专利名称：一种制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法
技术领域：
本发明属于天然产物开发或药品原料的制造方法，具体涉及以红豆 杉植物材料或者细胞培养物的醇性浸膏为原料，转化、制备多羟基紫杉 烷与同步分离紫杉醇的方法。
背景技术：
紫杉醇(taxol),是一种疗效显著的天然抗肿瘤药物，在治疗AID 相关的卡波西肉瘤(Kaposi's Sarcoma)方面也有良好的应用前景，它 与目前己经上市的第二代紫杉醇药物泰索帝(taxotere)，和进入临床 1I期的第三代紫杉醇14一e—羟基去乙酰巴卡亭(ortataxel)，具有相 同的母核结构，差异仅在母核上个别取代基团的不同，统称为紫杉烷类 化合物。紫杉醇是红豆杉产生的二萜类次生代谢产物，结构很复杂，通 过化学全合成途径生产很不现实，现在主要从红豆杉树皮或者枝叶中、 少量从红豆杉细胞培养物中直接提取分离，或者先分离提纯同时存在于 红豆杉浸膏中的IO —去乙酰巴卡亭III (10—deacey1- baccatin III) 和巴卡亭III (baccatin III)，再以这些前体化合物为原料进行化学半合 成获得泰索帝(taxotere)和14一 P —羟基去乙酰巴卡亭(ortataxel)。 但紫杉醇及其半合成前体10-去乙酰巴卡亭III (10 —deaceyl-baccatin III)和巴卡亭III (baccatin III)在植物组织或细胞培养中 的含量高低受品种和许多复杂因素制约，大多数情况下，它们的含量并 不高。例如，紫杉醇在可再生的红豆杉枝叶中含量平均在0.02%以下； IO —去乙酰巴卡亭III (10 — deaceyl- baccatin III)和巴卡亭III (baccatin III)虽然在浆果红豆杉(7: Asccats)枝叶中含量高达O. 1%，
但在中国红豆杉(7: c/ j'/7朋w's)中，含量却很低，大概在ppm的数量 级，低含量一方面导致大量植物资源被采伐，加剧了紫杉醇的供需矛盾， 另一方面加大了提取分离工艺的难度。
事实上，红豆杉组织和细胞浸膏中还含有大量其它种类的紫杉垸，以
巴卡亭VI (baccatin VI)禾口云南宁(taxuyu腿nine C)为代表的多乙
酰紫杉垸在中国红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉、西藏红豆杉、云
南红豆杉、加拿大红豆杉等这些品种中含量相当高，所述多乙酰紫杉烷
是指具有如下巴卡亭VI (baccatin VI)、云南宁(taxuyunnanine C)结
构骨架特征之一、在C7、 C9、 C10、 C13、 C14、 C5这些任意3个或以上
位点具有乙酰取代的紫杉二萜类物质。这些多乙酰紫杉烷虽然具有和紫
杉醇一样或类似的母核结构，但本身并不显示明显的抗肿瘤活性，它们 存在于红豆杉植物或细胞培养物的醇性浸膏中。现有的以紫杉醇或者10 —去乙酰巴卡亭III (10 —deaceyl- baccatin III)和巴卡亭III
(baccatin III)为提取分离目标的技术见(1)美国专利USP 5， 412， 116 (1995) oxidation of glycoside substituted taxanes to taxol or taxol precursors and new taxane compounds formed as intermediates; (2)公开号CN1096820,细胞培养生产紫杉醇的方法；
(3)公开号CN1534032, —种高效制备紫杉醇的方法；(4)公开号 CN101函48，制备紫杉醇的方法；(5)公开号CN1158126,制备紫杉醇 及其衍生物的方法；(6)公开号CN1197796， 一种紫杉醇制备的新方法。 在这些方法中，多乙酰紫杉烷通常被作为"杂质"而被除去，造成宝贵 天然资源的极大浪费。因此，在分离纯化紫杉醇的同时，将浸膏中这些 丰产紫杉垸经过结构改造，"变废为宝"生成有用的紫杉醇或者其制药的
前体意义重大。
发明内容
本发明提供一种制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，针对紫杉醇的 来源紧张问题，从红豆杉植物材料或者细胞培养物的醇性浸膏中分离紫 杉醇的伺时，将其中高丰度的多乙酰化紫杉烷，选择性地转化为相应的 多羟基紫杉烷，生产可被制药工业利用的原料，特别针对多乙酰紫杉垸
化合物巴卡亭VI转化成为多羟基紫杉烷化合物四去乙酰巴卡亭VI、将多
乙酰紫杉烷化合物云南宁转化成为多羟基紫杉烷化合物四去乙酰云南 宁。
本发明的一种制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，包括
(1) 树脂柱分离步骤将红豆杉植物组织或细胞培养物的甲醇或乙醇浸 膏加载到大孔树脂柱上，用含甲醇20% 40%的水溶液冲洗，除去水
溶性杂质或色素，再用含甲醇50% 80%的水溶液冲洗，收集3倍柱 体积的洗脱液，将洗脱液中的甲醇蒸干，加入等体积的与水互不相 溶的萃取溶剂进行液-液萃取，收集有机溶剂层，蒸干，得到大孔树 脂柱分离粗品，所述百分比均为体积百分比；
(2) 氧化铝层析柱分离步骤用甲醇与二氯甲烷混合液溶解大孔树脂柱
分离粗品，上样于氧化铝柱上，大孔树脂柱分离粗品与氧化铝的质
量比为1/60 1/100，进行中低压正相层析，用甲醇与二氯甲垸混
合液洗脱，薄层层析结合高效液相色谱方法检测流分，获得富含多 乙酰紫杉烷的流分，以及富含紫杉醇的流分，减压蒸干溶剂，获得
含多乙酰紫杉烷粗品以及紫杉醇粗品；
(3) 水解反应步骤向含多乙酰紫杉烷粗品中添加极性有机溶剂,再加 入碱性溶液或者悬液，使整个溶液pH值为9 11，极性有机溶剂占
整个溶液体积的30% 60%，搅拌反应0. 5 1小时，用薄层层析方 法检测反应液中无多乙酰紫杉烷时，反应完成，将整个溶液过滤， 滤液为富含多羟基紫杉垸的多羟基紫杉垸溶液；
(4) 多羟基紫杉烷的固相萃取步骤用盐酸将多羟基紫杉烷溶液的pH 值调至3.5 6,加入处理好的聚酰胺吸附树脂，搅拌3 5小时，用 薄层层析方法检验溶液中无多羟基紫杉垸时停止搅拌，过滤，将聚 酰胺吸附树脂装入玻璃层析柱中；
(5) 多羟基紫杉垸的洗脱步骤用pH值为2. 5 4. 5的拧檬酸水溶液洗 涤聚酰胺柱，脱除其中色素和生物碱类杂质；用2倍柱体积的体积 浓度为40%-60%的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分，回收其中的醇， 向残液中加入等体积的二氯甲垸，充分震荡后萃取，将有机溶剂层 分离，蒸干有机溶剂所得的固体物质即为含多羟基紫杉烷粗品；
(6) 紫杉醇的纯化步骤将步骤(2)得到的紫杉醇粗品，用中压反相 液相层析柱分离，再结晶获得纯度接近99. 5%紫杉醇深度分离品；
(7) 多羟基紫杉垸的纯化步骤将步骤(5)中得到的含多羟基紫杉烷 粗品，用中压反相液相层析柱分离，再结晶获得纯度大于98%多羟 基紫杉烷深度分离品。
所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于
所述树脂柱分离步骤中，所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂为非极
性大孔苯乙烯吸附树脂；所述萃取溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯中 的一种。
所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于 所述氧化铝层析柱分离步骤中，所述氧化铝柱填料为层析用氧化铝
填料，粒径为100目，湿法填装成高径比为15: 1 20: 1的层析柱，用体积比二氯甲烷甲醇=97: 3 99: 1的洗脱液洗脱2个柱体积，用体积 比二氯甲烷甲醇=95: 5 90: 10的洗脱液洗脱2个柱体积，层析柱压 力为5 20bar，流速为1 5ml/min，用高效液相色谱方法测定洗脱液的 浓度。
所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征在于 所述水解反应步骤中，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈、甲醇中的 一种；加入的碱性溶液为质量百分比10% 20%碳酸钾水溶液、10% 20% 碳酸钠水溶液或者氢氧化钙悬液中的一种；搅拌速率为120 r/min 60 r/min。
所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征在于 所述多羟基紫杉垸的固相萃取步骤中，所述的聚酰胺树脂是粒径为 30 60目的层析用聚酰胺树脂填料粉末，湿法填装到直径为0. 6cm 1. 5 cm的玻璃柱，填料的禽度与柱直径的比为10: 1 20: 1;每克干树脂上 样量为10 mg 50 mg，洗脱流速为2 BV.h-'。
所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于 所述紫杉醇的纯化步骤中，
所述中压反相液相层析柱分离的过程为将紫杉醇粗品用甲醇溶解， 上C18反相填料，在20 40bar压力范围，用体积比甲醇水为4: 1洗 脱，收集正组分，于3(TC 5(TC减压蒸馏至干；
所述结晶过程为对反相层析蒸干的正组分，再加入体积浓度为
80% 95%的甲醇正己烷溶液，3(TC 40'C下充分溶解，趁热过滤，将滤 液放置到0。C 6。C冷冻结晶，晶体即为纯度接近99. 5%的紫杉醇精品；
所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征在于-所述多羟基紫杉烷的纯化步骤中，
所述中压反相液相层析柱分离的过程为将多羟基紫杉垸粗品用甲 醇溶解，上C18反相填料，在20 40 bar压力范围，用体积比甲醇水 =3: 2洗脱，收集正组分，于30'C 5(TC减压蒸馏至干；
所述结晶过程为对反相层析蒸干的正组分，再加入体积浓度为
70% 90%的甲醇乙酸乙酯溶液，3(TC 4(TC下充分溶解，趁热过滤，将 滤液放置到0'C 6。C冷冻结晶，晶体即为纯度大于98%的多羟基紫杉烷 深度分离品。
经申请人用高效液相色谱方法(HPLC)和液一质联用(LC-MS)分 析，发现多乙酰紫杉烷化合物巴卡亭VI (bacctin VI)的含量占中国红 豆杉枝叶干重的0.2%，比taxol 0.007%高出2个数量级；采用现有细胞 培养方法，云南宁(taxuyunnanine C)在中国红豆杉细胞培养体系产量 可达400 mg/L，而紫杉醇(taxol)的平均产量仅有20 mg/L;本发明将 这些高丰度的多乙酰紫杉烷选择性的转化为相应的多羟基紫杉垸，生产 可被制药工业利用的原料，显著降低原料的成本、提高生物资源的利用 度。所述多羟基紫杉烷是指具有四去乙酰巴卡亭VI (7， 9， 10， 13 — deacetyl—bacctin VI)或者四去乙酰云南宁(2， 5， 10， 14一deacetyl —taxuyunnanine C)结构骨架特征之一、在C7、 C9、 CIO、 C13、 C14、 C5这些任意3个或以上位点具有羟基取代的紫杉二萜类物质。对多乙酰 紫杉烷化合物巴卡亭VI进行选择性乙酰水解，就是去掉其C7、 C9、 CIO、 C13位的乙酰基，使之成为相应构型的多羟基紫杉烷化合物四去乙酰巴卡 亭VI，但保留C4位上的乙酰基和C2位的苯甲酰基，生成的多羟基紫杉
烷化合物四去乙酰巴卡亭vi,可方便的再修饰成为io—去乙酰巴卡亭ni
(将C9位上羟基脱氢，变为羰基)；同样，对云南宁进行选择性乙酰水
解，将其C2、 C5、 CIO、 C14位上的乙酰基转化成化合物四去乙酰云南宁 (2， 5， 10， 14一deacety1 —taxuyun醒ine C)，将縮短14—P —羟基 去乙酰巴卡亭(ortataxel)的合成路线。
本发明所具有的优越性为
(1) 利用本发明的水解反应步骤，转化多乙酰紫杉烷为多羟基紫杉垸， 显著降低原料中紫杉垸类化合物的流失，扩大了紫杉垸原料的来源。如 果按生成每摩尔紫杉醇(或者第二代、三代紫杉醇)需要1摩尔生物合 成来源的紫杉烷化合物进行推算，利用本发明可以获得更多可被制药工 业利用的紫杉垸，相当于比现有工艺增加了 13——20倍的紫杉醇原料来 源，资源利用度显著增加。
(2) 利用本发明所述技术制备的多羟基紫杉垸可作为制药有用的原 料，因为多羟基紫杉烷母核上的羟基相当于在母核上引入多个"铆钉"， 利用在这些"铆钉"良好的反应性和结合能力，可以更容易、更方便的 在相应的位点上进行后续的基团保护、取代基消除、或者酰化等修饰。 特别是利用本发明制备的四去乙酰巴卡亭VI和本来就具有C14取代的四 去乙酰云南宁出发，比从巴卡亭III出发到第三代紫杉醇类药物14一 0 一羟基去乙酰巴卡亭，合成路线更短，技术上更容易实现。
(3) 利用本发明，不仅可以将红豆杉植物组织或细胞培养为浸膏中的 高丰度多乙酰化紫杉垸选择性转化为相应的多羟基紫杉烷，还可以将浸 膏中存在的紫杉醇进行分离和纯化，紫杉醇的收率与现有技术持平或略 高，实现了紫杉醇与多羟基紫杉垸同步生产。
图l为紫杉醇(taxol)分子结构； 图2为泰索帝(taxotere)分子结构；
图3为14—e—羟基去乙酰巴卡亭(ortataxel)分子结构； 图4为10 —去乙酰巴卡亭III (10-deacetyl-bacctin III)分子 结构；
图5为巴卡亭I11 ( bacctin III)分子结构； 图6为巴卡亭VI (bacctin VI)分子结构； 图7为云南宁(taxuyunnanine C)分子结构；
图8为四去乙酰巴卡亭VI (7， 9， 10, 13—deacetyl—bacctin VI) 分子结构；
图9为四去乙酰云南宁(2， 5, 10， 14—deacetyl —t訓yun腿ine C)分子结构；
图IO为巴卡亭VI (bacctin VI)选择性乙酰水解生成四去乙酰巴卡 亭VI (7， 9， 10， 13 —deacetyl—bacctin VI)的反应式；
图11为云南宁(taxuyunnanine C)选择性乙酰水解生成四去乙酰 云南宁(2, 5， 10， 14—deacetyl —taxuyurmanine C)的反应式。
具体实施例方式
实施例1从中国红豆杉枝叶浸膏中同步制备紫杉醇和多羟基紫杉垸
(1) 树脂柱分离步骤取中国红豆杉枝叶甲醇提取浓縮后的浸膏10g，
经HPLC分析含紫杉醇0. 2 % (20mg)、含巴卡亭VI约为5. 7% (570mg )， 用甲醇溶解，加载到非极性大孔苯乙烯吸附树脂XAD16的树脂柱上，用 含甲醇30%的水溶液冲洗，洗去水溶性杂质或色素；再用3倍柱体积含甲 醇50%的水溶液洗脱，收集该洗脱液，将其中甲醇蒸干，加入等体积的乙 酸乙酯作为萃取溶剂进行液-液萃取，收集乙酸乙酯层，蒸干，得到1.45g 大孔树脂柱分离粗品，经HPLC分析含紫杉醇1. 3 % (18.8mg)、含巴卡 亭VI约为39y。
(565mg );紫杉醇收率为94%;巴卡亭VI收率，99%。
(2) 氧化铝层析柱分离步骤取粒径为100目的层析用氧化铝填料，用
湿法填装成高径比为16: 1的层析柱，将上述1.45g大孔树脂柱分离粗
品用体积比1: 99的甲醇与二氯甲垸混合液溶解，上样于氧化铝柱上，
大孔树脂柱分离粗品与氧化铝的质量比为1/100;先用二氯甲烷甲醇体 积比为97: 3的洗脱液洗脱2个柱体积，获得富紫杉醇的流分340 ml; 再用二氯甲烷甲醇体积比为95: 5的洗脱液洗脱，获得富含多乙酰紫杉 垸的流分340 ml;层析柱压力为5bar，流速为lml/min，分别减压蒸干 上述收集的2部分流分，用薄层层析结合高效液相色谱方法检测，获得 含紫杉醇59. 3%的粗品32mg;含巴卡亭V18(m的粗品706mg;
(3) 水解反应步骤向上述706mg含巴卡亭VI的粗品中添加甲醇20ml， 质量比2096的碳酸钾水溶液37ml，甲醇约占溶液总体积的30%， pH为10， 120 r/min转速搅拌反应，约1小时后，用TLC方法检测指示反应液中 无巴卡亭VI，随结束反应，将整个溶液过滤，滤液为富含四去乙酰巴卡 亭VI的溶液；
(4) 多羟基紫杉垸的固相萃取步骤用盐酸将上述多羟基紫杉烷溶液的 pH值调至5，加入处理好的粒径为30 60目的层析用聚酰胺树脂填料粉 末，搅拌3小时，用薄层层析方法检验溶液中无四去乙酰巴卡亭VI时停 止搅拌，过滤，将聚酰胺吸附树脂装入直径为0.6cm玻璃层析柱中，填 料的高度与柱直径的比为20: 1;每克干树脂载样量为10 mg,洗脱流速 为2 BV. h-、
(5) 多羟基紫杉垸的洗脱步骤用pH为3. 5的柠檬酸水溶液洗涤聚酰 胺柱，脱除其中色素和生物碱类杂质，用2倍柱体积(34ml)的体积浓 度为60%的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分，回收其中甲醇，向残液中加 入等体积的二氯甲垸，充分震荡后萃取，将二氯甲垸层分离，蒸干有机 溶剂，得到300 mg的固体物质，经HPLC分析四去乙酰巴卡亭VI的含量 为82%，转化率为60%、分离收率为95%;
(6) 紫杉醇的纯化步骤将上述获得的32mg 59.3% (HPLC分析)紫杉
醇的粗品用0. 5ml甲醇溶解，在压力为20 bar下，用C18制备型中压反 相液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为4: l的流动相洗脱，收集正 组分，于3(TC减压蒸馏至干，加入体积百分比为80%的甲醇正己烷溶液 2ml，3(TC下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到(rC冷冻结晶，获得15. 8mg 晶体纯度为99.5%紫杉醇精品；紫杉醇总收率79%; (7)多羟基紫杉烷的纯化步骤将上述获得的300 mg 82%的四去乙酰 巴卡亭VI粗品用lml甲醇溶解，在压力为40 bar下，用C18制备型中 压反相液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为3: 2的流动相洗脱，收 集正组分，于3(TC减压蒸馏至干，加入体积百分比为为80%的甲醇乙酸 乙酯4ml， 4(TC下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到Ot:冷冻结晶，获 得192 mg的98%晶体四去乙酰巴卡亭VI ，紫杉烷资源利用度为19 (倍)。
实施例2从中国红豆杉细胞培养物浸膏中同步制备紫杉醇和多羟基紫杉 院
(1) 树脂柱分离步骤取中国红豆杉细胞甲醇提取浓縮后的浸膏5g， 经HPLC分析含紫杉醇1% (50mg)、含云南宁约为16% (800mg)。用 甲醇溶解，加载到非极性大孔苯乙烯吸附树脂XAD1180的树脂柱上，用 甲醇含20%的水溶液冲洗，洗去水溶性杂质或色素；再用3倍柱体积含甲 醇80%的水溶液洗脱，收集该洗脱液，将其中甲醇蒸干，加入等体积的氯 仿进行液-液萃取，收集氯仿层，蒸干，得到2.65g大孔树脂柱分离粗品， 经HPLC分析含紫杉醇1. 8 % (47mg)、含云南宁约为30% (795 mg); 紫杉醇收率为94%;云南宁收率，99%。
(2) 氧化铝层析柱分离步骤取粒径为100目的层析用氧化铝填料，用 湿法填装成髙径比为20: 1的层析柱，将上述2. 65g大孔树脂柱分离粗 品体积比1: 99的甲醇与二氯甲烷混合液溶解，上样于氧化铝柱上，大 孔树脂柱分离粗品与氧化铝的质量比为1/60 ;先用二氯甲烷甲醇体积
比为99: 1的洗脱液洗脱2个柱体积，获得富紫杉醇的流分；再用二氯 甲烷甲醇体积比为96:4的洗脱液洗脱，获得富含多乙酰紫杉烷的流分； 层析柱压力为20 bar,流速为5ml/min,分别减压蒸干上述收集的2部 分流分，用薄层层析结合高效液相色谱方法检测，获得含紫杉醇60%的粗 品78 mg;含云南宁83%的粗品910 mg;
(3) 水解反应步骤向上述910 mg含云南宁的粗品中添加丙酮25 ml， 质量比10%碳酸钠水溶液25 ml,丙酮约占溶液总体积的50%， pH为9， 60 r/min转速搅拌反应，约0. 5小时后，用TLC方法检测指示反应液中 无巴卡亭VI，随结束反应，将整个溶液过滤，滤液为富含四去乙酰巴卡 亭VI的溶液；
(4) 多羟基紫杉烷的固相萃取步骤用盐酸将上述多羟基紫杉烷溶液的 pH值调至3. 5，加入处理好的粒径为30 60目的层析用聚酰胺树脂填 料粉末，搅拌5小时，用薄层层析方法检验溶液中无四去乙酰云南宁时 停止搅拌，过滤，将聚酰胺吸附树脂装入直径为1.5cm玻璃层析柱中， 填料的高度与柱直径的比为10: 1;每克干树脂上样量为30 mg,洗脱流 速为2 BV. h—、
(5) 多羟基紫杉烷的洗脱步骤用pH为4. 5的柠檬酸水溶液洗涤聚酰 胺柱，脱除其中色素和生物碱类杂质，用2倍柱体积、体积浓度为50% 的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分，回收其中甲醇，再向残液中加入等 体积的二氯甲烷，充分震荡后萃取，将二氯甲烷层分离，蒸干有机溶剂， 得到299mg的固体物质，经HPLC分析四去乙酰云南宁的含量为8(m，转 化率为50%，分离收率为95%;
(6) 紫杉醇的纯化步骤将上述获得的78 mg 60% (HPLC分析)紫杉醇 的粗品用0. 5ml甲醇溶解，在压力为40 bar下，用C18制备型中压反相 液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为4: l的流动相洗脱，收集正组 分，于50'C减压蒸馏至干，加入体积百分比为为95%的甲醇正己烷溶液
2ml， 4(TC下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到6°C冷冻结晶，获得 37 mg晶体纯度为99. 5%紫杉醇精品；
(7)多羟基紫杉垸的纯化步骤将上述获得的299 mg 80 %四去乙酰云 南宁粗品用1. 5 ml甲醇溶解，在压力为40 bar下，用C18制备型中压 反相液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为3: 2的流动相洗脱，收 集正组分，于50。C减压蒸馏至干，加入体积百分比为为90%的甲醇乙酸 乙酯4ml， 30°C下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到4-C冷冻结晶， 获得233.4 mg 98%的晶体四去乙酰云南宁。
实施例3从南方红豆杉枝叶浸膏中同步制备紫杉醇和多羟基紫杉垸
(1) 树脂柱分离步骤取南方红豆杉枝叶甲醇提取浓縮后的浸膏l Kg， 经HPLC分析含紫杉醇0. 18 % (1.8g)、含巴卡亭VI (BVI)约为5.5%
(55g )。用甲醇溶解，加载到非极性大孔苯乙烯吸附树脂XAD16的树 脂柱上，用含甲醇40%的水溶液冲洗，洗去水溶性杂质或色素；再用3倍 柱体积含甲醇70%的水溶液洗脱，收集该洗脱液，将其中甲醇蒸干，加入 等体积的二氯甲烷作为萃取溶剂进行液-液萃取，收集二氯甲烷层，蒸干， 得到1. 43g大孔树脂柱分离粗品，经HPLC分析含紫杉醇1. 2 % (1. 717)、 含巴卡亭VI约为4(m (53.9g );紫杉醇收率为95%;巴卡亭VI收率， 98%。
(2) 氧化铝层析柱分离步骤取粒径为100目的层析用氧化铝填料，用
湿法填装成高径比为15: l的层析柱，将上述143g大孔树脂柱分离粗品 用体积比2: 98的甲醇与二氯甲烷混合液溶解，上样于氧化铝柱上，大 孔树脂柱分离粗品与氧化铝的质量比为1/80;先用二氯甲垸甲醇体积 比为98: 2的洗脱液洗脱2个柱体积，获得富紫杉醇的流分；再用二氯 甲垸甲醇体积比为90: 10的洗脱液洗脱，获得富含多乙酰紫杉烷的流 分；层析柱压力为15bar，流速为3ml/min，分别减压蒸干上述收集的2
部分流分，用薄层层析结合高效液相色谱方法检测，获得含紫杉醇49.5% 的粗品3.399 g;含巴卡亭VI82。/。的粗品62.445 g;
(3) 水解反应步骤向上述62. 445 g含巴卡亭VI的粗品中添加乙腈 300 ml,氢氧化钙悬液200 ml，乙腈约占溶液总体积的60%, pH为ll， 100 r/min转速搅拌反应，约45 min后，用TLC方法检测指示反应液 中无巴卡亭VI，随结束反应，将整个溶液过滤，滤液为富含四去乙酰巴 卡亭VI的溶液；
(4) 多羟基紫杉垸的固相萃取步骤用盐酸将上述多羟基紫杉垸溶液的 pH值调至6，加入处理好的粒径为30 60目的层析用聚酰胺树脂填料 粉末，搅拌4小时，用薄层层析方法检验溶液中无四去乙酰巴卡亭VI时 停止搅拌，过滤，将聚酰胺吸附树脂装入直径为1.4 cm玻璃层析柱中， 填料的高度与柱直径的比为15: 1;每克干树脂载样量为50 mg ，洗脱流 速为2 BV.h—、
(5) 多羟基紫杉烷的洗脱步骤用pH为2. 5的柠檬酸水溶液洗涤聚酰 胺柱，脱除其中色素和生物碱类杂质，用2倍柱体积的体积浓度为40%的 甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分，回收其中甲醇，向残液中加入等体积 的二氯甲烷，充分震荡后萃取，将二氯甲烷层分离，蒸干有机溶剂，得 到26. 41g的固体物质，经HPLC分析四去乙酰巴卡亭VI的含量为85%， 转化率为58.5 %、分离收率为98%;
(6) 紫杉醇的纯化步骤将上述获得的3.399 g (HPLC分析含紫杉醇 49.5%)紫杉醇的粗品用甲醇溶解，在压力为30 bar下，用C18制备型 中压反相液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为4: l的流动相洗脱， 收集正组分，于4(TC减压蒸馏至干，加入体积百分比为为90%的甲醇正 己垸溶液100 ml， 35°C下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到4°C冷 冻结晶，获得1. 353 g晶体纯度为99. 5%紫杉醇精品；
(7) 多羟基紫杉垸的纯化步骤将上述获得的26. 41g 85%的四去乙酰
巴卡亭VI粗品用甲醇溶解，在压力为20 bar下，用C18制备型中压反 相液相层析柱分离，用甲醇与水的体积比为3: 2的流动相洗脱，收集 正组分，于4(TC减压蒸馏至干，加入体积百分比为为70%的甲醇乙酸乙 酯4ml， 40°C下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到6t:冷冻结晶，获 得20.653 g98y。的晶体四去乙酰巴卡亭VI ，紫杉烷资源利用度为20(倍)。
多羟基紫杉烷的分析方法HPLC/MS和丽R结构确认，用HPLC定 量，用TLC方法粗略分析。
转化率的计算(实际产量/理论产量)X100%; 紫杉烷资源利用度的计算 紫杉烷资源利用度=(AXB) / (CXD);
其中，A为步骤(7)中四去乙酰巴卡亭VI (或四去乙酰云南宁) 实际产量；B为紫杉醇相对分子质量853; C为步骤(6)中紫杉醇实际产 量；D为四去乙酰巴卡亭VI (或四去乙酰云南宁)相对分子质量。
权利要求
1. 一种制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，包括(1)树脂柱分离步骤将红豆杉植物组织或细胞培养物的甲醇或乙醇浸膏加载到大孔树脂柱上，用含甲醇20％～40％的水溶液冲洗，除去水溶性杂质或色素，再用含甲醇50％～80％的水溶液冲洗，收集3倍柱体积的洗脱液，将洗脱液中的甲醇蒸干，加入等体积的与水互不相溶的萃取溶剂进行液-液萃取，收集有机溶剂层，蒸干，得到大孔树脂柱分离粗品，所述百分比均为体积百分比；(2)氧化铝层析柱分离步骤用甲醇与二氯甲烷混合液溶解大孔树脂柱分离粗品，上样于氧化铝柱上，大孔树脂柱分离粗品与氧化铝的质量比为1/60～1/100，进行中低压正相层析，用甲醇与二氯甲烷混合液洗脱，薄层层析结合高效液相色谱方法检测流分，获得富含多乙酰紫杉烷的流分，以及富含紫杉醇的流分，减压蒸干溶剂，获得含多乙酰紫杉烷粗品以及紫杉醇粗品；(3)水解反应步骤向含多乙酰紫杉烷粗品中添加极性有机溶剂，再加入碱性溶液或者悬液，使整个溶液pH值为9～11，极性有机溶剂占整个溶液体积的30％～60％，搅拌反应0.5～1小时，用薄层层析方法检测反应液中无多乙酰紫杉烷时，反应完成，将整个溶液过滤，滤液为富含多羟基紫杉烷的多羟基紫杉烷溶液；(4)多羟基紫杉烷的固相萃取步骤用盐酸将多羟基紫杉烷溶液的pH值调至3.5～6，加入处理好的聚酰胺吸附树脂，搅拌3～5小时，用薄层层析方法检验溶液中无多羟基紫杉烷时停止搅拌，过滤，将聚酰胺吸附树脂装入玻璃层析柱中；(5)多羟基紫杉烷的洗脱步骤用pH值为2.5～4.5的柠檬酸水溶液洗涤聚酰胺柱，脱除其中色素和生物碱类杂质；用2倍柱体积的体积浓度为40％-60％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分，回收其中的醇，向残液中加入等体积的二氯甲烷，充分震荡后萃取，将有机溶剂层分离，蒸干有机溶剂所得的固体物质即为含多羟基紫杉烷粗品；(6)紫杉醇的纯化步骤将步骤(2)得到的紫杉醇粗品，用中压反相液相层析柱分离，再结晶获得纯度接近99.5％紫杉醇深度分离品；(7)多羟基紫杉烷的纯化步骤将步骤(5)中得到的含多羟基紫杉烷粗品，用中压反相液相层析柱分离，再结晶获得纯度大于98％多羟基紫杉烷深度分离品。
2. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述树脂柱分离步骤中，所述大孔树脂柱中填充的大孔树脂为非极 性大孔苯乙烯吸附树脂；所述萃取溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种。
3. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述氧化铝层析柱分离步骤中，所述氧化铝柱填料为层析用氧化铝 填料，粒径为100目，湿法填装成高径比为15: 1 20: 1的层析柱，用 体积比二氯甲烷甲醇=97: 3 99: 1的洗脱液洗脱2个柱体积，用体积 比二氯甲烷甲醇=95: 5 90: 10的洗脱液洗脱2个柱体积，层析柱压 力为5 20bar，流速为1 5ml/min，用高效液相色谱方法测定洗脱液的 浓度。
4. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征 在于 所述水解反应步骤中，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈、甲醇中的一种；加入的碱性溶液为质量百分比10% 20%碳酸钾水溶液、碳酸钠水 溶液或者氢氧化钙悬液中的一种；搅拌速率为120 r/min 60 r/min。
5. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述多羟基紫杉烷的固相萃取步骤中，所述的聚酰胺树脂是粒径为 30 60目的层析用聚酰胺树脂填料粉末，湿法填装到直径为0.6cm 1.5 cm的玻璃柱，填料的高度与柱直径的比为10: 1 20: 1;每克干树脂上 样量为10 mg 50 mg，洗脱流速为2 BV. h、
6. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉垸及紫杉醇的方法，其特征 在于-所述紫杉醇的纯化步骤中，所述中压反相液相层析柱分离的过程为将紫杉醇粗品用甲醇溶解， 上C18反相填料，在20 40bar压力范围，用体积比甲醇水为4: 1洗 脱，收集正组分，于3(TC 50。C减压蒸馏至干；所述结晶过程为对反相层析蒸干的正组分，再加入体积浓度为80% 95%的甲醇正己垸溶液，3(TC 40。C下充分溶解，趁热过滤，将滤 液放置到0。C 6。C冷冻结晶，晶体即为纯度接近99. 5%的紫杉醇精品。
7. 如权利要求1所述的制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，其特征 在于所述多羟基紫杉垸的纯化步骤中，所述中压反相液相层析柱分离的过程为将多羟基紫杉烷粗品用甲 醇溶解，上C18反相填料，在20 40 bar压力范围，'用体积比甲醇水 二 3: 2洗脱，收集正组分，于3(TC 50'C减压蒸馏至干；所述结晶过程为对反相层析蒸干的正组分，再加入体积浓度为70% 90%的甲醇乙酸乙酯溶液，30'C 4(TC下充分溶解，趁热过滤，将 滤液放置到ox: 6-c冷冻结晶，晶体即为纯度大于98%的多羟基紫杉垸 深度分离品。
全文摘要
一种制备多羟基紫杉烷及紫杉醇的方法，属于天然药物化学物质或药品原料的制造方法，针对紫杉醇的来源紧张问题，从红豆杉植物材料或者细胞培养物的醇性浸膏中分离紫杉醇的同时，将其中高丰度的多乙酰紫杉烷，选择性地转化为相应的多羟基紫杉烷。本发明包括树脂柱分离步骤、氧化铝层析柱分离步骤、水解反应步骤、多羟基紫杉烷的固相萃取步骤、多羟基紫杉烷的洗脱步骤、紫杉醇的纯化步骤以及多羟基紫杉烷的纯化步骤，获得纯度接近99.5％紫杉醇和纯度大于98％的多羟基紫杉烷。本发明将高丰度的多乙酰紫杉烷选择性的转化为相应的多羟基紫杉烷，生产可被制药工业利用的原料，显著降低原料中紫杉烷类化合物的流失、提高生物资源的利用度。
文档编号A61P35/00GK101391989SQ20081019682
公开日2009年3月25日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者余龙江, 浩 刘, 敖明章, 硕 李, 赵春芳, 鲁明波 申请人:华中科技大学