专利名称：：仿刺参中三萜皂苷类抗真菌化合物HolotoxinD～I及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是从海洋动物仿刺参中分离到的新的三萜皂苷类抗真菌化合物HolotoxinD、E、F、G、H、I及其制备方法。
背景技术：
：仿刺参(J/wW/c/zopw57'";w"/cwSelenka)是一种广泛分布于我国山东、辽宁和河北、江苏北部沿海的海参纲动物，属刺参科仿刺参属动物。已从该种海参动物中分离得三萜皂苷类化合物HolotoxinA、A,、B、B、C(KitagawaI.,YamanakaH.，KobayashiM.,efa/.SaponinandSapogenol,XV.Antifungalglycosidefromtheseacucumber幼c/zo/7wsy"/纖'cwsSelenka.(2).StructuresofHolotoxinAandHolotoxinB.CTzewPZ/ar5w〃，1976，24(2):275;Kitagawl.a,YamanakaH.,KobayashiM,,"cr/.SaponinandSapogenol.XXVII.RevisedstructureofHolotoxinAandHolotoxinB，twoantifungaloliglycosidesfromtheseacucumber5Wc/7opwsj'apomcwsSelenka.C/jew￡w〃，1978，26(12):3722;MaltserI.I,StonikVA,KalinovskyAI，"a/.Triterpeneglycosidesfromseacucumber5Wc/o;^y'a;ow/c船5We"^.Cowp.说oc/ew.fw'o/.1984,78B(2):421),但未见有关从该种仿刺参中分离得到HolotoxinD~I及其抗真菌活性的报道。
发明内容本发明提供从生长于我国渤海海域的仿刺参中提取分离到的6种新的三萜垲苷类化合物，分别命名为HolotoxinD，HolotoxinE，HolotoxinF，HolotoxinG，HolotoxinH，HolotoxinI，它们的化学结构通式如下0^^>OH其中，基团R,为CH20H或Me112为OMe或OH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>Rj为OH或OH或HA为双键，分别位于7，8位或9，11位所说化合物的基团搭配分别如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1、HolotoxinD:为无色结晶性粉末，熔点209-211°C，分子式C66H1()4032。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+):/n/z1431[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS)w/z1407[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR谱数据见表1和表2。以15%的HC1水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinD的糖链由D-木糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖组成，比例为2:2:2。2、HolotoxinE:为无色结晶性粉末，熔点245-247。C，分子式C65H1Q2031。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+):m/z1401[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-):w/z1377[M-H]+。tfl-NMR和l3C-NMR谱数据见表3和表4。以15%的HC1水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinE的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖组成，比例为2:1:2:1。3、HolotoxinF:为无色结晶性粉末，熔点227-229。C，分子式C66H1Q6033。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-iH离子质谱(ESI-MS+):w/21449[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS》w/z1425[M-H]+。'H-NMR和l3C-NMR谱数据见表5和表6。以15%的HC1水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinF的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-(9-甲基D-葡萄糖组成，比例为2:1:1:2。4、HolotoxinG:为无色结晶性粉末，熔点197-199。C，分子式C65H1()2032。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+):w/z1417[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-):w/z1393[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR谱数据见表7和表8。以15%的HC1水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinG的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-0-甲基D-葡萄糖组成，比例为2:1:h2。5、HolotoxinH:为无色结晶性粉末，熔点164-166°C，分子式C58H94025。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+):w/z1213[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS》w/z1189[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR谱数据见表9和表10。以15%的HCI水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinH的糖链由D-木糖、D-喹诺糖和D-葡萄糖组成，比例为2:1:2。6、Holotoxinl:为无色结晶性粉未，熔点164-166°C，分子式C59H96025。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+):Wz1227[M+Na]+;电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-):w/z1203[M-H]+。'H-NMR和13C-NMR谱数据见表11和表12。以15%的HC1水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定HolotoxinI的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-0甲基D-葡萄糖组成，比例为2:1:1:1。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.HolotoxinD糖链部分的13C-NMR和^-NMR数据Position<5hmult.(■/inHz)HMBCXyl1124Glc212346Xyl31243-O-MeGlc4126OMeGlc51263-6>-MeGlc6126OMe105.483.276.877.764.1105.676.975.880.578.561.4105.173.887.869.366.7105.975.388.270.778.562.460.9103.073.388.169.978.562.2105.975.388.270.778.562.460.94.84d(7.2)4.20m4.26m4.33m3.94m，4.26m5.32d(7.0)3.93m4.24m4.46m3.99m4.53m，4.67m5.19d(7.3;)4.07m4.28m4.29m3.68m,4.22m5.34d(7.9)4.07m3.79m4.18m4.05m4.31m，4.55m3.94s5.18d(7.4)4.07m楊m4.16m4.02m4.31m,4.55m5.31dC7.7)4.07m3.79m4.18m4.05m4.31m，4.55m3.94sC-3(Aglycone)C-2(Xyl1)C-4(Glc勺C-3(Xyl,C-4(Xyl1)C-3(Gl)9据Position<5h(JinHz)HMBC136.21.51m,1.57m227.42.0m,2.18m389.23.35dd(3.8,11.9)4,30,31,439.8\548.6Ulm3,4,6,10.19.30623.52.09m7122.15.72m8144.2\947.33.79m1036.0\1122.71.66m,1.90m1229.92.14m,2.33m1356.91445.91552.22.55d(15.8),2.74d(15.8)13,14,16，17，3216213.1\1763.82.90,s12,13,16,18,20,2118178.81924.31.34s1,5，9，102083.5\2126.41.51s17,20,222238.61.75m,1.90m2322.61.50m,1.90mm2438.22.05m25145.8\26110.74.87s24,25，272722.31.78s24,25,262817.51.24s3,4,5,312928.91.39s3,4,5,303032.11.25s8,13，14,15表4.HolotoxinE糖链部分的13C-NMR和"H-NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表6.HolotoxinF糖链部分的13C-NMR和'H-NMR数据Position<5h(/inHz)顧BCXyl11105.374.82d(7.)C-3(Aglycone)283.714.10m375.934.28m477.594.45m564.213.73tn，4.53mQui21105.665.23d(7.4)C-2(Xyl1)276.704.16m375.694.20m486.113.73m571.993.80m618.231.83d(5.7)Xyl31105.434.94d(7.5)C-4(Qui2)273.674.12m387.614.24m469.254.10m566.723.73m,4.45mMeGlc41105.795.38d(8.1)C-3(Xyl3)275.314.10m388.213.77m470.834.24m578.494.05m662,354.33m，4.53mOMe60.963.94(3H，s)Glc51103.015.05d(8.0)C-4(Xyl')273.334.12m388.214.28m469.864.18m578.493.94m662.234.33m,4.53mMeGlc61105.855.34d(7.8)C-3(Glc5)275.264.10m388.213.77m470.704.24m578.494.05m662.354.33m，4.53mOMe60.923.94(3H，s)表7.HolotoxinG苷元部分的13C-NMR和'H-NMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表8.HolotoxinG糖链部分的13C-NMR和'H-NMR数据Position<5hinHz)腹BCXyl1124Qui212346Xyl31MeGlc41246OMeGlc51246MeGlc'126OMe6105.4483.7875.9577.5764.26105.5776.7275.7086.1171.9918.23105.3673.6387.7069.2666.77105.7675.3188.1570.9378.5762.4760.94103.0373.3088.1469.8778.4562.35105.7675.2688.1570.7578.5762.4760.904.82d(7.2)4.18m4.27m4.35m3.72m,4.38m5.23dC7.0)4.12m4.14m3.75m3.81m1.83d(5.9)4.93d(7.6)4.08m4.31m4.14m3.70m，4,21m5.37d(7.5)4.05m3.77m4.14m4.08m4,30m,4.47m3.94(3H，s)5.06d(7.9)4.08m4.31m4.14m4.08m4,30m,4.47m5.33d(7.9)4.05m3.77m4.14m4.08m4.30m,4.47m3.94(3H，s)C-3(Aglycone)C-2(Xyl1)C-4(Qui2)C-3(Xyl3)C-4(Xyl1)C-3(Glc')<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表10.HolotoxinH糖链部分的13C-NMR和'H-NMR数据Position<5H(/inHz)bHMBCXyl11105.484.82,d,(7.3)C-3(Aglycone)283.604.11m376.134.28m477.514.39m564.393.76m，4.48mQui21105.845.25，d,(7.6)C-2(Xyl1)276.724.19m375.724.18m486.183.73m571.993.87m618.251.83d(5.8)Xyl31105.364.95,d,(7.6)C-4(Qui2)273.714.08m387.944.18m469.294.12m566.733.71m,4.29mGlc41105.765.41,d，(7.9)C-3(Xyl3)275.724.19m378.434.29m471,824.27m578.974.07m662.704.41m,4.61mGlc51103,575.08(overlap)C-4(Xyl1)274.534.10m378,374.29m471.824.27m578.804.07m662.704.41m,4.61m表11.HolotoxinI苷元部分的13C-NMR和工H-NMR数据Position3h(JinHz)腹BC136.451.48m，1.83m227.342.02m,2.28m388.913.30,dd(3.9,11.7)4,30,31,1(Xyl')440.16-553.151.00(overlap)3,4,6,10，19,30,31621.461.547m,1.78m728.681.61m840.802.39m9,11,14,329149.77-1039.82-11115.405.45m1236.772.23m，2.49m9,11,13,14,201344.28-1441.38-1549.772.19d(17.7)，2.41d(17.7)13，14,16,17,3216221.02-1764.722.97s12,13,16,18，20,211817.161.20s12,13,14,171922.601.18s1,5,9，102074.552126.651.57s17,20,222241.952.012m2322.601.81m，1.92m2438.772.19m25146.50-26110.594.92,d(16.1)24，25,272722.201.81s24,25,262816.981.20s3,4,5,312928.351.37s3，4,5，303019.021.00s8，13,14,1518<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本发明化合物HolotoxinDI的制备方法如下(1)制备总皂苷提取物将新鲜的仿刺参冷冻干燥后，粉碎成粉末，用重量比为510倍的50%95%乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20或DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70%乙醇和95%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为36倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶剂浓縮至干，得仿刺参总皂苷提取物；(2)分离纯化上述总皂苷提取物进行正相硅胶柱层析，以氯仿甲醇水的体积比为106:1~4:0.10.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇水的体积比5090:5010的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行C,8高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为7090:3010作为流动相洗脱，分别得到HolotoxinDI的纯nBPo本发明化合物HolotoxinD1经体外抗真菌活性实验，表明这些化合物有明显的抑制真菌生长的效果。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作详细描述，但保护范围不局限于实施例。实施例1从仿刺参中制备HolotoxinD~I将新鲜的冷冻干燥后的仿刺参3.0kg，粉碎成粉水，用重量比为6倍的60%乙醇热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70%乙醇和95%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为4倍的iH丁醇萃取3次，合并萃取液，回收溶剂浓縮至干，得仿刺参总皂苷提取物，再进行IH相硅胶柱层析，以氯仿甲醇水的体积比为7:3:0.5的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇水的体积比70:30洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行Cw高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为80:20的溶剂作为流动相洗脱，分别得到HolotoxinD~I的纯品为20.1mg，18.4mg，12.7mg，7.2mg，17.8mg，15.9mg。实施例2从仿刺参中制备HolotoxinD~I将新鲜的冷冻干燥后的仿刺参4.5kg，粉碎成粉末，用重量比为5倍的70%乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70%乙醇和95%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为4倍的正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收溶剂浓縮至干，得仿刺参总皂苷提取物，再进行正相硅胶柱层析，以氯仿甲醇水的体积比为6:4:0.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇水的体积比75:25洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行Cw高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为85:15的溶剂作为流动相洗脱，分别得到HolotoxinD1的纯品为30.5mg，26.8mg，18.7mg，10.4mg，25.8mg，21.3mg。抗真菌活性实验实验所用真菌菌株白念珠菌(Ca"tfe/aa/Wcara)SC5314、新生隐球菌(Co^ococc^"eo/wwara)BLS108由第二军医大学长征医院菌种保存中心提供；热带念珠菌(Qm&Via"ci/)/cafc)、红色毛癣菌(7Hc/zop/y^own/6n/w)、石膏状,」、f包子菌(AZ/cros^ww附gy/^ew附)、薫'烟曲雾菌(^s/^rg/〃w51/w附/ga/i^)由第二军医大学长海医院真菌室提供。阳性对照药为伊曲康唑、特比芬、两性霉素B、活力康唑、氟康唑和酮康唑。实验前，用接种圈从4'C保存的沙堡葡萄糖琼脂培养基上挑取新生隐球菌、白念珠菌和热带念珠菌少量，接种至lmlYEPD培养液，于35。C，250rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至lmlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至lxl035xl()3个/ml。将熏烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏状小孢子菌接种至沙堡葡萄糖琼脂培养基斜面，其中，熏烟曲霉菌于35t:培养一周；红色毛癣菌和石膏状小孢子菌于28"培养两周。各菌活化两次后，加适量RPMI1640培养液于沙堡葡萄糖琼脂培养基斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至lxl035xl。3个/ml。将本发明化合物及对照药物分别用DMSO配成6.4g，L—1溶液，一20"C保存，实验前，将分别取出置35'C温箱融化备用。取无菌96孔药敏板，于每排1号孔加RPMI1640培养液100、1作空白对照；312号孔各加新鲜配制的菌液120、1;2号孔分别加菌液160、1和受试化合物溶液1.6、1。211号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、0.25禾卩0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg'L-1，各孔中DMSO含量均低于1%;12号孔不含药物，作阳性对照。念珠菌(白色念珠菌和热带念珠菌)、新生隐球菌及丝状菌(熏烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏状小孢子菌)药敏板分别于35"C培养24h、72h和一周后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80^以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIQo(真菌生长80%被抑制时的药物浓度)。实验结果见表13。表13.HolotoxinD~I对真菌菌株的抑制作用(MIC80，mg'I/1)药名山色念珠菌SC5314新生隐球菌BLS108热带念珠菌红色毛癣菌0501124石膏状小孢了菌31388熏烟曲荒菌0504656HolotoxinD848828HolotoxinE8484216HolotoxinF>641664646432HolotoxinG>64>64>6464816HolotoxinH1681616832HolotoxinI881616816伊曲康唑0.06250.1250.1250.1250.06252特比芬80.540.250.1250.25酮康哗0.06250.06250.1250.0625<0.1251两性每素B163232232活力康唑0.01560.01560.06250.1250.25氟康唑0.510.541>64从表11可见，这六种化合物对6种真菌菌株均显示明显的抑制作用，因而可用于制备抗真菌药物。本发明为研制新的抗真菌药物提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。权利要求1、三萜皂苷类抗真菌化合物HolotoxinD～I，其特征在于化学结构通式如下其中，基团R1为CH2OH或MeR2为OMe或OHΔ为双键，位于7，8位或9，11位所说化合物的基团搭配分别如下2、权利要求1所述抗真菌化合物的制备方法，步骤如下(1)制备总皂苷提取物将新鲜的仿刺参冷冻干燥后，粉碎成粉末，用重量比为510倍的50%95%乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20或DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70%乙醇和95%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为36倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶剂浓縮至干，得仿刺参总皂苷提取物；(2)分离纯化上述总皂苷提取物进行正相硅胶柱层析，以氯仿甲醇水的体积比为106:1~4:0.1~0.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇水的体积比5090:5010的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行<:18高效液相色谱分离，以甲醇水的体积比为70卯3010作为流动相洗脱，分别得到HolotoxinDI的纯品。3、权利要求1所述三萜皂苷类化合物在制备抗真菌药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是从仿刺参中分离到的6种三萜皂苷类抗真菌化合物HolotoxinD～I，化学结构通式如右，体外抗真菌试验表明，这些化合物对白念珠菌SC5314、新生隐球菌BLS108、热带念珠菌、红色毛癣菌、石膏状小孢子菌和薰烟曲霉菌有明显的抑制作用。本发明可为研制新的抗真菌药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋药用资源具有重要价值。文档编号A61K31/704GK101671385SQ20091019614公开日2010年3月17日申请日期2009年9月23日优先权日2009年9月23日发明者刘宝姝,文张,张宏伟,易杨华,玲李,华汤,王增蕾,袁卫华申请人:中国人民解放军第二军医大学