专利名称：生物活性基元的酶促共轭的制作方法
生物活性基元的酶促共轭本发明涉及生物活性基元与聚合物或可聚合化合物选择性共轭的方法。与生物活性基元共轭的聚合物或可聚合化合物(如单体、大分子单体或预聚物) 在生物药物应用中具有广泛用途。例如，生物活性基元可以通过官能团(例如羧酸)共轭， 所述官能团是聚合物或可聚合化合物的一部分。然而，在共轭产物制备的一些阶段中期望 或甚至需要保护羧酸基团，从而允许特定的加工步骤有效地发生和/或避免游离(即未受 保护的)羧酸基团的存在引起的不想要的副反应。通常，羧酸通过用烃酯化来保护。在能够使生物活性基元与受保护的羧酸化学共轭之前，需要去保护步骤。然而，这 类去保护可能是麻烦的，尤其是当聚合物或可聚合化合物在除受保护的羧酸基团以外还包 含一种或多种其它可水解基团如其它酯基或硫酯基时。可水解基团如酯或硫酯基通常由水性环境中的酸或碱水解。然而，已知这类水解 不是选择性的。在一些情况下需要选择性水解，尤其是例如当聚合物或可聚合化合物包含 一种或多种其它可水解基团(例如多酯基)时。已知例如可以在无水有机溶剂中，在使用例 如三氟乙酸(TFA)的化学方法中优先实现叔丁基酯相对于其它酯或硫酯基的选择性水解。 然而，该方法具有若干缺点。对于酯的有效去保护而言，通常需要使用大幅过量的TFA( > 10当量)。高度酸性的条件使得这种去保护形式不适用于在强酸性条件下不稳定的化合 物。所述反应在无水溶剂中进行，因为在TFA-介导的去保护期间，痕量水通常会足以引起 分子中其它可水解基团、尤其是其它酯或硫酯功能的广泛水解。TFA的完全去除或几乎完全 去除是费力(和昂贵)的，但是极其重要，尤其是在官能团(例如为生物活性基元一部分的 官能团)要与羧酸偶合时，因为偶合步骤中TFA的存在对于偶合反应可以是有害的。在生物活性基元与聚合物或可聚合化合物的化学共轭的情况下，生物活性基元的 反应性基团应当至少部分被保护，从而避免与化学共轭剂的副反应。此外，化学共轭剂是昂贵、不可循环和环境不友好的。此外，受保护的生物活性基元的使用还在共轭反应后需要一个或多个其它的去保 护步骤，这可能是一种挑战。本发明的一个目的是克服上述一种或多种缺点。本发明的另一个目的是提供使生物活性基元与聚合物或可聚合化合物有效共轭 的方法。本发明的又一个目的是提供一种上述方法，其中不需要对存在于聚合物或可聚合 化合物中的羧酸基团进行去保护的步骤。本发明的又一个目的是提供一种上述方法，所述方法在共轭过程中不需要昂贵的 偶合试剂或多个步骤。本发明的另一个目的是提供一种上述方法，其中生物活性基元在共轭之前在其反 应性官能团上需要更少保护基或不需要保护基。目前发现可使生物活性基元与聚合物或可聚合化合物选择性地共轭。因此，本发明涉及使生物活性基元与悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭的 方法，其中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使聚合物或可聚合化合物与水解酶接触，以催化生物活性基元和悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基之 间的共轭。惊讶地发现，可能以相对于聚合物或可聚合化合物主链中可能存在的一种或多种 其它基团(例如其它酯基、硫酯基、氨基甲酸酯基或脲基)而言高度的选择性，使生物活性 基元与聚合物或可聚合化合物中存在的悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基共轭。本发明方法的一个优点是根据本发明的酶促方法与化学共轭方法相比是环境友 好的。另一个优点是可以通过催化量的廉价和可再循环的酶，使生物活性基元与立体大 聚合物或可聚合化合物选择性地共轭。又一个优点是在共轭之前生物活性基元的反应性官能团仅需被部分保护或不需 保护。又一个优点是可以使生物活性基元选择性地共轭，使羧酸基团保护以及去保护， 其中在保护的情况下不需要去保护步骤，例如在酯或硫酯基的情况下。在聚合物或可聚合化合物具有任选的与生物活性基元结合的活性中心时，在共轭 反应期间聚合物或可聚合化合物不发生外消旋化或发生更少外消旋化是又一优点。在本文中使用时，术语“聚合物”表示基本包含下述单元的多个重复的结构，所述 单元事实上或概念上衍生自低相对分子量的分子。这类聚合物可包括交联的网络、树状聚 体和超分枝聚合物以及线性聚合物。低聚物被认为是聚合物的一类，即具有相对低数量下 述单元重复的聚合物，所述单元事实上或概念上衍生自低相对分子量的分子。聚合物可具有200Da或更高、400Da或更高、800Da或更高、IOOODa或更高、2000Da 或更高、4000Da或更高、8000Da或更高、10 OOODa或更高、100 OOODa或更高或1 000 OOODa 或更高的分子量。具有相对低质量(8000Da或更低，尤其是4000Da或更低，更尤其是IOOODa 或更低)的聚合物可以被称作低聚物。悬挂式羧酸、酯或硫酯表示不位于聚合物主链中或者在随后的聚合步骤中不会位 于得到的聚合物主链中的羧酸、酯或硫酯。尤其令人惊讶的是本发明允许生物活性基元与下述化合物中悬挂式空间难以接 近的羧酸基、酯基或硫酯基团的选择性共轭，所述化合物例如为聚合物或低聚物或大的可 聚合化合物，例如为包含多于一个可聚合基元的化合物。本发明尤其涉及下述方法，其中悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合 化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个可聚合基元，和(b)至少一
个氨基酸残基。根据本发明的方法尤其适用于使生物活性基元与下述聚合物或可聚合化合物的 悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个 可聚合基元，和(b)包含至少两个氨基的氨基酸的至少一个氨基酸残基，所述至少两个氨 基已形成脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基或硫代氨基甲酸酯基。因此本发明允许下述聚合物或可聚合化合物中悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基的选 择性共轭，所述聚合物或可聚合化合物可得自商业上容易获得或容易合成的初始化合物。 例如，可以从下述二氨基酸制备氨基甲酸酯，所述二氨基酸的羧酸功能被伯烷基酯如甲酯 (例如L-赖氨酸甲酯)保护。
另外，能够实现与生物活性基元的高度选择性共轭而不需要化学计量的昂贵并且 环境不友好的偶合剂是有利的。聚合物或可聚合化合物除了悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基以外，还可包含选自脲 基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、其它酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或 碳水化合物基的基元。根据本发明的方法更尤其适用于使生物活性基元与式I表示的聚合物或可聚合 化合物选择性地共轭，其中
权利要求
1.将生物活性基元与悬挂式(pendant)羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭的方法，其 中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或 可聚合化合物与水解酶接触，以催化所述生物活性基元和所述悬挂式羧酸基、酯基或硫酯 基之间的共轭。
2.根据权利要求1的方法，其中所述悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合 化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个可聚合基元和(b)至少一个氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物除了所述悬 挂式羧酸基、酯基或硫酯基以外，还包含选自脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯 基、酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或碳水化合物基的基元。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述可聚合化合物由式I表示
5.根据权利要求4的方法，其中 -G 是 X ；-每个Y = 0，且每个X表示包含羟基亚烷基、羟乙基丙烯酸酯或羟乙基异丁烯酸酯的 基元； -每个R表示氢；-L表示氨基酸；-η = 1 ；-W 是 0 ；-Q 是 0 ；-Z是H或具有1-6个C原子的烷基。
6.根据权利要求5的方法，其中所述氨基酸基元选自赖氨酸基元、二氨基丙酸基元、羟 基赖氨酸基元、N-α -甲基化的赖氨酸基元或二氨基丁酸基元。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述氨基酸残基具有L-构型。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述聚合物是由根据权利要求5-7中任一 项的化合物组成的聚合物。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物含有一个或多 个赖氨酸-甲基酯基元。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述水解酶选自羧酸酯水解酶、硫酯水解 酶或肽酶的组。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述水解酶是选自丝氨酸型羧肽酶、金 属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶和金属内 肽酶的组的肽酶。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述酶是丝氨酸内肽酶。
13.根据权利要求12的方法，其中所述酶是枯草杆菌蛋白酶。
14.根据权利要求13的方法，其中所述酶是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
15.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述酶是半胱氨酸内肽酶。
16.根据权利要求15的方法，其中所述酶是木瓜蛋白酶。
17.根据权利要求10的方法，其中所述酶是选自Candidaantarctica脂肪酶B (CALB)、 lypozyme RM、Piccantase A 、Rhizomucor miehei 月旨肪醇、热稳定酉旨醇或 Iilipase 的幾 基酯水解酶。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中所述生物活性基元的共轭可在所述可聚 合化合物的聚合作用之前、期间或之后发生。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中所述生物活性基元的共轭发生在所述聚 合物成形之后。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述生物活性基元选自氨基酸、肽或蛋 白质。
全文摘要
本发明涉及生物活性基元与聚合物或可聚合化合物的选择性共轭的方法。所述方法更明确地涉及生物活性基元与悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基的选择性共轭，其中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或可聚合化合物与水解酶接触，以催化生物活性基元和悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基之间的共轭。生物活性基元的共轭可在可聚合化合物的聚合作用之前、期间或之后发生。生物活性基元的共轭也可以在聚合物成形之后发生。
文档编号A61K47/48GK102007217SQ200980113041
公开日2011年4月6日 申请日期2009年2月13日 优先权日2008年2月13日
发明者克劳迪娅·卡森, 凯瑟琳娜·赫伯蒂娜·玛丽亚·斯彻伯斯, 埃尔文·戴耶斯, 巴斯·瑞特泽, 巴索路米阿斯·约翰尼斯·玛格瑞萨·普卢姆, 彼得·珍·伦纳德·马里奥·奎德弗利格 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司