专利名称：：一种具有抗菌、抗肿瘤活性的新化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型内酰胺类化合物及其制备方法与应用，更具体地说是利用微生物发酵法生产一种新型内酰胺类化合物及其应用，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：1928年Fleming发现青霉素，1945年Waksman发现链霉素，相继获得诺贝尔奖，从而推动了抗生素研究在全世界的兴起。20世纪50和60年代是抗生素研发的黄金期。这段时期，从放线菌中发现了大量的抗生素，并投入生产，医治了大量的临床传染病。同时开始出现一些抗肿瘤、抗病毒和其他非抗生素物质。这些活性物质有70%80%是由放线菌产生的，显示了放线菌作为药物产生者的巨大价值。目前从微生物中发现的大约22500种生物活性物质，有近53%是放线菌产生的，其中链霉菌属就产生8366种，占全部抗生素的51%，是任何一属微生物无法相比的；土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌和抗肿瘤活性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。本课题组通过对采自海南岛鹦哥岭原始森林的土壤样品进行研究，发现菌株&M声OA^CM"o"r^'Da07210能够产生一种新型内酰胺类化合物，该化合物对香蕉镰刀菌古巴专化型4号小禾中(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4，FOC4)、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠肉瘤细胞S180的生长具有明显的抑制作用，且毒性较低，可用于抗真菌农药或抗癌药物原料，具有较好的应用前景。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种具有抗香蕉镰刀菌古巴专化型4号小种、抗肿瘤活性的新型内酰胺类化合物——210-A，其化学名为(6S,8aS,9S,llS，12aR)-6-羟基-9,10-二甲基十氢苯并[《氮杂癸间五烯-2,4,12(3//)-三酮，化学结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>本发明的第二个目的是提供菌株S&ej^om^^wow^e!'Da07210制备新化合物210-A的制备方法。本发明的第三个目的是提供210-A在制备抗真菌农药和抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一株生产上述内酰胺类化合物的菌株，分离自海南岛鹦哥岭原始森林土壤，命名为Da07210。该菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.2561，保藏日2008年6月27日，建议的名称为诺尔斯链霉菌5^e;7tow_yceyDa07210。一种制备上述内酰胺类化合物的方法，包括以下步骤(1)Sjrre/^omyceymwwe/Da07210的禾中子培养种子培养基葡萄糖5-15g，可溶性淀粉2-20g，大豆粉5-15g，酵母膏0-20g，磷酸二氢钾0-lg，氯化钠0-20g，蒸馏水1000ml;培养条件为pH6.57.5，培养温度2532。C,培养时间2472小时；(2)5if丰o附戸j画腦.Da07210的发酵培养发酵培养基葡萄糖0-20g,甘油0-20g，黄豆饼粉5-20g，硫酸铵0-10g，磷酸氢二钾0-lg，氯化钠0-20g,蒸馏水1000ml。发酵条件为pH6.57.5，发酵温度2532。C，发酵时间96168小时，接种量5%10%;(3)分离总提取物将步骤(2)得到的发酵液离心，取上清液，经氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓縮得棕色膏状物质；(4)纯化提取物用甲醇溶解上述步骤(3)得到的膏状物，利用正相硅胶柱色谱(干法上样)进行初步分离纯化；洗脱剂为环己烷丙酮，逐渐增加丙酮的量，最后用甲醇洗脱，500ml为一个流份，减压回收溶剂得到相应的组分；通过薄层色谱检视并合并相同组分；通过生物活性检测发现有抗FOC4的活性组分；将该组分用制备薄层色谱进行纯化，展开剂为环己烷氯仿丙酮=2:2:1，得到活性部位；将该活性部位用SephadexLH-20进行纯化，甲醇洗脱，得到新型内酰胺类化合物。本发明的优点是本发明提供的新型内酰胺类化合物，对香蕉镰刀菌古巴专化型4号小种(FOC4)、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠肉瘤细胞S180的生长具有明显的抑制作用，且毒性较低，可用于抗真菌生物农药或抗癌药物原料，具有较好的应用前景；本发明提供的制备化合物的方法为生物发酵法，步骤简单、成本较低、有利于产业化推广实施。下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，本发明的实施方式并不限于此，凡是根据本发明公开的内容或者原理，实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为化合物210-A的HR-ESI-MS图谱。图2为化合物210-A的ESI-MS图谱。图3为化合物210-A的'H-NMR图谱。图4为化合物210-A的I3C-NMR图谱。图5为化合物210-A的DEPT135。图谱。图6为化合物210-A的HMBC图谱。图7为化合物210-A的HSQC图谱。图8为化合物210-A的iH」HCOSY图谱。图9为化合物210-A的NOESY图谱。具体实施例方式实施例1:新化合物210-A的制备一.5^e;^ow少ce51wow^se/Da07210的种子培养种子培养基葡萄糖10g,可溶性淀粉10g，大豆粉10g，酵母膏10g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。培养条件为pH7.2,培养温度28'C，培养时间48小时。二.S鄉,om戸s騰冊'Da07210的发酵培养发酵培养基葡萄糖10g，甘油10g，黄豆饼粉15g，硫酸铵5g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。发酵条件为接种量5%10%，pH7.0，发酵温度28'C，发酵时间144小时。三.分离总提取物将上述发酵液8000r/min离心10min，取上清液，经乙酸乙酯萃取三次，减压浓縮得棕色膏状物质。四.纯化提取物■用适量甲醇和氯仿的混合溶液溶解提取物，将上清液加入到适量的100-200目硅胶5中拌样，待溶剂完全挥发后，干法上样；先用环己烷进行洗脱，然后逐渐增加丙酮的比例，直到用纯丙酮进行洗脱，最后用甲醇进行洗脱。每个流份的体积是500ml，减压回收溶剂，得到30个组分；用薄层色谱进行检视，展开剂为环己烷丙酮=3:2，合并相同的组分，得到22个组分；用纸片检测法检测各组分抗F0C4的活性，发现组分17有明显的活性；将组分17用制备薄层色谱进行纯化，洗脱剂为环己烷氯仿丙酮=2:2:1，紫外灯254nm下呈一条暗斑，将暗斑刮下，氯仿浸泡，回收氯仿得到活性部位210-17;将该活性部位用SephadexLH-20进行纯化，甲醇洗脱，得到新型内酰胺类化合物210-17-2。五.结构鉴定新化合物为无色油状物，溶于氯仿、丙酮、甲醇；将该化合物点于薄层色谱上，喷改良碘化铋钾显橙红色，提示为含氮类化合物；ESI-MSm/z282[M+H]+,304[M+Na]+，585[2M+Na]+;HR-ESI-MSm/z282.1691[M+H〗+(calcdforC15H24N04,282.1705),304.1527[M+Na]+(calcdforC15H23N04Na，304.1524)提示分子量为281，分子式为C15H23N04;[oi]d23-14.55(c0.0187,CHCL3),UV^axnm:214，IRbands(KBr，Vmaxcm"):3433、2927、1693、1631、1381、1264;根据'H-NMR、13C-NMR和DEPT135。推出该化合物的不饱和度为5，含有l个酮羰基、2个与氮相连的羰基、2个甲基、5个亚甲基、5个次甲基、l个羟基和2个环，由于2个与氨基相连的羰基化学位移很接近，所以它们所处的化学环境基本一致。根据^-NMR数据(具体数据见表l)，该结构含有两个分别与次甲基相连的甲基、一个与氧相连的次甲基和一个氨基上的活泼氢，分别为S0.95(d，《/=6.4Hz)、1.20(d，《/=7.2Hz)、4.2(dd，声8.4Hz，2.6Hz)和8.7(S);再根据HSQC、HMBC、'H-'HCOSY和NOESY最终确定新化合物为(6S，8aS，9S，llS，12aR)-6-羟基-9，10-二甲基十氢苯并问氮杂癸间五烯-2，4，12(3/^)-三酮；英文名:(6S，8aS,9S,11S，12aR)-6隱hydroxy-9，10-dimethyldecahydrobenzoWazecine-2，4，12(3^)-trione结构如下200910009796.6说明书第5/5页化合物210-A的]H和13C核磁共振数据见表1。表1化合物210-A的NMR(400MHz)禾B13CNMR(100MHz)数据(CDCL3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:抗香蕉镰刀菌古巴专化型4号小种(FOC4)活性试验将此化合物用适量的甲醇溶解,配置成浓度为0.87mg/ml、0.087mg/ml、0.0087mg/ml、0.00087mg/ml的溶液。采用纸片扩散法，加样量l(HiL，培养24h后测量抑菌圈直径，抑菌圈直径分另U为15mm、llmm、10mm、9mm0实施例3:抗肿瘤活性试验将该化合物用少量的DMSO溶解，并加入细胞培养基将其稀释10、50、100、500、1000倍，通过MTT法检测不同浓度的溶液对人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠肉瘤细胞S18()的抑制活性。细胞株均购自中国科学院上海生化与细胞研究所。该新化合物对人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠肉瘤细胞S^均有很强的抑制作用，IC50分别为0.77pg/ml和0.74pg/ml。权利要求1.一种新的内酰胺类化合物，其特征在于外观呈无色油状物，分子式为C15H24NO4，化学名为(6S，8aS，9S，11S，12aR)-6-羟基-9，10-二甲基十氢苯并[d]氮杂癸间五烯-2，4，12(3H)-三酮，其化学结构式如下2.—种制备权利要求l所述的内酰胺类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤(1)S鄉飾拜s腦面'Da07210的种子培养种子培养基葡萄糖515g，可溶性淀粉210g,大豆粉515g，磷酸二氢钾0lg，蒸馏水1000ml;培养条件为pH6.57.5，培养温度2532。C，培养时间2472小时；(2)5!Tr印to附^CM"owrse/Da07210的发酵培养发酵培养基葡萄糖1.0%，甘油1.0%，黄豆饼粉1.5%，硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾0.05%。发酵条件为pH6.57.5，发酵温度2532'C，发酵时间96168小时，接种量5%10%;(3)分离总提取物将步骤(2)得到的发酵液离心，取上清液，经氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓縮得棕色浸膏；(4)纯化提取物用甲醇溶解上述步骤(3)得到的膏状物，利用正相硅胶柱色谱(干法上样)进行初步分离纯化；洗脱剂为环己垸丙酮，逐渐增加丙酮的量，最后用甲醇洗脱，500ml为一个流份，减压回收溶剂得到相应的组分；通过薄层色谱检视并合并相同组分；通过生物活性检测发现具有抗香蕉镰刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)的活性组分，将该组分用制备薄层色谱进行纯化，展开剂为环己垸氯仿丙酮=2:2:1，得到活性部位；然后将该活性部位用SephadexLH-20进行纯化，甲醇洗脱，得到新型内酰胺类化合物。3.权利要求1所述的新化合物在制备抗香蕉镰刀菌等真菌农药中的用途。4.权利要求1所述的新化合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。全文摘要一种具有抗菌、抗肿瘤活性的新化合物。本发明公开了一种新型内酰胺类化合物及其制备方法与应用，更具体地说是利用微生物发酵生产新型内酰胺类化合物及其应用，属于生物
技术领域：
。一种内酰胺类化合物，化学名为(6S，8aS，9S，11S，12aR)-6-羟基-9，10-二甲基十氢苯并[d]氮杂癸间五烯-2，4，12(3H)-三酮。本发明的优点是提供了一种新型内酰胺类化合物，经实验证明，对香蕉镰刀菌古巴专化型4号小种(FOC4)、人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠肉瘤细胞S180的生长具有明显的抑制作用，且毒性较低，可用于抗真菌农药或抗癌药物原料，具有较好的应用前景；本发明提供的制备化合物的方法为生物发酵法，步骤简单、成本较低、有利于产业化推广实施。文档编号A61P35/00GK101585809SQ20091000979公开日2009年11月25日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者吴晓鹏,孙前光,哲方,军朱,郑业辉,鲍时翔,黄惠琴申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所