专利名称：眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法。
背景技术：
在基因治疗中，利用RNA干扰技术可特异性地阻断细胞内促新生血管生成基因转 录，从而抑制眼内的新生血管。然而，基因治疗存在的一个问题是如何确保基因在体内高水 平表达。裸露的外源基因难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，难以高效、稳定地表达， 仅能短暂地抑制新生血管生成过程，因此导致新生血管在眼内给药后复发。为了获得有效 药物浓度，必须在较长的一段时期内反复给予玻璃体腔注射，这一有创性操作不可避免的 导致某些眼部并发症发生，如玻璃体出血、视网膜脱离或眼内炎等。由于新生血管生长是一 个较为长期的过程，采用玻璃体腔药物注射治疗眼部新生血管需要借助新型基因载体携带 基因进入细胞，并持续释放表达产物来发挥其治疗作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种眼内用纳米粒冻干粉 及其制备方法，具有载药量大、大小分布均匀、可缓慢释放外源基因、减少反复玻璃体腔给 药次数和眼部并发症发生的特点。 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种眼内用纳米粒冻干粉，其包括 如下成分 聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为95% 99% ;
具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒的质量百分比为1% 5%，所说的 具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒为缺氧诱导因子-1 a短发卡式小干扰RNA质 粒pshHIF-l a或血管内皮生长因子短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF。
—种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，包括如下步骤 首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒80yg 120yg溶于 100 iil 200 iil三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液作为内水相，在冰浴条件下将 其滴加入lml 2ml含有2% (重量比)可生物降解聚合物聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸 共聚物PLGA的二氯甲烷中，进行乳化形成油包水型初乳，同时高速搅拌30000转 40000 转/分钟进行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的 乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；所说的具干扰促新生血管生成基因转录 作用的质粒为缺氧诱导因子-la短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-la或血管内皮生长因 子短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF ; 其次，将形成的油包水型初乳滴加入6ml 20ml的1 % (w/v)的聚乙烯醇PVA外
水相，油相外水相=i : 6 i : io，高速搅拌3分钟 5分钟，其转速为30000转/分
钟 40000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在常压下搅拌3 4小时，挥发掉有机相，离心机的转速为13000转/分钟 15000转/分钟，离心时间为20分钟 25分钟，温 度为3t: 4t:，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA，制备成
冻干粉，在温度3°C 4t:下保存。 本方法发明有益效果是，采用复乳一溶剂挥发法将具有干扰新生血管生成的质粒 包被于可生物降解聚合物中形成载质粒纳米粒，实用有效、简便易行；由于载质粒纳米粒体 积小，利于基因渗透入深层组织，到达靶细胞并被细胞吸收；通过选择聚合物分子量、亲水 性的比率等理化特性，可延长包载的基因物质在细胞内的释放速率，从而延长基因的转染 时间；同时纳米囊对基因的包裹或纳米颗粒表面长的侧链对吸附基因的遮蔽使包载在聚合 物基质内的核酸片段免受核酸内切酶的作用；具备一定的细胞转染率；可通过表面修饰达 到靶向化目的(为预测有益效果)；可生物降解聚合物在体内降解代谢为^0和0)2，对活体 组织无毒性，具有生物降解性、生物相容性。
图1为本发明新型载pshHIF-l a PLGA纳米粒的粒径分布图。 图2为本方法发明新型载pshHIF-l a PLGA纳米粒的透射电镜图。 图3为本方法发明新型载pshHIF-l a PLGA纳米粒在体外的质粒释放_时间曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1 : —种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为98. 98% ; 缺氧诱导因子-la短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-la的质量百分比为 1. 02%。 —种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取复乳-溶剂挥发法，包括如下步骤
首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的100i!g缺氧诱导因子-la短发 卡式小干扰RNA质粒pshHIF-l a溶于200 三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液 作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA 的二氯甲烷中进行乳化形成油包水型初乳，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分钟进行 乳化60秒，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内 无分层； 其次，将形成的油包水型初乳滴加入12ml的1 % (w/v)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 6，用搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包
水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4小时，挥发有 机相，离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗涤 沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度为4°C 。
离心和洗涤过程中同时收集所有上清液，用于检测游离pshHIF-l a的含量。
激光粒度分析及Zeta电位分析用O. 22 y m滤膜滤过的蒸馏水适量悬浮少量的纳 米粒，进行激光粒度测定和Zeta电位分析(25±0. 1) °C 。 透射电镜观察纳米粒表面形态和粒径范围蒸馏水适当稀释载pshHIF-1 a PLGA
纳米粒混悬液，磷钨酸负染，滴于镀膜的铜网上晾干，透射电镜下观察并拍照。 纳米粒中pshHIF-1 a含量的测定精确称量载pshHIF_l a PLGA纳米粒冻干粉
10mg，加入500 ii L氯仿至溶解完全，再加入500 y LTris-EDTA缓冲液，充分振荡30分钟，
12000rpm离心3分钟，取上清，反复洗3次。将3份上清混合均匀，紫外分光光度计在波长
260nm处测定吸光值，根据公式(1):载药率％ =上清中pshHIF-1 a量/纳米粒量X100X
计算基因含量。 纳米粒包封率的测定取制备时的上清以及洗涤液混合均匀，精确测定溶液体积， 并用紫外分光光度计测定溶液吸光值，计算游离pshHIF-la含量，根据公式(2):包封率％ =(总pshHIF-1 a量-上清中pshHIF-1 a量)/总pshHIF-1 a量X 100%计算包封率。
载pshHIF-1 a PLGA纳米粒体外释放试验载pshHIF-1 a PLGA纳米粒体外释放在 含O. 02%叠氮化钠(NaN3)的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行。精确称量20mg纳米粒，加入lmL PBS溶液中形成均匀的悬浮液，置于恒温摇床，其温度为37t:，转速为100转/分钟，每24 小时取lOOii L用紫外分光光度计测定吸光值，同时用同等体积新鲜缓冲液更换释放液。计 算释放量并绘制累积释放曲线。 结果显示载pshHIF-l a PLGA纳米粒大小均匀，平均粒径为284nm，呈窄分布。质粒 包封率为60. 2 % ，载药量为1.02%，体外缓慢释放达4周。 参见图1，实施例1载pshHIF-1 a PLGA纳米粒的粒径分布图。横坐标为纳米粒粒 径(nm)，纵坐标为纳米粒相对含量，条图描述了各粒径范围包含的纳米粒相对含量。图中显 示约78. 17%的载pshHIF-1 a PLGA纳米粒集中分布在164 342nm，呈窄分布，平均粒度为 284nm。 参见图2，实施例1载pshHIF-1 a PLGA纳米粒的透射电镜图。透射电镜结果显示 载pshHIF-l a PLGA纳米粒呈圆形或椭圆形粒子，直径为100 300nm，与光粒度分析结果相 符。(Bar = lOOnm) 参见图3，实施例1载pshHIF-1 a PLGA纳米粒在体外的质粒释放_时间曲线图。 横坐标为释放时间(d)，纵坐标为释放质粒的相对含量，蓝线和黄线显示了两个不同样本在 30天内累积释放质粒的百分比。曲线图显示，在体外最初5d为突释相，约有70X的质粒 DNA释放，随后的23d呈稳态缓释，质粒含量维持在70%以上。
实施例2 —种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分
聚乳酸PLA的质量百分比为97% ; 缺氧诱导因子-1 a短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1 a的质量百分比为3% 。
—种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，采取复乳-溶剂挥发法，包括如下步骤
首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的100i!g缺氧诱导因子-la短发 卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1 a溶于200 三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液 作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含2X聚乳酸PLA的二氯甲烷中同时高速搅拌， 搅拌速度为30000转/分钟，进行乳化形成油包水型初乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层； 其次，将形成的油包水型初乳滴加入16ml的1 % (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 8，在搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包
水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌3.5小时，挥发 有机相，离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗 涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度4°C 。
实施例3 —种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为99% ; 血管生长因子VEGF短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF的质量百分比为1 % 。
—种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，采取复乳-溶剂挥发法，包括如下步骤
首先，将pshVEGF质粒100iig溶于200iil三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓 冲液作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物 PLGA的二氯甲烷中，同时以30000转/分钟的转速高速搅拌进行乳化60秒形成油包水型初 乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；
其次，将形成的油包水型初乳滴加入12ml的1 % (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油
相外水相=1 : 6，在搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包
水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌3小时，挥发有 机相，离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗涤 沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度3°C 。
毒性药理试验 本发明新型实施例1中载pshHIF-l a PLGA纳米粒冻干粉混悬液可经玻璃体内注 射给药在眼内发挥抑制新生血管作用。为证实本发明在眼内的治疗效率水平以及毒性，通 过免疫组化、脉络膜铺片、荧光素眼底血管造影和组织病理学等方法观察载质粒纳米粒在 眼内新生血管模型(如激光诱导大鼠脉络膜新生血管、高氧诱导早产儿视网膜病变模型) 中的组织分布及转染情况，评价其对新生血管的抑制效率。结果显示，载pshHIF-l a PLGA 纳米粒能够转染眼内细胞并缓慢释放外源基因，显著抑制了实验性大鼠眼内新生血管的生 长。利用视觉电生理和透射电镜评价纳米粒对视网膜功能和结构的毒性作用，证实其对视 网膜功能和超微结构无明显毒性作用，具有临床治疗视网膜和脉络膜新生血管疾病的发展 潜能。
权利要求
一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸PLGA的质量百分比为95％～99％；具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒的质量百分比为1％～5％；所说的具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒为缺氧诱导因子-1α短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1α或血管内皮生长因子短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF。
2. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸PLGA的质量百分比为98. 98% ;缺氧诱导因子-la短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1 a的质量百分比为1.02%。
3. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸PLA的质量百分比为97% ;缺氧诱导因子-1 a短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1 a的质量百分比为3% 。
4. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸PLGA的质量百分比为99% ;血管生长因子VEGF短发卡式小干扰RNA质粒pshVEGF的质量百分比为1 % 。
5. —种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒80 g 120 g溶于100 200 ill三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入 lml 2ml含有2X (重量比)可生物降解聚合物聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA 的二氯甲烷中，进行乳化形成油包水型初乳，同时高速搅拌30000转/分钟 40000转/分 钟进行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略 泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；所说的具干扰促新生血管生成基因转录作用的 质粒为缺氧诱导因子-1 a短发卡式小干扰RNA质粒pshHIF-1 a或血管内皮生长因子短发 卡式小干扰RNA质粒pshVEGF ;其次，将形成的油包水型初乳滴加入6ml 20ml的1% (w/v)的聚乙烯醇PVA外水相，油相外水相=i : 6 i : io，高速搅拌3分钟 5分钟，其转速为30000转/分钟 40000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在常压下搅拌3小时 4小时，挥发掉有机 相，离心机的转速为13000转/分钟 15000转/分钟，离心时间为20分钟 25分钟，温 度为3t: 4t:，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA，制备成冻干粉，在温度3°C 4t:下保存。
6. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取复乳_溶剂挥发 法，其特征在于，包括如下步骤首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的100i!g缺氧诱导因子-la短发卡式 小干扰RNA质粒pshHIF-1 a溶于200 yl三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液作为 内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含有2% (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的 二氯甲烷中进行乳化形成油包水型初乳，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分钟进行乳 化60秒，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无 分层；其次，将形成的油包水型初乳滴加入12ml的1% (w/v)聚乙烯醇PVA外水相，油相外水相=1 : 6，用搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复 乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4小时，挥发有机相， 离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗涤沉淀， 蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度为4°C 。
7. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，采取复乳_溶剂挥 发法，其特征在于，包括如下步骤首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的100i!g缺氧诱导因子-la短发卡式 小干扰RNA质粒pshHIF-l a溶于200 yl三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲液作为 内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含2%聚乳酸PLA的二氯甲烷中同时高速搅拌，搅拌 速度为30000转/分钟，进行乳化形成油包水型初乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的 乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；其次，将形成的油包水型初乳滴加入16ml的1% (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油相外 水相=1 : 8，在搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复 乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌3. 5小时，挥发有机 相，离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗涤沉 淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度4°C 。
8. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，采取复乳_溶剂挥 发法，其特征在于，包括如下步骤首先，将pshVEGF质粒100 ii g溶于200 iil三(羟基甲基)氨基甲烷Tris-EDTA缓冲 液作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入2ml含有2X (重量比)聚乳酸聚乙醇酸共聚物 PLGA的二氯甲烷中，同时以30000转/分钟的转速高速搅拌进行乳化60秒形成油包水型初 乳，此时从外观看呈白色均匀、不挂壁的乳液，略泛蓝色乳光，静置观察在1小时内无分层；其次，将形成的油包水型初乳滴加入12ml的1% (v/w)聚乙烯醇PVA外水相，油相外 水相=1 : 6，在搅拌器搅拌4分钟，其转速为30000转/分钟，形成均匀的水包油包水型复 乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌3小时，挥发有机相， 离心机的转速为13000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4t:，离心后收集、洗涤沉淀， 蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度3°C。
全文摘要
一种眼内用纳米粒冻干粉，包括聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸PLGA和具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒，首先，将具干扰促新生血管生成基因转录作用的质粒溶于Tris-EDTA缓冲液作为内水相，在冰浴条件下将其滴加入含可生物降解聚合物PLA或PLGA的二氯甲烷中，同时进行乳化形成油包水型初乳，其次，滴加入外水相，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，在通风橱内搅拌，挥发有机相，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的基因及聚乙烯醇PVA，制备成冻干粉、保存；具有载药量大、大小分布均匀、可缓慢释放外源基因、减少反复玻璃体腔给药次数和眼部并发症发生的特点。
文档编号A61P27/02GK101708167SQ20091021913
公开日2010年5月19日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者侯慧媛, 吴红, 张朝霞, 张楚, 朱洁, 杨秀梅, 王雨生, 蔡岩, 赵炜, 马吉献 申请人:中国人民解放军第四军医大学