用于胞内递送治疗剂的胶束的制作方法

专利名称：用于胞内递送治疗剂的胶束的制作方法
技术领域：
本文描述了由聚合物形成的胶束和这种胶束的应用。
背景技术：
在一些情况中，给活细胞提供治疗剂，例如多核苷酸(例如寡核苷酸)是有益的。 在一些情况中，给活细胞递送这种多核苷酸提供了治疗有益性。发明概述本文提供了用于胞内递送治疗剂(例如寡核苷酸、肽类等)的胶束。在一些实施 方案中，这种胞内递送是体外的；在其他实施方案中，这种胞内递送是体内的。在一些实施方案中，特别将本文提供的胶束设计成可靶向递送胶束净载荷至受试 者内期望的治疗干预部位处。因此，该胶束优选对生理PH下的稀释是稳定的。在一些实施 方案中，本文提供的胶束在生理条件下稳定并且具有可防止不期望的胶束缔合的临界胶束 浓度。在另一些或可选择的实施方案中，包含本文所述胶束的嵌段共聚物具有被设计成在 生理条件下有提高的胶束完整性的嵌段比、嵌段大小和/或芯特性和/或壳特性。在另一 些或可选择的实施方案中，生理环境中胶束的完整性还依赖于包含胶束的嵌段共聚物的组 成。因此，本文提供了被加工成可提供适合于以最低的毒性和/或胶束净载荷损失进行有 效胞内递送的胶束的某些参数(例如用于胶束壳嵌段和芯嵌段中嵌段共聚物的数均分子 量比、嵌段共聚物中带电荷部分的数量等)。在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸， 所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌 段共聚物缔合而使得胶束在约中性PH下、在含水介质中稳定，(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；(ii)临界胶束浓度 CMC 在约 0. 2ug/mL-约 20ug/mL ；(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；(iv)约0. 5xl06-约3. 6xl06道尔顿的重均分子量；(ν)约 5nm-约 500nm 的粒度；禾口(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1-约1 10 ；和
(ii)约1. 0-约2. 0的多分散性指数。在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸， 所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌 段共聚物缔合使得胶束在约中性PH下、在含水介质中稳定，(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；(ii)在 0. 5M NaCl 中的临界胶束浓度 CMC 在约 0. 2ug/mL_ 约 20ug/mL ；(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；(iv)约0. 5x IO6-约3. 6xl06道尔顿的重均分子量；禾口(b)嵌段共聚物具有一种或多种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1_约1 10 ；和(ii)约1. 0-约2. 0的多分散性指数。在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸， 所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，所述多个 嵌段共聚物缔合而使得胶束在约中性PH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更 多种选自如下的特征(i)缔合数量在约10-约100个链/胶束；(ii)临界胶束浓度 CMC 在约 0. 2ug/mL-约 20ug/mL ；(iii)约 5nm-约 500nm 的粒度。在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸， 所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，所述多个 嵌段共聚物缔合而使得胶束在约中性PH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或多 种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1_约1 10;(ii)约1. 0-约2. 0的多分散性指数；和(iii)约 0. 5xl06-约 3. 6xl06g/mol 的重均分子量。在一些实施方案中，所述组合物包含具有其子段(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(ν)中 的三个或更多个特征的胶束。在一些实施方案中，所述胶束具有其子段(i)、(ii)、(iii)、 (iv)和(ν)的全部特征。在一些实施方案中，所述组合物包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物具有其子段(i)、 (ii)和(iii)的全部特征。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌 段的数均分子量Mn之比为约1 1-约1 10。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物的亲 水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1 1.5-约1 6。在一些实施方案中， 所述嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1 2-约1 4。在一些实施方案中，所述组合物包含胶束，该胶束包含约10-约100个嵌段共聚物 /胶束。在一些实施方案中，该胶束包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方 案中，该胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，所述组合物包含具有约0. 2ug/mL-约20ug/mL的临界胶束浓 度CMC的胶束。在一些实施方案中，所述胶束具有约0. 5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。在一些实施方案中，所述胶束具有约lug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。在一些实施方案中，所述组合物包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物的亲水性嵌段与 疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1 1.5-约1 6;且所述胶束(i)包含约20-约 60个嵌段共聚物/胶束；和(ii)具有约0. 5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。在一些实施方案中，该嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn 之比为约1 2-约1 4;且所述胶束(i)包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束；和(ii) 具有约lug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物具有约1. 0-约2. 0的多分散性指数。 在一些实施方案中，所述的嵌段共聚物具有约1. 0-约1. 7的多分散性指数。在一些实施方 案中，所述的嵌段共聚物具有约1. 0-约1. 4的多分散性指数。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含胶束，该胶束具有约0.切106-约 3. 6xl06的聚集分子量Mw。在一些实施方案中，该胶束具有约0. 75xl06-约2. OxlO6的聚集 分子量Mw。在一些实施方案中，该胶束具有约1. OxlO6-约1. 5xl06的聚集分子量Mw。在一些实施方案中，所述胶束具有的粒度为约5nm-约500nm。在一些实施方案中， 所述胶束具有的粒度为约IOnm-约200nm。在一些实施方案中，所述胶束具有的粒度为约 20nm-约 lOOnm。在本文提供的组合物的一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约 1-约10，000。在一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约4-约5，000。在一 些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约15-约3，000。在一些实施方案中，与 每一胶束缔合的多核苷酸数量为约30-约2，500。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个阳 离子性单体单元，该亲水性嵌段中的阳离子性种类与多核苷酸缔合。在一些实施方案中， 所述阳离子性单体单元是阳离子单体的残基、不带电荷的布朗斯台德碱单体的残基或其组合。在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述多核苷酸是RNAi试剂或siRNA。在 一些实施方案中，所述多核苷酸不在胶束芯内。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在 亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的阴离子性单体单元。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性 嵌段和/或疏水性嵌段中的不带电荷的单体单元。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性 嵌段和/或疏水性嵌段中的两性粒子型单体单元。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在疏水性 嵌段中的可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在 疏水性嵌段中包含至少20个可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚 物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少15个可带电荷的残基。在一些实施方案中，所 述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少10个可带电荷的残基。在 一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少5个 可带电荷的残基。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含聚合物生物缀合物，其包含与所述多 个嵌段共聚物中的一种或多种共价偶合的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，所述 多核苷酸是siRNA。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个具 有可质子化部分和多个疏水性部分的单体单元。在一些实施方案中，所述阴离子性单体单 元是阴离子性单体的残基、不带电荷的布郎斯台德酸单体的残基或其组合。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个衍生自具 有疏水性部分的可聚合单体的单体单元。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物是膜去稳定化的嵌段共聚物。附图简述本发明的新特征特别在所附权利要求中举出。通过参照举出示例性的其中使用本 发明原理的实施方案和附图的如下详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点

图1 :RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；图2 [PEGMAff] - [B-P-D]聚合物合成的示例性实例；图3 =RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；图4 :PEGMA-DMAEMA共聚物的组成和特性的示例性实例；
图5 [PEGMAff-MAA (NHS) ] - [B-P-D]聚合物合成的示例性实例；图6 =RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；图7 =RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；图 8 =PDSMA 的合成；图9 用于siRNA缀合的HPMA-PDSMA共聚物的合成；图10 嵌段共聚物PRx07^v6的NMR光谱术的示例性实例；图11 :PRx0729v6颗粒在有机溶剂中的稳定性的示例性实例；图12 聚合物PRx07^v6的示例性透射电子显微镜检查(TEM)分析；图13 :pH对聚合物结构的影响的示例性实例；图14 聚合物PRx07^v6的临界稳定性浓度(CSC)的示例性实例；图15 与siRNA复合的聚合物PRx07^v6的粒度的动态光散射(DLS)测定的示例 性实例；图16 聚合物PRX07^v6/siRNA复合物在不同电荷比例下的凝胶移位分析的示例 性实例；图17 =SiRNA-胶束复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性的示例性实例；图18 =SiRNA-胶束复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性的示例性实例；图19 聚合物胶束及其siRNA复合物的膜去稳定化活性的示例性证实；图20 聚合物-siRNA复合物的细胞摄取和胞内分布的示例性荧光显微镜检查；图21 半乳糖末端官能化的聚[DMAEMA]-大CTA的示例性实例；图22 半乳糖官能化的DMAEMA-MAA(NHS)或PEGMA-MAA(NHS) 二 -嵌段共聚物的 示例性实例；图23 可缀合的siRNAs和吡啶基二硫化胺的结构的示例性实例。发明详述
在一些实施方案中提供了组合物，其包含聚合物胶束和与该胶束缔合的多核苷 酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物。一般而言，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌 段。在一些实施方案中，本文所述聚合物胶束按照这种方式缔合，以便在含水介质中例如在 约中性PH下稳定。在一些实施方案中，包含嵌段共聚物的胶束包含壳嵌段和芯嵌段。在一些实施方 案中，本文所述的胶束包含疏水性芯和亲水性壳。在一些实施方案中，本文所述的胶束是自 我装配的。在一些实施方案中，胶束形成在没有多核苷酸存在时进行。在一些实施方案中， 胶束形成在有多核苷酸存在时进行。在一些具体的实施方案中，本文所述的胶束是自发地 自我装配的。在一些实施方案中，胶束芯包含多个疏水性基团。在一些实施方案中，疏水性基团 在约中性PH下是疏水性的。在一些更具体的实施方案中，疏水性基团在适度酸性pH(例如 在pH约6和/或pH约5)下是更加疏水性的。在一些实施方案中，2、4、10、15、20或20个以 上疏水性基团存在于聚合物嵌段上，该聚合物嵌段与其它类似的聚合物嵌段一起可以形成 胶束芯。在一些实施方案中，疏水性基团具有约1或更高的η值。化合物的η值是其相对 亲水性-亲脂性值的度量(例如，参见Cates，L. Α.，“ Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45 :11-13(1981))。在一些具体的实施方案中，壳嵌段是亲水性的(例如约中性pH下)。在一些实施 方案中，胶束在约4. 7-约6. 8的pH下去稳定或解离。在一些情况中，本文提供了适合于给活细胞递送治疗剂(包括，例如寡核苷酸或 肽类)的胶束组合物。在一些实施方案中，胶束包含多个嵌段共聚物和任选至少一种治疗 剂。在一些实施方案中，本文提供的胶束是生物相容性的、稳定的(包括化学和/或物理稳 定的)和/或可再现合成的。另外，在一些实施方案中，本文提供的胶束装配组合是无毒性 的(例如显示低毒性)、可保护治疗剂(例如寡核苷酸或肽)净载荷(payload)免于降解、 通过天然存在的过程(例如通过胞吞作用)进入活细胞和/或在接触细胞后将治疗剂(例 如寡核苷酸或肽)净载荷递送入活细胞胞质。在一些情况中，多核苷酸(例如寡聚核苷酸) 是siRNA和/或另一种改变细胞中至少一种基因表达的'基于核苷酸'的试剂。因此，在 一些实施方案中，本文提供的胶束可用于将siRNA或肽递送入细胞。在一些情况中，细胞是 体外的，而在其他情况中，细胞是体内的(例如人体受试者)。在一些实施方案中，对有此需 要(例如有具有敲低某一基因的需要，其中该基因能够被施用的siRNA敲低)的个体给予 包含siRNA或肽的治疗有效量的胶束。在一些具体的情况中，本文所述胶束组合物可用于 或被特别设计成用于将siRNA或肽递送至个体内被特异性地靶向的无冠词修饰或细胞。定义有关本申请应理解，除非另有特别指定，否则应用的单数形式包括复数形式，且反 之亦然。即无冠词修饰或"一种(个)(a)“和"所述的(the)“均意指该词所修饰名称的 一种(个)或多种(个)。例如，“所述聚合物"或"核苷酸"可以意指一种/个聚合物 或核苷酸或多种/个聚合物或核苷酸。作为相同标记，除非也有另外特别指定或上下文中 明显表明没有这种意图，否则"聚合物"和"核苷酸"可以意指一种/个聚合物或一种/ 个核苷酸和多种/个聚合物或核苷酸。如本文所用的，如果两个部分或化合物通过任意相互作用保持在一起，作为非限制性实例，包括一个或多个共价键、一个或多个非共价相互作用(例如离子键、静力、范德 瓦尔斯相互作用、其组合等)或其组合，则它们是"结合的"。脂族或脂族基团本文所用的术语"脂族"或"脂族基团"意指烃部分，可以是 直链(即无支链的)、支链或环状(包括稠合、桥连和螺稠合的多环)并且可以是完全饱和 的或可以包含一个或多个不饱和单元，但不是芳族的。除非另有指定，否则脂族基团包含 1-20个碳原子。阴离子性单体本文所用的"阴离子性单体"或"阴离子性单体单元"是指这样 的单体或单体单元，其具有以阴离子带电荷状态存在的基团，或以不带电荷状态存在、但处 于不带电荷状态时能够变成阴离子带电荷状态(例如在除去亲电体例如质子(H+)，例如以 PH依赖性方式)的基团。在一些情况中，该基团在约生理pH下基本上带负电，但在弱酸性 PH下发生质子化并且基本上变成中性。这种基团的非限制性实例包括羧基、巴比妥酸及其 衍生物、黄嘌呤及其衍生物、硼酸、次膦酸类、膦酸类、亚磺酸类、磷酸盐/酯类和磺酰胺类。阴离子性种类本文所用的"阴离子性种类"是这样的基团、残基或分子，其以阴 离子带电荷状态存在，或以不带电荷状态存在，但处于不带电荷状态时能够变成阴离子带 电荷状态，例如在除去亲电体时(例如质子(H+)，例如以pH依赖性方式)。在一些情况中， 这种基团、残基或分子在约生理PH下基本上带负电，但在弱酸性pH下发生质子化并且基本 上变成中性。芳基或芳基基团本文所用的术语"芳基"或"芳基基团"意指具有总计5-14 个环成员的单环、双环和三环环系，其中该环系中至少一个环是芳族的，且其中该环系中的 每一个环都包含3-7个环成员。杂烷基术语"杂烷基"意指其中至少一个骨架碳原子被杂原子替代的烷基。杂芳基术语"杂芳基"意指其中至少一个环成员是杂原子的芳基。杂原子术语"杂原子"意指非氢或碳的原子，例如氧、硫、氮、磷、硼、砷、硒或硅 原子。如本文所用的，如果胶束不以与稳定的胶束相同、基本上类似或类似的方式起作 用和/或具有相同、基本上类似或类似的物理和/或化学特征，则它是"破裂的"。胶束 的"破裂"可以以任意适合的方式测定。在一种情况中，如果胶束不具有低于包含相同嵌 段共聚物并且作为在PH 7. 4水溶液或人血清中形成的胶束之流体动力学粒度的5倍、4倍、 3倍、2倍、1. 8倍、1. 6倍、1. 5倍、1. 4倍、1. 3倍、1. 2倍或1. 1倍的流体动力学粒度，则它 是"破裂的"。在一种情况中，胶束不具有低于包含相同嵌段共聚物并且在PH 7. 4水溶液 或人血清中形成的胶束之装配体浓度的5倍、4倍、3倍、2倍、1.8倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、 1.3倍、1.2倍或1.1倍的装配体浓度，则它是"破裂的"。如本文所用的，“可带电荷的种类"、“可带电荷的基团"或"可带电荷的单体 单元"是带电荷或不带电荷状态的种类、基团或单体单元。在一些情况中，“可带电荷的 单体单元"是可以通过添加或除去亲电体(例如质子(H+)，例如以pH依赖性方式)转化 成带电荷状态(阴离子性或阳离子性带电荷状态)的单体单元。除非另有说明，否则应用 的任意术语"可带电荷的种类"、“可带电荷的基团"或"可带电荷的单体单元"包括公 开"可带电荷的种类"、“可带电荷的基团"或"可带电荷的单体单元"中的任意其他用 语。作为"带电荷或可带电荷成为阴离子"或"带电荷或可带电荷成为阴离子性种类"的"可带电荷种类"是阴离子性的带电荷状态或不带电荷状态的种类或基团，但在不带电 荷状态下能够通过例如除去亲电体例如质子(H+)而被转化成阴离子性的带电荷状态。在 一些具体的实施方案中，可带电荷的种类是在约中性PH下带电荷成为阴离子的种类。应强 调的是，并非聚合物上的每一可带电荷的种类在接近该可带电荷种类的PKa(酸解离常数) 的PH下是阴离子性的，而是阴离子性和非阴离子性种类的平衡共存。属"带电荷或可带电 荷成为阳离子"或"带电荷或可带电荷成为阳离子性种类"的"可带电荷的种类"是阳 离子性的带电荷状态或不带电荷状态的种类或基团，但在不带电荷状态下能够通过例如添 加亲电体例如质子(H+)而被转化成阳离子性的带电荷状态。在一些具体的实施方案中，带 电荷的种类是在约中性PH下带电荷成为阳离子的种类。应强调，并非聚合物上的每一带电 荷的阳离子性种类在接近该带电荷的阳离子性种类的PKa(酸解离常数)的pH下是阳离子 性的，而是阳离子性和非阳离子性种类的平衡共存。本文所述的"可带电荷的单体单元" 与"可带电荷的单体残基"互换使用。本文所用的〃基本上不带电荷〃或〃电荷中和的〃包括士 10-士30mV的ζ电位 和/或存在第一数目(ζ)的可带负电荷的可带电荷种类(例如在去质子化时变成阴离子性 的酸性种类)和第二数目(0.5-ζ)的可带正电荷的可带电荷种类(例如在质子化时变成阳 离子性的碱性种类)。本文所用的"连接部分"或"连接基"是用于连接RNAi试剂例如寡核苷酸和/ 或靶向剂与嵌段共聚物的化学键或多官能(例如双官能)残基。连接部分包含任意各种化 合物，它们可以形成酰胺、酯、醚、硫醚、氨基甲酸酯、脲、胺或其他键，例如常用于亲和色谱 法中固定生物分子的键。在一些实施方案中，连接部分包含可裂解的键，例如在一些胞内参 数(例如PH或氧化还原电位)改变时不稳定和/或裂解的键。在一些实施方案中，连接部 分不能被裂解。在一些实施方案中，连接部分与RNAi试剂或靶向剂通过一个或多个共价键 连接。在一些实施方案中，连接部分通过一个或多个共价键与PH-依赖性膜去稳定化聚合 物连接。疏水性种类本文所用的"疏水性种类"(本文可与"增强疏水性的部分"互 换使用)是例如这样的取代基、残基或基团这样的部分，其在与分子例如单体或聚合物共 价连接时，能增加分子的疏水性或用作增强疏水性的部分。术语"疏水性"是描述根据化 合物在非极性溶剂与水之间的转移自由能衡量的物理特性的专门术语(Hydrophobicity regained. Karplus P. A.，Protein ScL, 1997,6 :1302-1307.)化合物的疏水性可以根据其 IogP值即分配系数(P)的对数确定，其被定义为化合物在两种不能溶混的溶剂例如辛醇和 水的混合物的两相中的浓度比。疏水性的实验测定方法和计算机辅助的IogP值计算方法 是本领域技术人员公知的。本发明的疏水性种类包括、但不限于脂族基团、杂脂族基团、芳 基和杂芳基。本文所用的〃疏水芯〃包含疏水性部分。在一些情况中，“疏水芯〃基本上不带 电荷(例如电荷是基本上净中性的)。不受权利要求中没有特别引述的理论约束，膜去稳定化聚合物可以直接或间接引 起细胞膜结构(例如内体膜)的改变(例如渗透性改变)，以便允许活性剂例如多核苷酸 (其与胶束(或其组成聚合物)缔合或与之独立地)通过这种膜结构-例如进入细胞或离 开细胞囊泡(例如内体)。膜去稳定化聚合物可以是(但不一定是)膜破裂性聚合物。膜破裂性聚合物可以直接或间接引起细胞囊泡的裂解或细胞膜破裂(例如针对大部分细胞 膜群体所观察到的)。一般而言，可以通过各种方式评价聚合物或胶束的膜去稳定化或膜破裂特性。在 一种非限制性手段中，可以通过试验评价来观察细胞膜结构改变，所述试验用于测定(直 接或间接)活性剂(例如多核苷酸)从细胞膜(例如内体膜)的释放-例如通过在对这种 膜而言是外部的环境中测定这种活性剂的存在或不存在或者这种活性剂的活性。另一种非 限制性手段包括测定红细胞溶解(溶血)_例如作为所关注细胞膜的替代试验。这种试验 可以在单一 PH值下或在一个pH值范围内进行。本文所用的"胶束"包括包含芯和亲水壳的颗粒，其中芯至少部分地、主要地或 基本上通过疏水性相互作用而保持在一起。在一些情况中，本文所用的"胶束"是多成分 纳米粒，其包含至少两个结构域，即内域或芯和外域或壳。芯至少部分地、主要地或基本上 通过疏水性相互作用而保持在一起，并且存在于胶束中心。本文所用的"胶束壳"定义为 胶束的非芯部分。‘‘ pH依赖性膜去稳定化疏水物〃是至少部分地、主要地或基本上疏水性并且以 PH依赖性方式使膜去稳定化的基团。在一些情况中，pH依赖性膜去稳定化的可带电荷的疏 水物是嵌段共聚物的疏水性聚合节段和/或包含多个疏水性种类；并且包含多个阴离子性 可带电荷的种类。在一些实施方案中，该阴离子性可带电荷的种类在约中性PH下是阴离子 性的。在另一些或可替代选择的实施方案中，该阴离子性的可带电荷种类在较低例如内体 PH下不带电荷。在一些实施方案中，使膜去稳定化的可带电荷的疏水物包含多个阳离子性 种类。该PH依赖性的膜去稳定化的可带电荷疏水物包含非肽和非脂质的聚合物骨架。如本文所用的，正常生理pH意指哺乳动物体的主要流体例如血液、血清、正常细 胞细胞溶胶等的PH。在一些情况中，正常生理pH约为中性pH，包括例如pH约7. 2-约7. 4。 在一些情况中，约中性PH是pH 6.6-7.6。本文所用的术语中性pH、生理和生理学pH是同 义词并且可互换使用。如本文所用的，如果胶束这一装配体在代表生理条件的水溶液例如在pH 7. 4的 磷酸缓冲盐水中不解离或变得不稳定，则它被描述为“稳定的”。可以通过临界胶束浓度 (CMC)定量地定义胶束的稳定性，该临界胶束浓度被定义为不稳定性发生时的胶束浓度，如 疏水性探针分子的摄取(例如芘荧光测定)或胶束大小的改变(例如根据动态光散射测量 测定)所显示的。在一些情况中，稳定的胶束是其流体动力学粒度在包含相同嵌段共聚物 并且最初在PH 7. 4水溶液(例如磷酸缓冲盐水，pH 7.4)中形成的胶束之流体动力学粒度 的约60 %、50 %、40 %、30 %、20 %或10 %范围内的胶束。在一些情况中，稳定的胶束是其形 成/装配浓度在包含相同嵌段共聚物并且最初在PH 7. 4水溶液(例如磷酸缓冲盐水，pH 7. 4)中形成的胶束之形成/装配浓度的约60 %、50 %、40 %、30 %、20 %或10 %范围内的胶 束ο如本文所用的，如果胶束不以与稳定胶束相同、基本上类似或类似的方式起作用 和/或不具有与稳定胶束相同、基本上类似或类似的物理和/或化学特征，则它是“去稳定 化的”。可以以任意适合的方式确定胶束的任意"去稳定化"。在一种情况中，如果胶束不 具有低于包含相同嵌段共聚物并且在PH 7. 4的水溶液或人血清中形成的胶束之流体动力 学粒度的5倍、4倍、3倍、2倍、1. 8倍、1. 6倍、1. 5倍、1. 4倍、1. 3倍、1. 2倍或1. 1倍的流体动力学粒度，则它是“去稳定化的”。在一种情况中，如果胶束不具有低于包含相同嵌段共聚 物并且在PH 7. 4的水溶液或人血清中形成的胶束之装配浓度的5倍、4倍、3倍、2倍、1. 8 倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1. 1的装配浓度，则它是“去稳定化的”。纳米粒如本文所用的，术语"纳米粒"意指具有低于1000纳米(nm)的直径的 任意颗粒。一般而言，纳米粒应具有小到足以使其被真核细胞摄取的尺寸。典型地，纳米粒 具有的最长直线尺寸(例如直径)为200nm或更低。在一些实施方案中，纳米粒具有的直 径为IOOnm或更低。较小的纳米粒，例如具有直径约IOnm-约200nm、约20nm_约lOOnm、约 IOnm-约50nm或10nm_30nm的纳米粒被用于一些实施方案中。寡核苷酸敲低剂如本文所用的，“寡核苷酸敲低剂"是这样的寡核苷酸种类， 它们可以通过以序列特异性方式靶向和结合胞内核酸来抑制基因表达。寡核苷酸敲低剂的 非限制性实例包括siRNA、miRNA、shRNA、切丁酶(dicer)底物、反义寡核苷酸、诱饵DNA或 RNA、反基因寡核苷酸及其任意类似物和前体。如本文所用的，术语"核苷酸"在其最广义上意指掺入或可以掺入多核苷酸(例 如寡核苷酸)链的任意化合物和/或物质。在一些实施方案中，核苷酸是通过磷酸二酯键掺 入或可以掺入多核苷酸(例如寡核苷酸)链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“ 核苷酸"意指各核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“至少一个核 苷酸"意指存在一个或多个核苷酸；在不同的实施方案中，所述一个或多个核苷酸是不连 续的核苷酸、彼此以非共价键方式结合或彼此以共价键方式结合。照此，在一些情况中，“ 至少一个核苷酸"意指一个或多个多核苷酸(例如寡核苷酸)。在一些情况中，多核苷酸是 包含至少两个核苷酸单体单元的聚合物。如本文所用的，术语"寡核苷酸"意指包含7-200个核苷酸单体单元的聚合物。 在一些实施方案中，"寡核苷酸"包括单和或/双链RNA以及单和/或双链DNA。此外，术 语〃核苷酸〃、“核酸〃、“DNA"、“ RNA"和/或类似术语包括核酸类似物，即具有被 修饰的骨架的类似物，包括、但不限于肽核酸(PNA)、锁定的核酸(LNA)、膦酰基-PNA、吗啉 代核酸或具有被修饰的磷酸酯基的核酸(例如硫代磷酸酯、膦酸酯、5' -N-亚磷酰胺键)。 核苷酸可以纯化自天然来源、使用重组表达系统产生并任选地纯化、化学合成等。本文所 用的"核苷"是描述包含单糖和碱基的化合物的术语。单糖包括、但不限于戊糖和己糖单 糖。单糖还包括通过用商素、甲氧基、氢或氨基取代羟基或通过酯化其他羟基而修饰的单糖 模拟物和单糖。在一些实施方案中，核苷酸是或包含天然核苷磷酸酯(例如腺苷、胸苷、鸟 苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷磷酸酯)。在一些实施方案中，碱 基包括天然存在于各种核酸中的任意碱基和其他模拟或类似这种天然存在碱基的修饰物。 被修饰或衍生的碱基的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿 嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫 脲苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β -D-galactosylqueosine、肌苷、N6_异戊烯 腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、 3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧 基氨甲基-2-硫脲嘧啶、0-D-mannosylqueosine、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基 尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、怀丁苷(wybutoxosine)、假 尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4_硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3- (3-氨 基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤、吡咯并嘧啶和2，6_二氨基嘌呤。核苷碱基还包 括通用核碱基例如二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。核苷酸还包括携有 标记或包含脱碱基即缺乏碱基的单体的核苷酸。除非另有指示，否则核酸序列以5' -3' 方向显示。核苷酸可以以序列特异性方式通过经Watson-Crick碱基对的氢键结合另一个 核苷酸。这种碱基对被称为彼此互补。寡核苷酸可以是单链、双链或三链的。RNAi试剂本文所用的术语“RNAi试剂“意指可以通过RNAi机制介导基因表达 抑制的寡核苷酸，并且包括、但不限于siRNA、microRNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对 称干扰RNA(aiRNA)、切丁酶底物及其前体。短干扰RNA(SiRNA)本文所用的术语〃短干扰RNA"或〃 siRNA"意指包含约 15-50个碱基对长度且任选包含0-2个单链突出端的核苷酸双链体的RNAi试剂。siRNA的 一个链包括与以互补方式与靶RNA杂交的部分。在一些实施方案中，siRNA与靶RNA的被 靶向部分之间可能存在一个或多个错配。在一些实施方案中，siRNAs通过导致靶转录物降 解而介导基因表达抑制。短发夹RNA(shRNA)短发夹RNA (shRNA)意指具有至少两个杂交或能够彼此杂交 形成双链(双链体)结构的互补性部分和至少一个单链部分的寡核苷酸。切丁酶底物“切丁酶底物"是大于约25个碱基对的双链体RNA，其为细胞中 RNase III家族成员切丁酶(Dicer)的底物。切丁酶底物被切割而产生约21个碱基对的双 链体小干扰RNAs (siRNAs)，它引起RNA干扰效应，从而通过mRNA敲低而引起基因沉默。治疗剂本文所用的术语"治疗剂"意指在对受试者、器官、组织或细胞给药时具 有治疗效果和/或引起期望的生物学和/或药理学效应的任意活性剂，包括、但不限于多核 苷酸、寡核苷酸、RNAi试剂、肽类和蛋白质。治疗有效量如本文所用的，术语治疗剂的"治疗有效量"意指在对患有或易感 疾病、障碍和/或病症的受试者给药时足以治疗、诊断、预防和/或延缓该疾病、障碍和/或 病症症状发作的用量。胶束特性本文提供了用于胞内递送诊断试剂和/或治疗剂(例如寡核苷酸、肽类等)的胶 束。在一些实施方案中，这种胞内递送是体外的；在其他实施方案中，这种胞内递送是体内 的。在一些实施方案中，本文提供的胶束被特别设计用于在受试者治疗干预的期望部位靶 向递送胶束净载荷。在一些实施方案中，本文所述的胶束具有一些期望的特性。例如，在一 些情况中稳定(例如在中性/生理PH)、而在其他情况中稳定性较低(例如在更具酸性PH 下)的胶束是期望的。因此，本文提供的材料公开了有助于这种期望胶束特性的一些参数。在一些实施方案中，本文提供的胶束在生理条件下稳定并且具有防止不期望的胶 束解离的临界胶束浓度。在其他或可替代选择的实施方案中，胶束的完整性(例如在生理 环境中)还依赖于构成胶束的嵌段共聚物的组成。因此，本文提供了一些参数(例如胶束 壳嵌段与芯嵌段中的嵌段共聚物的数均分子量比、嵌段共聚物中带电荷部分的数量等)，这 些参数被改造成提供适合于以最低毒性和/或胶束净载荷损失而有效胞内递送治疗剂的 胶束。因此，本文描述了包含胶束和与该胶束缔合的多核苷酸的组合物，所述胶束包含多个嵌段共聚物，它们缔合而使得该胶束在约中性PH下的含水介质中稳定。此外，本文所 述的胶束具有至少一种如下特性(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；(ii)约 0. 2ug/mL-约 20ug/mL 的临界胶束浓度 CMC ；(iii)在没有核酸存在下自发胶束装配；(iv)约 5nm-约 500nm 的粒度；(ν)约0. 5x IO6-约3. 6x IO6道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有至少两种上述举出的特 性。在一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有至少三种上述举出的特性。在 一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有全部上述举出的特性。在一些实施 方案中，本文所述的胶束对环境介质的高离子强度(例如0. 5Μ NaCl)稳定；和/或所述胶 束在有机溶剂浓度增加时具有增加的不稳定性，这种有机溶剂包括、但不限于二甲基甲酰 胺(DMF)、二甲亚砜(DMS)，和二噁烷。胶束组成本文提供的胶束包含多个聚合物/胶束。在一些实施方案中，所述聚合物是共聚 物。在进一步的实施方案中，所述共聚物是嵌段共聚物。嵌段共聚物是单嵌段共聚物或 多嵌段共聚物(例如二嵌段共聚物)。本文所用的术语"共聚物"表示该聚合物是两种 或更多种不同单体聚合的结果。“单嵌段共聚物"是单一聚合步骤的合成产物。术语单 嵌段聚合物包括共聚物(即一种以上类型单体聚合的产物)和均聚物(即单一类型单体 的聚合产物)。“嵌段"共聚物意指包含一个或多个组成性或单体单元的亚组合的结构。 在一些实施方案中，在聚合物中发现的单体残基被进一步修饰，以得到组成性单元。在一 些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含非脂质的组成性或单体单元。在一些实施方 案中，嵌段共聚物是二嵌段共聚物。二嵌段共聚物包含两个嵌段；这种聚合物的图示概括 表示如下[AaBbC。. . . ]ffl-[XxYyZz- · · ]n，其中每个字母表示结构单元或单体单元，并且其中 每个结构单元的下标表示该具体嵌段中该单元的摩尔分数，三个点表示每个嵌段中可以 存在更多(也可以更少)个单体单元，m和η表示二嵌段共聚物中每个嵌段的分子量。正 如图示提示的，在一些情况中，对每个嵌段分别控制每个结构单元的数量和性质。图示并 不意味着且不应解释为推定各嵌段中单体单元数或不同类型单体单元数之间何种情况下 的任何关系。该图示也不意味着描述具体嵌段内的单体单元的任意具体数量或排列。在 每一嵌段中，除非另有特别描述，否则单体单元可以以纯粹随机、交替随机、规整交替、规 整嵌段或随机嵌段结构形式排列。例如，纯粹随机结构可以具有形式(非限制性的) x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z...。非限制性的示例性交替随机结构可以具有形式(非限制性 的)X-y-X-Z-y-X-y-Z-y-X-Z...，示例性的规整交替结构可以具有形式(非限制性的) x-y-z-x-y-z-x-y-z···。示例性的规整嵌段结构可以具有如下结构(非限制性的)· · · χ-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x...，而示例性的随机嵌段结构可以具有结构(非限制性的)...χ -x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-. · ·。在梯度聚合物中，一个或多个单体单元的含 量以梯度方式从聚合物的α端值增加或减少到ω端值。在上述一般实例中无一指的是单 个结构单元或嵌段的具体并列或嵌段中的单体单元的数量或嵌段数量，也不应将它们视为 以任何方式具有或限制形成本发明胶束的嵌段共聚物的实际结构。
如本文所用的，括入单体单元的括号并非意指且并非视为意指单体单元自身形成 嵌段。即方括号内的单体单元可以以任意方式与嵌段内的其他单体单元组合，即纯粹随机、 交替随机、规整交替、规整嵌段或随机嵌段结构。本文所述的共聚物是任选、交替、梯度或随 机共聚物。在一些情况中，该共聚物主要由随机共聚物组成。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含约10-约500个嵌段共聚物/胶束。在 一些实施方案中，本文所述的胶束包含约10-约250个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方 案中，本文所述的胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，本文所 述的胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束。胶束形成和稳定性在一些实施方案中，本文提供的胶束通过在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙 醇)稀释到含水溶剂(例如磷酸缓冲盐水，pH 7.4)时嵌段共聚物自发自我缔合形成有组 织的装配物(例如胶束)而形成。在一些实施方案中，胶束形成通过直接将聚合物的干燥 形式溶于含水溶剂而发生。在一些实施方案中，自发胶束形成在没有多核苷酸或寡核苷酸 存在时发生。在一些实施方案中，本文所述的胶束在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀 释到pH约7. 4-约5. 5的含水溶剂时稳定。在一些实施方案中，本文所述的胶束在从水易 溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到PH约7. 4-约6. 8的含水溶剂时稳定。在一些实 施方案中，本文所述的胶束在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到PH约7. 4、约 7. 2、约7. 0、约6. 8、约6. 4、约6. 2、约6. 0或约5. 8的含水溶剂时稳定。在一些实施方案中， 本文提供的胶束在含水介质中稳定。在一些实施方案中，本文提供的胶束在选择的PH例如 约生理PH(例如循环人血浆pH)下、在含水介质中稳定。在一些具体的实施方案中，本文提 供的胶束在约中性pH(例如在pH约7. 4)下、在含水介质中稳定。在一些具体的实施方案 中，所述含水介质是动物(例如人)血清或动物(例如人)血浆。应理解胶束的稳定性不 限于所指定的PH，而是在最低限度包括该指定pH的pH值下稳定。在一些具体的实施方案 中，本文所述的胶束在酸性PH下基本上比在约中性pH下稳定性低。在一些更具体的实施 方案中，本文所述的胶束在PH约5. 8下的稳定性基本上低于在pH约7. 4下的稳定性。在一些具体的实施方案中，在约中性pH下，本文所述的胶束在约10ug/mL、约 50ug/mL、约 100ug/mL、约 200ug/mL 或约 250ug/mL 的浓度下稳定。在一些实施方案中，胶束对在水溶液中稀释稳定。在一些具体的实施方案中，胶 束对在生理PH(例如人体内循环血液的pH)下的稀释稳定，其中临界稳定性浓度(例如临 界胶束浓度(CMC))为约 100ug/mL-约 0. lug/mL、约 100ug/mL-约 lug/mL、约 50ug/mL_ 约 lug/mL、约50-约10ug/mL。在一些实施方案中，在生理pH下胶束的CMC低于100ug/mL、低 于50ug/mL、低于lOug/mL、低于5ug/mL或低于2ug/mL。本文所用的"胶束去稳定化"意指 形成胶束的聚合物链至少部分解聚、结构改变(例如尺寸上扩展和/或形状改变)和/或 可以形成无定形的超分子结构(例如非胶束超分子结构)。术语临界稳定性浓度(CSC)、临 界胶束浓度(CMC)和临界装配浓度(CAC)在本文中可以互换使用。在一些实施方案中，本 文所述的胶束对构成临界稳定性浓度或临界胶束浓度(CMC)的稀释稳定。在一些实施方案中，本文所述任何胶束的临界稳定性浓度或临界胶束浓度CMC在 约中性PH下约为100ug/mL-约0. lug/mL。在一些实施方案中，本文所述任意胶束的CMC在约中性 PH 下为约 80ug/mL-约 0. 2ug/mL、约 60ug/mL_ 约 0. 2ug/mL、约 40ug/mL_ 约 0. 2ug/ mL、约20ug/mL-约0. 2ug/mL或约10ug/mL-约0. 2ug/mL。在一些实施方案中，本文所述胶 束的 CMC 在约中性 pH 下为约 100ug/mL、约 90ug/mL、约 80ug/mL、约 70ug/mL、约 60ug/mL、约 50ug/mL、约 40ug/mL、约 30ug/mL、约 20ug/mL、约 10ug/mL、约 5ug/mL、约 lug/mL、约 0. 5ug/ mL 或约 0. 2ug/mL。在一些实施方案中，本文所述任意胶束在内体裂解性pH (例如pH约5)下的临界 胶束浓度或CMC比该胶束在约中性pH (例如pH约7. 4)下的CMC高大约20-倍。在一些实 施方案中，本文所述任意胶束在内体裂解性PH(例如pH约5)下的临界胶束浓度或CMC比 该胶束在约中性PH(例如pH约7. 4)下的CMC高大约10-倍。在一些实施方案中，本文所 述任意胶束在内体裂解性PH(例如pH约5)下的临界稳定性浓度或CMC比该胶束在约中性 pH(例如pH约7. 4)下的CMC高大约5-倍或约2-倍。在一些实施方案中，本文所用任意胶束在内体裂解性pH(例如pH约5)下的临界 胶束浓度或 CMC 为约 100ug/mL-约 0. 5ug/mL、约 80ug/mL_ 约 lug/mL、约 60ug/mL_ 约 Iug/ mL、约 40ug/mL-约 lug/mL、约 20ug/mL-约 lug/mL 或约 10ug/mL-约 lug/mL。在一些实施 方案中，本文所述胶束在约内体裂解性PH的CMC为约100ug/mL、约90ug/mL、约80ug/mL、约 70ug/mL、约 60ug/mL、约 50ug/mL、约 40ug/mL、约 30ug/mL、约 20ug/mL、约 10ug/mL、约 5ug/ mL、约 lug/mL 或约 0. 5ug/mL。粒度在一些实施方案中，所述胶束是纳米粒。在一些具体的实施方案中，所述胶束是 真胶束。在进一步的实施方案中，所述胶束是在不与生物活性剂缀合时具有约IOnm-约 200nm、约IOnm-约IOOnm或约30-80nm平均流体粒度的纳米粒或胶束。可以以任意方式 测定粒度，包括、但不限于凝胶渗透色谱法(GPC)、动态光散射(DLS)、电子显微镜检查技术 (例如TEM)和其他方法。在一些具体的实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，其(例如以离子方 式和/或共价方式)与生物活性剂(例如多核苷酸(例如siRNA)、诊断试剂和/或靶向 剂(例如抗体))缔合并且具有不超过约500nm、不超过约450nm、不超过约400nm、不超过 约350nm、不超过约300nm或不超过约250nm、不超过约200nm、不超过约150nm、不超过约 IOOnm或不超过约50nm的粒度。多核苷酸载荷在一些实施方案中，本文所述的胶束(例如以离子方式和/或共价方式)与1-约 10，000个多核苷酸缔合。在一些实施方案中，本文所述的胶束与约4-约5000个、约10-约 4000个、约15-约3000个或约30-约2500个多核苷酸缔合。在一些实施方案中，胶束与多 核苷酸的电荷比为约5 1-约1 1。在一些实施方案中，胶束与多核苷酸的电荷比为约 4 1、约 3 1、约 2 1 或约 1 1。聚合物结构和特性在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段。在一 些实施方案中，至少一种这种嵌段是梯度聚合物嵌段。在进一步的实施方案中，本文使用的 嵌段共聚物任选地被梯度聚合物取代(即用于胶束的聚合物是具有疏水性嵌段和亲水性 嵌段的梯度聚合物)。
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亲水性嵌段在一些实施方案中，亲水性嵌段是壳嵌段，并且例如是不带电荷的、阳离子性、聚 阳离子性、阴离子性、聚阴离子性或两性离子性嵌段。在一些实施方案中，亲水性嵌段是中 性的(不带电荷)。在一些具体的实施方案中，亲水性嵌段包含净正电荷。在一些具体的实 施方案中，亲水性嵌段包含净负电荷。在一些具体的实施方案中，亲水性嵌段为净电中性。在一些实施方案中，亲水性嵌段是包含单一单体的均聚物嵌段。在其他实施方案 中，亲水性嵌段包含多个一种或多种亲水性单体单元(例如DMAEMA、PEGMA、HPMA、丙烯酸寡 乙二醇酯、NIPAAM等中的一种或多种)。在一些实施方案中，亲水性单体单元包含亲水性基 团(例如羟基、硫氢基、PEG基或其他聚氧化烷基等或其组合)。在一些实施方案中，亲水性 单体单元基本上不能带电荷，例如意味着该亲水性单体单元在生理PH(例如pH约中性，例 如7. 2-7. 4)下基本上不带电荷。在一些实施方案中，嵌段共聚物包含5个以上、10个以上、 20个以上、50个以上或100个以上亲水性基团或种类。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有(1)中性或不带电荷(例如 基本上不带电荷)的亲水性嵌段；和( 形成胶束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)，该 胶束通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用被稳定化。在一些实施方案中，中性或不带电 荷的亲水性嵌段包含多个中性单体残基，例如PEGMA或HPMA。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有(1)阳离子性或聚阳离子 性带电荷的亲水性嵌段；和( 形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用被稳定化的胶 束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。在一些实施方案中，亲水性嵌段包含多个阳离子性 单体残基，例如DMAEMA。在一些这种实施方案中，多核苷酸与亲水性嵌段中的阳离子性种类 离子性缔合。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有(1)阴离子或聚阴离子带 电荷的亲水性嵌段；和( 形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用稳定的胶束疏水芯 的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。在一些实施方案中，阴离子或聚阴离子带电荷的亲水性嵌段 包含多个阴离子性单体残基，例如马来酸酐或丙烯酸。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有(1)两性离子或聚两性离 子带电荷的亲水性嵌段；和( 形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用稳定的胶束疏 水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。疏水性嵌段在一些实施方案中，本文所述任意嵌段共聚物的疏水性嵌段包含多个疏水性基 团、部分、单体单元、种类等。在一些实施方案中，本文所述任意嵌段共聚物的疏水性嵌段包 含多个疏水性基团、部分、单体单元、种类等和多个可带电荷的结构单元或单体单元。在一些实施方案中，嵌段共聚物包含疏水性嵌段，该疏水性嵌段包含第一种和第 二种结构单元。在一些实施方案中，第一种结构单元包含去质子化时的阴离子性种类。在 一些实施方案中，第一种结构单元在酸性PH (例如内体裂解性pH、pH低于约6. 5、pH低于约 6.0、pH低于约5. 8、pH低于约5. 7，等)下不带电荷。在一些实施方案中，第一种结构单元 如本文所述且第二种结构单元在质子化时是阳离子性种类。在一些具体的实施方案中，第 二种结构单元的PKa为约6-约10、约6. 5-约9、约6. 5-约8、约6. 5-约7. 5或任意其他适 合的pKa。
在一些实施方案中，本文所述的任意嵌段共聚物的疏水性嵌段还包含疏水性基 团、部分、单体单元、种类等。在一些实施方案中，疏水性单体单元包含疏水性基团，例如、 但不限于烷基、杂烷基、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，嵌段共聚物包含与聚合物骨架 连接并且屏蔽邻位可带电荷的结构单元(例如阴离子性种类(例如羧酸基团))的疏水性 基团，由此减少或防止胶束解离。在一些实施方案中，嵌段共聚物的疏水性嵌段包含5个以 上、10个以上、20个以上、50个以上或100个以上疏水性基团或种类。在一些实施方案中， 疏水性种类存在于阴离子可带电荷的单体单元上。在一些实施方案中，疏水性单体单元与 包含阴离子可带电荷的结构单元的单体单元之比在约中性PH下为约1 6到约1 1、约 1 5到约1 1、约1 4到约1 1、约1 3到约1 1、约1 2到约1 1。在一些实施方案中，作为非限制性实例，疏水性单体单元是甲基丙烯酸丁酯、丙 烯酸丁酯、苯乙烯等。在一些具体的实施方案中，本文使用的疏水性单体单元是衍生自 (C2-C8)烷基丙烯酸的(C2-C8)烷基酯的单体单元。在一些更具体的实施方案中，本文所述嵌段共聚物的疏水性嵌段包含多个阳离子 单体单元和多个阴离子性单体单元。在一些更具体的实施方案中，疏水性嵌段包含基本上 类似数量的阳离子和阴离子性种类(即胶束的疏水性嵌段和/或芯基本上净中性)。在一 些实施方案中，在嵌段共聚物的疏水性嵌段中存在基本上类似数量的阳离子和阴离子性种 类提供了在约中性PH下基本上为净中性的胶束疏水性嵌段和/或芯。阴离子结构单元在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阴离子结构单元，它们在生 理PH下为阴离子。在一些实施方案中，阴离子结构单元包含可质子化的阴离子性种类。在 一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阴离子结构单元且每个阴离子结构单元 是不带电荷的布郎斯台德酸单体残基(即结构单元是布郎斯台德酸的共轭碱)。在本文所 述的各种实施方案中，本文所述在生理PH下为阴离子或带负电荷的结构单元(包括，例如 一些亲水性结构单元)包含一个或多个酸性基团或其共轭碱。阴离子结构单元的非限制性 实例包括包含羧酸、磺酰胺、硼酸、磺酸、亚磺酸、硫酸、磷酸、次膦酸等和或其组合的单体残 基。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的在正常生理PH下为阴离子或带负 电荷的结构单元包括丙烯酸的单体残基、C2-C8烷基丙烯酸单体(例如甲基丙烯酸、乙基丙 烯酸、丙基丙烯酸、丁基丙烯酸等)等。当生理流体的pH约为阴离子性种类的pKa时，可带电荷种类的两种形式平衡分 布。就阴离子性种类而言，当PH是阴离子性种类的pKa时，约50%的群体为阴离子，约50% 不带电荷。PH越远离可带电荷种类的pKa，这种平衡将存在相应移动，使得在更高pH值下， 阴离子占优势，而在更低PH值下，不带电荷形式占优势。本文所述的实施方案包括在任意 PH值下的嵌段共聚物形式。在一些实施方案中，在正常生理pH下为阴离子的结构单元包含羧酸，例如、但不 限于2-丙基丙烯酸的单体残基(即从其衍生的结构单元，2-丙基丙烯酸，-CH2C ((CH2)2CH3) (COOH) - (PAA))，不过，可以作为被保护种类例如酯或游离酸而在选择的聚合过程中存在的 任意有机酸或无机酸也在本发明关注的范围内。本文所述的阴离子性单体残基或结构单元 包含阴离子带电荷或可带电荷的种类，包括可质子化的阴离子性种类。在一些情况中，阴离 子性单体残基在约中性PH下可以是阴离子性的。
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单体例如马来酸酐(Scott Μ. Henry, Mohamed Ε. H. El-Sayed， Christopher Μ. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S.Stayton " pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride)alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery" Biomacromolecules7 :2407-2414,2006)也可以用于将阴离子性种类引入疏水 性嵌段。在这种实施方案中，带负电荷的结构单元衍生自马来酸酐单体残基。阳离子结构单元在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含在生理pH下为阳离子性或带正 电荷的多个阳离子结构单元。在一些实施方案中，阳离子结构单元包含可去质子化的阳离 子性种类。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阳离子性结构单元且每个 阳离子性结构单元是不带电荷的布朗斯台德碱单体残基(即结构单元是布朗斯台德碱的 缀合酸)。布朗斯台德碱的非限制性实例包括包含二烷基氨基的单体。在一些实施方案 中，阳离子性结构单元包含丙烯酸胺、丙烯酸亚胺、环胺、环亚胺、氨基、烷氨基、胍基、咪唑 基、吡啶基、三唑基等或其组合。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的在正常 生理pH下为阳离子性的结构单元包括二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯类的单体残基(例如 DMAEMA) ο当生理流体的pH约为阳离子性种类的pKa时，可带电荷种类的两种形式平衡分 布。此外，PH越远离可带电荷种类的pKa，则这种平衡中存在相应移动，使得在更低pH值 下，阳离子形式占优势，而在更高PH值下，不带电荷形式占优势。本文所述的实施方案包括 在任意PH值下的嵌段共聚物形式。中性和两性离子性结构单元在本文所述的不同实施方案中，在生理pH下为中性的结构单元包含一种或多种 亲水性基团，例如羟基、多羟化烷基、聚乙二醇、聚丙二醇、硫醇等。在一些实施方案中，作 为非限制性实例，本文使用的在正常生理PH下为中性的亲水性结构单元包括聚乙二醇化 丙烯酸、聚乙二醇化甲基丙烯酸、羟基烷基丙烯酸、羟基烷基链烷丙烯酸的单体残基(例如 HPMA)等。在本文所述的不同实施方案中，在生理pH下为两性离子性的结构单元包含在 生理PH下为阴离子性的或带负电荷的基团和在生理pH下为阳离子性的或带正电荷的 基团。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的、在正常生理PH下为两性离 子性的亲水性结构单元包括在生理PH下包含磷酸根基团和铵基的单体残基，例如在US 7，300，990(将该文献的这种公开内容引入本文)等中举出的。嵌段共聚物组成在一些实施方案中，第一种结构单元在去质子化时是阴离子性种类，第二种结构 单元在质子化时是阳离子性种类，且在约中性PH下阴离子性种类与阳离子性种类之比为 约1 10到约10 1、约1 6到约6 1、约1 4到约4 1、约1 2到约2 1、约 1 2到3 2或约1 1。在一些实施方案中，第一种可带电荷的结构单元与第二种可带 电荷的结构单元之比为约1 10和约10 1、约1 6和约6 1、约1 4和约4 1、 约1 2和约2 1、约1 2和3 2或约1 1。在一些实施方案中，嵌段共聚物中存在的可带电荷成为阴离子性种类、基团或单 体单元的结构单元、基团或单体单元是在约中性pH(例如在pH约7. 4)下至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%或至少95%带负电荷的种类、基团或单体单元。在一 些具体的实施方案中，这些可带电荷的种类、基团或单体单元在约中性PH下因失去H+而使 阴离子性种类带电荷。在其他或可替代选择的实施方案中，聚合物中存在的阴离子性种类、 基团或单体单元可带电荷的可带电荷种类、基团或单体单元是在适度酸性PH(例如pH约 6. 5以下；约6. 2以下；约6或以下；约5. 9以下；约5. 8以下；约5. 7以下；约5. 6以下；约 5.5以下；约5.0以下；或约内体裂解性pH)下至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %或至少95 %中性或不带电荷的种类、基团或单体 单元。在本文所述嵌段共聚物的具体实施方案中，每一结构单元存在于不同单体单元 上。在一些实施方案中，第一种单体单元包含第一种可带电荷的种类。在其他或可替代选 择的实施方案中，第二种单体单元包含第二种可带电荷的种类。在其他或可替代选择的实 施方案中，第三种单体单元包含第三种可带电荷种类。示例性结构在一些实施方案中，嵌段共聚物(例如膜去稳定化的嵌段共聚物)具有化学式I
权利要求
1.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌 段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶 束在约中性PH下、在含水介质中稳定，(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL ；(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；(iv)重均分子量为约0.5x IO6-约3. 6x IO6道尔顿；(ν)粒度为约5nm-约5OOnm ；禾口(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1-约1 10;和( )多分散性指数为约1. 0-约2. 0。
2.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与该胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个 嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得 胶束在约中性PH下、在含水介质中稳定，(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；(ii)在0.5M NaCl中的临界胶束浓度CMC在约0. 2ug/mL_约20ug/mL ；(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；(iv)重均分子量为约0.5xl06-约3. 6xl06道尔顿；和(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1-约1 10;和(ii)多分散性指数为约1.0-约2. 0。
3.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌 段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶 束在约中性PH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)缔合数量为约10-约100个链/胶束；(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL ；(iii)粒度为约5nm-约500nm。
4.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌 段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶 束在约中性PH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1 1-约1 10;(ii)多分散性指数为约1.0-约2. 0 ；和(iii)重均分子量为约0. 5xl06-约 3. 6xl06g/mol。
5.权利要求1或2任一项的组合物，其中所述胶束具有三种或更多种其子段(i)、 (ii)、(iii)和(iv)的特征。
6.权利要求1或2任一项的组合物，其中所述胶束具有全部其子段(i)、(ii)、(iii) 和(iv)的特征。
7.权利要求1或3任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有全部其子段(i)、(ii)和 (iii)的特征。
8.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段 的数均分子量Mn之比在约1 1-约1 10。
9.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段 的数均分子量Mn之比在约1 1.5-约1 6。
10.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段 的数均分子量Mn之比在约1 2-约1 4。
11.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束ο
12.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束ο
13.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束ο
14.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约0.2ug/ mL-约 20ug/mLo
15.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约0.5ug/ mL-约 10ug/mLo
16.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约lug/mL-约 5ug/mL。
17.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段 的数均分子量Mn之比在约1 1.5-约1 6;且所述胶束(i)包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束；和( )具有约0. 5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。
18.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段 的数均分子量Mn之比在约约1 2-约1 4;且所述胶束(i)包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束；和 ( )具有约lug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。
19.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约2. 0的多分散 性指数。
20.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约1. 7的多分散 性指数。
21.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约1. 4的多分散 性指数。
22.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约0.5xl06-约3. 6xl06的聚集 分子量Mw。
23.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约0.75xl06-约2. OxlO6的聚集 分子量Mw.
24.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约1.OxlO6-约1. 5xl06的聚集分子量Mw.
25.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约5nm-约500nm的粒度。
26.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约IOnm-约200nm的粒度。
27.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约20nm-约IOOnm的粒度。
28.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约1-约 10，000。
29.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约4-约 5，000。
30.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约15-约 3，000。
31.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约30-约 2，500。
32.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含 多个阳离子单体单元，亲水性嵌段中的阳离子性种类与多核苷酸离子型缔合。
33.权利要求34的组合物，其中所述阳离子单体单元是阳离子单体残基、不带电荷的 布朗斯台德碱单体的残基或其组合。
34.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述多核苷酸是RNAi试剂或siRNA。
35.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述多核苷酸不在胶束芯内。
36.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的阴离子性单体单元。
37.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的不带电荷的单体单元。
38.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的两性离子型单体单元。
39.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含多个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
40.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含至少20个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
41.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含至少15个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
42.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含至少10个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
43.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包 含至少5个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
44.上述权利要求中任一项的组合物，其中包含聚合物生物缀合物，其包含与所述多个 嵌段共聚物的一个或多个共价偶合的一个或多个多核苷酸。
45.权利要求44的组合物，其中所述多核苷酸是siRNA。
46.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含 多个具有能够质子化的阴离子性种类和多个疏水性种类的单体单元。
47.权利要求46的组合物，其中所述阴离子性单体单元是阴离子性单体的残基、不带 电荷的布郎斯台德酸单体的残基或其组合。
48.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含 多个衍生自具有疏水性种类的可聚合单体的单体单元。
49.上述权利要求任一项的组合物，其中所述一种或多种嵌段共聚物是膜去稳定化的 嵌段共聚物。
全文摘要
一种组合物，其中包含聚合物胶束和缔合的多核苷酸。
文档编号A61K31/7105GK102076328SQ200980122892
公开日2011年5月25日 申请日期2009年5月13日 优先权日2008年5月13日
发明者A·J·肯沃汀, A·S·霍夫曼, A·帕沙尔, A·高尔, C·迪亚布, M·普里福, P·S·司泰同, P·德, P·约翰逊, R·欧沃瑞尔 申请人:华盛顿大学, 菲泽尔克斯公司