 条件相接近的培养环境，培养环境应具备以下几个因素所有与细胞接触 的设备、器材、溶液等，其中包括种子库细胞培养和放大培养及生产培养 过程，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染，必须有充足的营 养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子；保证有适量的 氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适宜细胞生存的 外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、二氧化碳分压、 葡萄糖浓度、pH值等，保持合适的细胞密度。
三、 营养更新(介质更新) 细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出
代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等， 也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新 和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率， 进一步提高产量。
四、 细胞收集
当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收 集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告 基因Lacz比例，或肉眼观察，见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。 将收集的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。
五、 细胞破壁和纯化富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作 过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析
袋，在40C下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条
件下重组腺相关病毒载体的产品。
六、包装和储存
收集到重组基因治疗药物产品后，在4QC包装，加入保护液5%山梨 醇或5%甘露醇，包装为所需的水剂，在4。C或-2()GC低温保存。
实施例2
除步骤六加入甘油包装为油剂外。 其他操作同实施例1。
实施例3
自愿受试者三人，男性，年龄分别为47、 55、 65岁，有ED症状，使 用本发明制备的水剂，从阴茎尿道口滴入1毫升水剂，每天一次，连续使 用二周。五个月后阴茎勃起功能明显改变，性交时间延长。受试者非常满 思。
权利要求
1、一种非注射用的基因治疗药物，其特征在于，所述的药物是目的基因--腺相关病毒重组体制备的水剂、油剂或水油混合剂。
2、 如权利要求1所述的基因治疗药物，其特征在于，所述基因治疗 药物的目的基因是与癌症、心脑血管疾病、老年性疾病、内分泌疾病、 自身免疫性疫病、血液性疾病或遗传性疾病相关的基因。
3、 如权利要求1所述的基因治疗药物，其特征在于，所述的腺相关 病毒包括所有血清型的腺相关病毒。
4、 一种非注射用的基因治疗药物药盒，其特征在于，所述的药盒包 括如权利要求1所述的基因治疗药物和说明书。
5、 如权利要求4所述的药盒，其特征在于，所述的基因治疗药物的 目的基因是与癌症、心脑血管疾病、老年性疾病、内分泌疾病、自身免 疫性疫病、血液性疾病或遗传性疾病相关的基因。
6、 如权利要求4所述的药盒，其特征在于，所述的药物为水剂、油 剂或水油混合剂。
7、 如权利要求6所述的药盒，其特征在于，所述的基因治疗药物还 包含调整胃肠道、直肠pH值的细胞培养液、细胞保护液、酸性水溶液 或碱性水溶液。
8、 如权利要求4所述的药盒，其特征在于，所述的说明书记载内容 如下(1) 基因治疗药物采用口服、呼吸道、尿道或皮肤涂抹的方法给药；(2) 调整胃肠道、直肠pH值的细胞培养液、细胞保护液、酸性水 溶液或碱性水溶液单独在用药前使用；(3) 调整胃肠道、直肠pH值的细胞培养液、细胞保护液、酸性水 溶液或碱性水溶液混合在含有目的基因的腺相关病毒载体中使用。
全文摘要
本发明公开一种非注射用基因治疗药物，该药物是以重组腺相关病毒(rAAV)为载体制备的水剂、油剂或水油混合剂；该药物重组体的目的基因包括各种对疾病有治疗作用的基因。本发明还公开了包含上述药物的药盒，药盒还包括说明书，说明书记载该药物通过口服、呼吸道、尿道、肛肠注入或皮肤涂抹使用。目前，rAAV载体基因治疗药物的给药途径都采取注射方法，本发明与现有技术相比，给药更加简单方便，并可多次重复，病人更容易接受，在给病人带来很大方便的同时，亦具有相当大的实用价值。
文档编号A61K48/00GK101444629SQ200810177470
公开日2009年6月3日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月30日
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司