用于细胞内药物递送的Fas(Apo-1，CD95)靶向平台的制作方法

专利名称：用于细胞内药物递送的Fas(Apo-1，CD95)靶向平台的制作方法
用于细胞内药物递送的FaS(Apo-1，CD95)靶向平台
本发明涉及药物递送领域。更具体地，本发明涉及靶向递送运载体(delivery vehicle)或药物载体，并涉及其在治疗和诊断应用中的用途。优选地，根据本发明的运载体或载体对其靶细胞具有高度特异性并可提供药学活性剂或可检测标记的有效的细胞内递送。在一个实施方案中，本发明提供了将药学活性剂或可检测标记特异性地递送至Fas配体表达细胞的运载体。本发明延伸到组合物及在治疗中特别是在瘤和神经障碍的治疗或预防中的用途。
当前，大多数药物为全身施用。对于大多数治疗剂，大部分药物通过全身清除从身体中排除，同时仅小部分药物达到靶器官或靶组织。而且，健康组织和器官对施用的药物的全身暴露可导致严重毒性。毒性的危险可被药物的高剂量和大容量加重，而高剂量和大容量是克服差的生物利用度并在受治疗者中提供充足的分布所需要的。相反，靶向药物递送设法将药物聚集在目标组织或器官中，而最小化全身药物暴露。然而，用于靶向药物递送的现有的系统并不理想，且当前的药物治疗策略不足以解决与全身药物暴露相关的毒性问题。这在癌症治疗领域中尤其如此，癌症治疗中，细胞毒性抗癌药物可损害健康组织而引起严重的副作用。因此，对选择性地将药物递送至靶组织或靶器官的靶向药物递送策略存在迫切需要。这样的策略应当通过增加药物的治疗指数而同时最小化药物相关毒性的危险而改善药物治疗的效力。
此外，增加的基因组学、表观基因组学和蛋白组学知识结合新治疗策略诸如RNA 干扰(Mello&Conte，2004 ;Grimm，2009)或基于肽的细胞内调质(Sawyer TK, 2009)改变着治疗疾病的潜力。特别地，希望制造能够对细胞内靶标起作用的小分子或较大生物药物，以便例如选择性地治疗单独细胞类型或破坏如癌症中发现的异常细胞。然而，细胞内活性药物候选者由于其不能穿过细胞膜以与其细胞内靶分子相互作用而通常未能成为药学上有用的。细胞膜是脂双层，其通常作为隔离细胞内环境与细胞外(或外部)环境的半渗透屏障。当前的用于运输药物穿过细胞膜的递送系统不像其可能的那样有效和可靠。因此，对有效的细胞内药物递送系统存在需求。
根据本发明的第一个方面，提供了用于将药学活性剂或标记递送至细胞的递送运载体，包括特异性针对Fas配体的配体结合部分和药学活性剂或标记的载体。
递送运载体可以是包括特异性针对Fas配体的配体结合部分和药物载体的药物递送运载体。配体结合部分可将根据本发明的递送运载体靶向于Fas配体表达细胞。因此， 递送运载体可提供药学活性剂、标记或药物的细胞内递送。药学活性剂、标记或药物优选地不是能够特异性结合Fas配体的剂。
根据本发明的载体可以是微粒、纳米颗粒、微胶囊、微球、胶束或脂质体。优选地， 载体是微粒。微粒可具有达 0. 01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、0. 2 μ m、0. 5μπ 、1μπ 、2μπ 、5μπ 或 10 μ m的平均直径。微粒可具有在0. 1 μ m和10 μ m之间的平均直径，优选地在0. 2 μ m和 5 μ m之间，更优选地在0. 3 μ m和2 μ m之间，更加优选地在0. 4 μ m和1. 5 μ m之间，且最优选地在0. 5 μ m和2 μ m之间。微粒可包括乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)基质。
特异性针对Fas配体的运载体的配体结合部分可包括Fas受体或其衍生物。其还可以是全长Fas蛋白或其片段。配体结合部分可包括Fas蛋白的胞外域或其片段或由Fas 蛋白的胞外域或其片段组成，且优选地包括Fas蛋白的配体结合域或由Fas蛋白的配体结合域组成。运载体的配体结合部分可以是肽、蛋白质、适体、抗体、抗体片段、融合蛋白或嵌合蛋白质。配体结合部分可以是Fas蛋白或其片段，与免疫球蛋白的可结晶片段区(Fe区) 融合以形成嵌合融合蛋白，即Fas-Fc。优选地，免疫球蛋白是人免疫球蛋白，诸如IgGl。运载体可包括特异性针对Fas配体的多个配体结合部分，且所述多个配体结合部分的每一个可以是前述实例的任何一个。
配体结合部分或每个配体结合部分可以为任何起源，但优选是人类或鼠类或其组I=I O
配体结合部分或每个配体结合部分可通过表面吸收(surfaceabsorption)、吸附、 化学轭合(chemical conjugation)或基质掺入而与载体偶联(特别是微粒时)，或共价地或非共价地与载体缔合(尤其是当载体是微粒时)。配体结合部分或每个配体结合部分可通过连接分子与载体偶联。连接分子可以是免疫球蛋白的可结晶片段区(Fe)，优选人免疫球蛋白，诸如IgGl。
可选择地，连接系统诸如抗生物素蛋白-生物素可用于将特异性针对Fas配体的配体结合部分间接地与载体偶联。因此，连接分子可以是抗生物素蛋白或生物素。特异性针对Fas配体的配体结合部分可被生物素化并与抗生物素蛋白包被的载体表面偶联。另一个连接分子可以是葡萄球菌蛋白A。
在优选的实施方案中，药学活性剂、标记或药物连接到载体，或容纳或包封于载体，优选地用于在靶细胞处或靶细胞内释放。
在本发明的第一个方面的特别优选的实施方案中，递送运载体是含有药学活性物质的微粒，其中微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价或非共价缔合。
药学活性剂可以是蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、多糖、脂质、小分子药物或任何其它生物活性物质。药学活性剂可在细胞内起作用，或可特异性针对靶细胞内的组分。药学活性剂可以是细胞毒性剂或细胞抑制剂。药学活性剂还可包括细胞毒性放射性核素、化学毒素或蛋白毒素。优选地，药学活性剂是抗癌剂，尤其是阿霉素或紫杉醇。
标记可以是荧光标记，放射性核素或造影剂。因此，标记可以是可检测标记或成像标记。
药学活性剂、标记或药物可容纳或包封于载体，特别是当载体为微粒时。活性剂、 标记或药物可通过化学轭合而被束缚于载体或微粒或被束缚在载体或微粒中，或物理地掺入到形成载体的材料的基质中。
在第二个方面中，本发明提供了用于药物、优选地用于治疗目的的根据本发明的第一个方面的递送运载体。在此方面中，优选的是，药学活性剂、标记或药物连接到载体，或容纳或包封于载体。
治疗目的可以是治疗与瘤或神经障碍相关的疾病或医学病症。
在另外的方面中，本发明还提供了治疗疾病或医学病症的方法，包括向受治疗者施用根据本发明的第一个方面的递送运载体，其中递送运载体包括有效量的药学活性剂或药物。
疾病或病症可以是脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜内肿瘤、卵巢肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌或肿瘤细胞中表达Fas配体的癌症类型或肿瘤。优选地，疾病或病症是卵巢癌或成神经管细胞瘤。
疾病或病症可以是神经系统疾病，包括运动神经元病、阿尔茨海默病、帕金森病、 神经性疼痛综合征和周围神经或脊髓损伤。
根据本发明的另外的方面，提供了用于诊断法中的根据本发明的第一个方面的递送运载体，诊断方法包括检测Fas配体表达细胞，其中标记连接到载体，或容纳或包封于载体。
在另一个方面中，本发明提供了诊断方法，诊断方法包括通过向受治疗者施用根据本发明的递送运载体来检测Fas配体表达细胞，其中标记连接到载体，或容纳或包封于载体。
优选地，诊断法或诊断方法是诊断瘤或神经障碍的方法。
本发明还提供了包括根据本发明的递送运载体和一种或多种生理学或药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂的药物组合物。这样的组合物可应用于本文所述的任何用途和方法中。
在另一个方面中，本发明提供了用于制备根据本发明的递送运载体的方法，包括形成容纳或包封药学活性剂、标记或药物的微粒和将特异性针对Fas配体的配体结合部分连接到所述微粒的步骤。
发明人已惊奇地发现，Fas/Fas配体系统可增强微粒的吸收(uptake)。利用此方法，发明人已表示，药物可在与Fas偶联的微粒中递送到靶细胞中。这种分子靶向作用方法增强了 Fas配体表达细胞对微粒的细胞内吸收。
在此专利申请中，发明人首次描述了也称作Apo-I，⑶95)、Fas的融合蛋白 (例如嵌合融合蛋白与免疫球蛋白的可结晶片段区(Fe区)融合的!^s O^asFc)等等)、和 /或能够复制Fas的作用的等效部分(例如肽、蛋白质、适体等等)在修饰药物递送颗粒(例如乳酸-乙醇酸共聚物基质(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚-ε -己内酯(PCL)、聚羟丁酸酯(PHB) 或可生物降解的壳聚糖微球、基于硅的颗粒、聚合电解质胶囊、脂质体等等)以增强其吸收和对某些细胞的特异性中的新颖用途，所述细胞包括神经元、癌细胞和/或一系列Fas配体 (FAsL, AP0-1L, CD95L)表达细胞。从本发明中，发明人还描述了 Fas (Αρο-l，CD95)、Fas的融合蛋白(例如i^asFc等等)和/或能够复制Fas的作用的等效部分(例如肽、蛋白质、适体等等)作为用于治疗递送的药物轭合物(drug conjugate)的潜在用途。因此，本发明能够将药物和其它物质细胞内递送至生物细胞，并可应用于生物医学研究和治疗学领域。
虽然在非免疫组织中已广泛研究了 Fas/Fas配体系统的凋亡和各种新兴作用，就发明人的知识所及，现有技术不存在I^as(Apc)-I, CD95)修饰的药物负载微粒(例如PLGA、 PCL、聚合电解质胶囊或脂质体)或i^s(Apo-l，CD95)轭合的药物靶向并增加药物在细胞中的细胞内吸收的用途。而且，本发明是非显而易见的，且在向遭受癌症、神经系统病症和其它疾病的患者递送治疗制剂时具有相当大的工业适用性，和/或作为生物医学科学和药物开发中的研究工具。
细胞内药物递送系统降低了远端部位的不希望的副作用，且许多技术处于考察之中，包括例如靶向纳米颗粒(Farokhzad等人，2006 ；Gu等人，2009 ；Faraii等人，2009)。还可能利用微粒进行分子内药物递送，优点是更大的负载容量以增加药物效力和持续释放。
然而，考察利用微粒的药物递送的研究是有限的，且其基本上靶向专门的吞噬细胞诸如巨噬细胞(Walter等人，2001 Jrandhormeur等人，2009)。发明人及其他人已研究了非专门的吞噬细胞(即神经元)的吞噬能力，并说明了直径在半微米以上的生物颗粒和合成颗粒的摄取^sselens等人，2004 ；Bowen等人，2007)。虽然对于神经元的这种性质没有被广泛地认知，但是很好地证明了很多非专门的吞噬细胞能够摄取相对大的颗粒，包括成纤维细胞和上皮细胞(Rabinovitch，1995)。进一步理解介导非专门吞噬细胞的吞噬作用的机制可帮助设计靶向这些细胞的药物递送颗粒。例如，最近显示，对于海马神经元可通过特异性细胞表面受体诸如端脑素(telenc印halin)来调节吸收(hselens等人，2004 ；专利公布号 W0/2006/030013 iThe modulation of phagocytosis in neurons (神经元吞it作用的调节)’)。
令发明人惊奇的是，他们发现先前未知参与吞噬作用的Fas配体能够实现细胞内吸收Fas和Fas轭合物。在本发明中，Fas (Apo-1, CD95)蛋白被用于基于药物负载微粒的修饰的细胞内药物递送系统。FaS、FaS的融合蛋白和/或能够复制Fas的作用的等效部分对药物负载颗粒的表面修饰增强某些细胞对微粒的内化，所述细胞包括神经元、癌细胞和/ 或一系列Fas配体(FasL、AP0-lL、CD95L)表达细胞。
发明人具有显示以下的有效数据(如实施例中所说明)与未修饰的颗粒或用其它配体修饰的那些相比，Fas (Apo-1,⑶卯)表面修饰的微粒优先地被许多细胞类型摄取。发明人还表明开发成携带剂的微粒(agentbearing microparticle)的生物可降解的 Fas (Apo-1,⑶95)表面修饰的基于PLGA的微粒被细胞吸收并将负载的剂递送至研究细胞内。如实施例中所说明，发明人已表明微粒通ai^s/Fas配体辅助的吞噬作用的有效细胞内吸收，微粒包括约0. 5-1. 5μπι平均直径的那些。此外，实施例显示了当生物细胞吸收负载抗癌药物的微粒时的功能效应。因此，实施例中所列的数据说明了基于利用Fas(Ap0-l， ⑶95)的治疗平台的新颖性、创造性和有用性。
因此，根据本发明的递送运载体可用于显著地降低施用的药物的总量，同时增加其靶位处的药物浓度。因此，递送运载体可用于改善细胞毒性药物和其它药物在许多疾病诸如瘤和神经障碍中的作用，潜在地增加药物效力，同时降低毒性。递送运载体还可提供对目前认为不可能开发的有希望的治疗剂的递送选择。在这点上，其中药学活性剂或药物被包封于载体或微粒的本发明的实施方案是特别有效的，因为该实施方案降低了直到到达其靶标时才可成为生物学上可利用的剂或药物的量。
如本领域技术人员所知，Fas (也称作Apo_l，⑶卯)是TNF/NGF受体超家族的成员，并表达为细胞膜受体或为可溶性形式。人i^s(Apo-l，CD95)基因的全序列和转录物描述于关于人类和一些其它活物种的Ensembl数据库中(http://www. ensembl. org/Homo_ sapiens/Gene/Summary ？ g = ENSG00000026103)。鼠 Fas 基因的全长序列和转录物描述于关于小鼠基因组(小家鼠(Musmusculus))的Ensembl数据库中(http//www. ensembl. org/Mus_musculus/Gene/Summary ？ db = core ；g = ENSMUSG00000024778)并描述于 Watanabe-Fukunaga等人1992中。Fas在选择的细胞中通过与其配体Fas配体(FasL)(也被称为Apo-IL和CD95L)结合而介导凋亡的诱导。Fas配体是TNF超家族成员，且在选择的细胞中与Fas结合后诱导程序性细胞死亡。关于凋亡，Fas/Fas配体系统已被广泛地研究 (Nagata, 1997)，配体系统的失调与免疫稳态的破坏有关(Nagata和Suda，1995 ；Lettau等人，2008)。然而，超越了免疫系统组织中的单一作用，有报告显示Fas/Fas配体系统在Fas和Fas配体由非免疫细胞表达的不同的组织诸如中枢神经系统中的作用(Choi和 Benveniste，2004)。这包括在例如帕金森病(Landau等人，2005)和阿尔茨海默病^thell 等人，200 、控制神经元中分支(^iliani等人，2006)以及脊髓损伤中的神经保护(Ackery 等人，2006)中的新颖的作用。
此外，存在一个有力的例子，在包括中枢神经系统(Choi和Benveniste，2004)、眼睛(Ferguson 和 Griffith，2006)和肿瘤(0，Connell 等人，2001 ；Ryan 等人，2005)的某些组织或器官的细胞中Fas配体的表达通过实现活化的Fas阳性免疫细胞的杀死而赋予这些组织或器官免疫赦免状态(FlUgel等人，2000 ；Green和Ferguson，2001)。表达Fas配体的肿瘤细胞包括人肺癌，显示为能够在共培养实验中杀死T细胞(Mehans等人，1997)；如果向培养物中加入融合蛋白i^asFc，这种能力被抑制。表达Fas配体的肿瘤细胞还包括脑肿瘤诸如成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤(Gratas等人，1997, Weller等人，1998)，结肠癌 (0'Connell等人，1998)，其中体内转染引起的Fas配体下调导致归因于肿瘤浸润淋巴细胞数量增加的肿瘤尺寸减小(Ryan等人，200 ，和卵巢癌(Abrahams等人2003)，其中Fas配体的诱导增加了 T淋巴细胞的凋亡(Meng等人，2004)。
载体或微粒可包括选自由以下组成的组的聚合物聚烷撑(polyalkylenes)、聚碳酸酯、聚对二氧杂环己酮、聚酐、多羟基酸、聚延胡索酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚原酸酯、聚羟丁酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate)、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚芳酯、聚碳酸酯、聚延胡索酸丙烯酯、聚羟基链烷酸酯、聚缩酮、聚酰胺酯、聚羟基戊酸酯、聚原碳酸酯(polyorthocarbonate)、聚乙烯吡咯烷酮、聚草酸亚烷酯(polyalkylene oxalate)、 聚琥珀酸亚烷酯(polyalkylene succinate)、聚苹果酸、聚甲基乙烯醚和聚马来酸酐。
载体或微粒可包括PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物)基质、PLA(聚乳酸)、 PCL(聚-ε-己内酯)或PHB(聚羟丁酸酯)或为可生物降解的壳聚糖微球、硅或基于硅的颗粒、聚合电解质胶囊、树枝状聚合物或脂质体。载体或微粒可以是非聚合的。优选地，微粒包括PLGA基质。
可通过在体外与任何合适的培养基孵育来测定或检查根据本发明的微粒的生物可降解性。还可通过例如皮下地或肌肉内地胃肠外注射微粒和作为时间的函数对组织进行组织学检查来检查生物可降解性。胃肠外施用后，生物可降解的微粒可在体内溶解以最终形成内源性物质，例如乳酸。
可通过例如皮下地或肌肉内地胃肠外施用微粒和对组织进行组织学评价来检查根据本发明的微粒的生物相容性。
关于微粒的大多数研究考虑了在乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)基质中配制的药物。PLGA是由包括美国FDA(食品与药品管理局)的管理者批准用于临床使用的生物可降解的聚合物，并通常用于矫形外科植入物和全身药物递送贮藏系统(例如Trelstar 、 Lupron Depot 、Ri sperdal Consta )。通常在合成过程中将包括生物活性蛋白质 (Giteau等人，2008)和核酸(Patil和Panyam，2009)的药物负载入PLGA微粒。此外，PLGA 药物载体可用合适的配体来表面官能化以便通过简单吸附或化学轭合来增加其靶标特异性。Farolchzad及同事Q006)示例了这样的方法，该方法利用官能化至多西他奇负载的聚乙二醇PLGA纳米颗粒的适体以便靶向前列腺癌细胞。还可将用于分子内递送的药物放入其它类型的生物可降解微粒中，包括聚-ε-己内酯(Sinha等人，2004)和多种系统诸如聚合电解质微胶囊(SuWiorukov等人，2007 ；Mufioz Javier等人，200 或脂质体(Huwyler 等人，2008)。
药学活性剂可以是抗肿瘤剂、抗生素、抗炎剂、抗组胺剂、镇静剂、肌肉松弛剂、抗癫痫药、抗抑郁剂、抗过敏剂、支气管扩张药、强心剂、抗心律不齐药、血管扩张剂、抗糖尿病剂、抗凝血剂、止血剂、麻醉剂和类固醇。
药学活性剂可以是细胞毒性药物、细胞抑制药物或其它药物。细胞毒性药物、细胞抑制药物或药物可以是钼类(衍生物)和紫杉酚类。细胞抑制剂或药物可选自由例如顺钼、 沙钼、奥沙利钼、卡钼、奈达钼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、马法兰、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、甲氨喋呤(methrexat)、诺龙、氨鲁米特、甲羟孕酮、甲地孕酮、丙卡巴胼、多西他奇、紫杉醇、表鬼臼毒素、鬼臼毒素、长春新碱、多西他奇、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、托泊替康、博来霉素、吉西他滨、氟达拉滨和5-FUDR组成的组。优选地，生物活性剂是抗癌剂，尤其是阿霉素或紫杉醇。
细胞毒性核素或放射治疗同位素可以是^-放射同位素，诸如”1(、211121咕士、 213Bi、212pb、224Ra或223Ra。可选择地，细胞毒性放射性核素可以是β-放射同位素，诸如186他、 188MumLiu9°Y、131I、OTCu、64Cu、153Sm或166Ηο。可选择地，细胞毒性放射性核素可放射俄歇电子和低能量电子并包括同位素1251、1231或77Br。
合适的可检测标记或成像标记包括但不限于荧光分子诸如由Molecular Probes (荧光探针和研究产品手册)所描述的那些，诸如若丹明、荧光素(诸如异硫氰酸荧光素(FTIC))、德克萨斯红、吖啶橙、Alexa Fluor (各种)、别藻蓝蛋白、7-氨基放线菌素 D、Β0Β0-Ι、BODIPY(各禾中)、Calcien、Calcium Crimson、Calcium green、Calcium Orange、 6-羧基若丹明 6G、Cascade blue、Cascade yellow、DAP I, DiA、DiD、Dil、DiO、DiR、ELF 97、曙红、ER Tracker Blue-White、EthD-I、菲啶溴红、Fluo-3、Fluo4、FMl-43 > FM4-64、 Fura-2、Fura RecUHoechst 33258、Hoechst 33342、7_ 羟基 _4_ 甲基香豆素、Indo-1、 JC-I、JC-9、JOE 染料、丽丝胺若丹明 B、荧光黄 CH、LysoSensor Blue DND-167、LysoSensor Green、LysoSensorYellow/BIu> Lysotracker Green FM> Magnesium Green、Marina Blue、Mitotracker Green FM> MitoTracker Orange CMTMRos> MitoTracker RedCMXRos、 Monobromobimane,NBD胺、NeruoTrace 500/525 green、尼罗红(Nile red)、Oregon Green, Pacific Blue、POP-I、碘化丙碇(Propidiumiodide)、若丹明 110 (Rhodamine 110)、若丹 BJIiL (Rhodamine Red)、 R-Phycoerythrm> Resorfm、 RH414> Rhod^^^Bj^ (Rhodamine Green)、若丹明 123 (Rhodamine 123)、ROX 染料、Sodium Green、SYTO blue (各种)、SYTO green (各种)、SYTO orange (各种)、SYTOX blue、SYTOXgreen、SYTOX orange、四甲基若丹明 B (Tetramethylrhodamine B)、TOT-I、TOT-3、X-rhod-l、YOYO-I 或 Y0Y0-3。
另外，放射性核素可用作成像剂。合适的放射性核素可包括i^anhFedl)、 Cu(II)、Mg(II)、Ca(II)，和Si(II)、铟、镓及锝的放射性种类。其它合适的造影剂可包括在顺磁Tl加权或T2加权的MRI造影剂中通常用于螯合作用的金属离子，并包括二价和三价阳离子诸如铜、铬、铁、钆、锰、铒、铕、镝和钬。可被螯合并用于放射性核素成像的金属离子可包括金属诸如镓、锗、钴、钙、铟、铟、铷、钇、钌、钇、锝、铼、钼、铊和钐。另外，已知在中子俘获放射治疗中有用的金属离子包括硼和具有大核截面的其它金属。合适的也可以是在超声造影组合物和χ-射线造影组合物中有用的金属离子。其它合适的造影剂的实例可包括不透射线的气体或气体放射化合物。
可利用本领域中技术人员已知的标准成像技术或检测技术检测Fas配体表达细胞。例如，显微术、流式细胞术、医学超声波检查法、放射照相术(诸如投射放射照相术和荧光检查法)、核医学显像(诸如闪烁照相机)、核磁共振成像(MRI)、光声成像、数字红外成像温度记录法或断层摄影术。
有很多微胶囊化技术，其在不同的条件下可产生多种颗粒类型和尺寸。方法通常涉及通过改变温度、蒸发溶剂或加入化学交联剂来固化乳化的液态聚合物小滴。
如果微胶囊化过程未产生具有均勻尺寸范围的颗粒，那么可利用标准技术诸如筛选或过滤来分离颗粒以产生具有希望尺寸范围的一群颗粒。所有颗粒通过标准技术以粒度分布的方式表征，标准技术诸如光学显微术、库尔特计数仪(Beckman Coulter)、动态光散射(Malvern Zetasizer)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)，和准弹性光散射(QELS)。本发明的微粒可具有达 0.01 μ m、0. 05μπι、0. 1 μ m、0. 2 μ m、0. 5 μ m、1 μ m、2 μ m、 5μπι或10 μ m的平均直径。
通常的微胶囊化技术包括界面缩聚、喷雾干燥、热熔微胶囊化，以及相分离技术 (溶剂去除和溶剂蒸发)。这样的技术描述于US2001020011,Mathiowitz和Langer 1987 ； Mathiowitz，等人，1987，1988，1990，1992 ；Benita,等人，1984 中。
界面缩聚可用于以下列方式微胶囊化核心材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)。将一种单体和核心材料溶解于一种溶剂中。将第二单体溶解于与第一溶剂不混溶的第二溶剂(通常是含水的)中。通过搅拌将第一溶液悬浮于第二溶液中而形成乳状液。乳状液稳定后，向水相中加入引发剂，在乳状液的每个小滴的界面处引起界面缩聚。
喷雾干燥通常是用于制备1-10微米尺寸的微球的过程，其中待容纳或包封的核心材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)分散于或溶解于聚合物溶液(通常是含水的) 中，通过由压缩气体流驱动的微粉化喷嘴抽吸溶液或分散相，并将得到的气溶胶悬浮于加热的空气气旋中，使溶剂从微滴中蒸发。固化的颗粒进入第二室并放入收集瓶中。
热熔微胶囊化是向熔化的聚合物中加入核心材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)的方法。在已加热至聚合物熔点以上10°c的聚合物的非溶剂(通常是基于油的) 中，这种混合物悬浮为熔化的小滴。通过剧烈搅拌维持乳状液，同时将非溶剂浴迅速冷却至聚合物的玻璃转变以下，使熔化的小滴固化并包裹核心材料。由这种技术产生的微球的直径尺寸范围通常从50微米至2毫米。
在溶剂蒸发微胶囊化时，聚合物通常溶解于与水不混溶的有机溶剂中，并向聚合物溶液中加入待容纳或包封的材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)，所述聚合物溶液为有机溶剂中的悬浮液或溶液。通过向剧烈搅拌的水(通常含有表面活性剂以稳定乳状液)的烧杯中加入这种悬浮液或溶液而形成乳状液。蒸发有机溶剂，同时继续搅拌。蒸发导致聚合物沉淀，形成含有核心材料的固体微胶囊。
一种可选择的溶剂蒸发过程涉及利用微筛(microsieve)。聚合物通常溶解于与水不混溶的有机溶剂中，并向聚合物溶液中加入待容纳或包封的材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)，所述聚合物溶液为有机溶剂诸如二氯甲烷中的悬浮液或溶液。然后，通过PTFE过滤器过滤此悬浮液或溶液。此后，通过微筛膜(诸如Nanomi BV，荷兰)使聚合物在含有乳化剂的水溶液中乳化，该微筛膜是沿着表面具有均勻孔隙的微制造膜。使得到的乳状液在室温下搅拌至少三小时以蒸发溶剂。通过过滤浓缩变硬的微球并重复洗涤。随后， 将颗粒冷冻干燥并低温下(例如在-20°C下)存储直到评价。
在溶剂去除微胶囊化时，聚合物通常溶解于与油混溶的有机溶剂中，并向聚合物溶液中加入待容纳或包封的材料(诸如本发明的药学活性剂或标记)，所述聚合物溶液为有机溶剂中的悬浮液或溶液。通过向剧烈搅拌的油的烧杯中加入这种悬浮液或溶液而形成乳状液，其中油是聚合物的非溶剂，且聚合物/溶剂溶液在油中不混溶。通过在持续搅拌下扩散到油相中而除去有机溶剂。溶剂去除导致聚合物沉淀，形成含有核心材料的固体微胶^ ο
药学活性剂或标记可占运载体或微粒的约25% w/w或更多。优选地，药学活性剂或标记占运载体或微粒的多达0. 01%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%或40% (w/W) O
微粒可具有约0. 5-1. 5 μ m的平均直径，并可由上述任何过程产生。
特异性针对Fas配体的配体结合部分(例如Fas蛋白、其衍生物或其嵌合蛋白质) 优选地吸附于或化学轭合到载体或微粒的表面。其还可掺入到载体或微粒的基质中。本领域中技术人员应该理解，此步骤可通过标准技术进行，诸如简单吸附、化学轭合技术，或掺入到微粒的基质中。特异性针对Fas配体的配体结合部分优选地与载体(诸如微粒)表面连接或缔合。结合部分可占运载体或微粒的多达约0.01%、0. 1%、1%、5%、10%、15%、 20%、25%或 30% (w/w) ο
因此，本发明提供了用于制备含有药学活性物质的微粒的方法，其中微粒与i^as、 其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价地或非共价地缔合，包括通过表面吸收、吸附、 化学轭合或通过基质掺入将微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子缔合。
合适的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂优选为无毒性的，并不干扰活性成分的效力或生物活性。药学上可接受的载体可以是适合于向人类或其它脊椎动物施用的一种或多种相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。药学上可接受的载体可以是天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与载体结合以便于应用。
可以常规的方式利用一种或多种生理学上可接受的载体配制药物组合物，生理学上可接受的载体包括便于将活性化合物加工成可药学上应用的制剂的赋形剂和辅助剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。用于注射的典型制剂包括载体，诸如无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水。也经常加入粘度调节剂和防腐剂。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂和表面活性剂。
应该理解，本发明的递送运载体或组合物可用作对已知的用于治疗、改善或预防瘤或神经障碍的治疗的辅助，或与已知的用于治疗、改善或预防瘤或神经障碍的治疗结合使用。根据本发明的递送运载体或组合物可结合到具有许多不同形式的组合物中，不同形式特别地取决于使用组合物的方式。
Fas配体表达细胞可存在于脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹腔肿瘤、卵巢肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌及癌症类型中。Fas配体表达细胞还可存在于与神经系统疾病、运动神经元病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经性疼痛综合征和周围神经和脊髓损伤相关的细胞中。
受治疗者可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的递送运载体或组合物可用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或可用于其它兽医应用。最优选地，受治疗者是人。
本发明的递送运载体或组合物的有效量可以是使有效量的药学活性剂到达靶标并从而在受治疗者中产生治疗作用的量。包括药学活性剂的递送运载体或组合物的实际有效量可根据如下因素而变化，因素包括被利用的特定的剂、物质或其组合、特异性针对Fas 配体的配体结合部分的密度和/或性质、被包封的药学活性剂的释放特征、配制的特定的组合物、施用方式，和被治疗的受治疗者的年龄、体重、状况，以及施用途径和疾病或疾患。
根据本发明的递送运载体或组合物可适合于胃肠外施用。胃肠外施用可以是皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、腹膜内的、胸骨内的、膜内的、肝内的、病灶内的、瘤内的及颅内的注射或输注技术。如果胃肠外施用，药物组合物优选地皮下施用或静脉内施用。
尽管如此，可通过使有效量的递送运载体或组合物到达其靶标的任何可接受的方法来实现根据本发明的递送运载体或组合物的施用。所选择的特定的方式将取决于诸如以下因素特定的制剂、被治疗的受治疗者的状况严重度，及诱导有效治疗所需的剂量。
本文(包括任何所附权利要求、摘要和附图)描述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合与任何以上方面结合，除了其中这样的特征和/ 或步骤的至少一些是相互排斥的组合。为了更好地理解本发明，并表明如何实施本发明的实施方案，现通过实施例的方式参考附图，其中


图1显示了初级感觉神经元中未修饰合成颗粒的吸收。共聚焦显微术显示了 β 3 微管蛋白标记的背根神经节神经元中合成颗粒(圆形微球)的细胞内吸收(在细胞中心观察到细胞核)。(Α，Β)1μπι聚苯乙烯微球。(C，D)负载轭合牛血清白蛋白的荧光染料(FITC) 的2 μ m聚合电解质胶囊。细胞体和神经炎中均观察到颗粒；
图2显示了初级感觉神经元中未修饰合成颗粒的吸收。背根神经节神经元的共聚焦显微术(取自Bowen等人，2007)。㈧明视野图像。⑶1 μ m微球(圆形微球)孵育后， 用针对β 3-微管蛋白的抗体染色的大鼠背根神经节神经元的共聚焦显微术。从显示沿着 XY平面中的白色虚线ζ-组套横截面的上图和侧图可见微球被内化。(C，Ε)由白线(C)突出显示的神经元内部绿色和红色通道的荧光强度曲线(E)显示标记在0. 33μπι光学载玻片内的微球和β3-微管蛋白的共区域化。(D，F)由白线⑶突出显示的神经元外部绿色和红色通道的荧光强度曲线(F)显示无共区域化。
图3显示了 Daoy髓母细胞瘤细胞中未修饰合成颗粒的吸收。(Α-Β)门控Daoy细胞的流式细胞术散射图(左)和门控图(右)(Α)(右)显示随着浓度增加，具有0.5μπι 微粒的细胞群增加(更大地转移至右上象限)。(左)在较高浓度下散射图上的侧向散射增加。对照细胞没有微粒并用作阴性对照；(B)(右)显示当浓度增加时，具有1.0 μπι微粒的细胞群相似地增加。这与更大的侧向散射相关(左)。在相同浓度下，具有1.0 μπι微球的细胞群比具有0. 5 μ m微粒的细胞群更明显。SSC-H侧向散射细胞；FSC-H =前向散射细胞 (尺寸)；FLl-H=具有聚苯乙烯Dragon Green微粒的FITC记录细胞的通道。(C)图表说明了不同浓度和尺寸下被ND7/23细胞吸收的微粒(归纳自流式细胞术数据)。在每种情况下，在相同浓度下尺寸之间的吸收没有显著差异(P > 0. 05) (ns)(不取决于尺寸)。0.5ym 的1 X IO7浓度和1 X IO8浓度之间的吸收无差异，不过1 X IO8浓度和1 X IO9浓度之间的差异显著(P < 0. 001)***。IX IO7浓度和1X IO8浓度之间LOym微粒的吸收存在显著差异 (P < 0.05)*，且IX IO8浓度和IX IO9浓度之间的吸收存在显著差异(ρ<0.001)*#。误差棒显示SEM，η = 3 ；
图4显示了 ND7/23感觉神经元细胞系中未修饰合成颗粒的吸收。(A_B)ND7/23细胞的流式细胞术散射图(左)和门控图(右)(Α)(右)显示随着浓度增加，具有0.5μπι 微粒的细胞群增加(更大地转移至右上象限)。(左)在较高浓度下散射图上的侧向散射增加。对照细胞没有微粒并用作阴性对照。(B)(右)显示当浓度增加时，具有Ι.Ομπι微粒的细胞群相似地增加。这与更大的侧向散射相关(左)。在相同浓度下，具有Ι.Ομπι微粒的细胞群(光亮箭头)比具有0.5μπι微粒的细胞(黑色箭头)更明显。SSC-H=侧向散射细胞；FSC-H =前向散射细胞(尺寸)；FLl-H =具有DragonGreen微粒的FITC记录细胞的通道。(C)图表说明了不同浓度和尺寸下被ND7/23细胞吸收的微粒(归纳自流式细胞术数据)。在每种情况下，在相同浓度下尺寸之间的吸收没有显著差异(P > 0. 05) (ns) (不取决于尺寸)。0.5μπι的IX IO7浓度和IX IO8浓度之间的吸收无差异，但是IX IO8浓度和1 X IO9浓度之间的差异显著(ρ < 0. 001) #*。IX IO7浓度和1 X IO8浓度之间1. 0 μ m 微粒的吸收存在显著差异(P < 0. 05) *，且1 X IO8浓度和1 X IO9浓度之间的吸收存在显著差异(ρ < 0. 001)***。误差棒显示SEM，η = 3 ；
图5显示了初级皮层神经元及其它细胞类型中未修饰合成颗粒的吸收。该流式细胞图表描绘了经24h加入聚苯乙烯微粒后，来自小鼠脑的初级皮层培养物的PE (FL2-H) 对FITC(FLl-H)的荧光。在右上象限和左上象限中观察到⑶90. 2-PE阳性细胞(皮层神经元)，在下部象限中观察到其它细胞类型(主要是神经胶质细胞)。在右上象限和右下象限中观察到摄取了微粒的细胞。图表显示，皮层神经元和其它细胞类型还摄取培养物中的未修饰颗粒；
图6显示了来自成年大鼠的初级感觉神经元对颗粒的吸收及其生存力。(A)向培养物中加入增加的微粒浓度后，DRG神经元及其它细胞类型的数量未变化。这表明微粒不对细胞引起毒性。(B)增加的微粒浓度的健康神经元的实例(X200M)；
图7显示电子显微术研究未显示在超微结构水平上的毒性。(A-F)利用透射电子显微术研究神经元中微粒(MP)的选择标准(A)神经元具有特有的长且细的突起。注意，邻近的神经胶质细胞具有较短且较粗的突起(圆圈)。(B)膜束缚MP由白色箭头表示。B中存在小MP (箭头)。(C)未被吞噬体膜束缚的MP (箭头)未被量化。也存在被吞噬体膜束缚的MP (箭头)。(D)神经元突起中的空吞噬体(箭头)。E，F 被双膜(箭头)束缚的空吞噬体(*)的另外的实例。A中的棒=10 μ m，B-F中的棒=0. 5ym0 (G-L)背根神经节神经元中具有或没有吞噬体膜的微粒的透射电子显微照片(G)双膜吞噬体中测量为0. 5 μ m 的微粒(由箭头表示)。(H，J，K)吞噬体中的Iym微粒。(I，L)未被吞噬体束缚的0. 5 μ m 微粒。棒=0.5 μ m。(M-O)微粒和背根神经节的扫描电子显微照片(M)神经元膜几乎融合以形成围绕微粒的小囊泡(箭头)。(N)围绕两个微球的基底的神经元膜的投影。(0)微粒可被取出的可能的吞噬性杯(箭头)成形。棒=Iym;
图8显示了由Daoy人髓母细胞瘤细胞系对颗粒的吸收颗粒及其生存力。此图表显示了不同实验组中总的细胞死亡。X轴上是微粒尺寸和浓度。与0.5μπι微粒相比，Ι.Ομπι 微粒与更多细胞死亡相关。在没有微粒的培养物中也发生一些细胞死亡。未包括H2A阳性对照的数据。误差棒显示SEM，n = 3。数据显示，即使对于很高浓度的颗粒(超过实际使用)，细胞毒性被限制于25%以下。
图9显示了 ND7/23感觉细胞系对颗粒的吸收及其生存力。此图表显示了不同实验组中总的细胞死亡。X轴上是微粒尺寸和浓度。对于此细胞系在没有微粒的对照培养物中细胞死亡已经是高的，且通过加入微粒并没有恶化。此图表显示，在不同实验组之间总的细胞死亡是相对恒定的。误差棒显示SEM，η = 3 ；
图10显示了加入初级DRG神经元中的FasFc修饰聚苯乙烯颗粒。通过荧光显微术研究了 FasFc修饰对DRG神经元吸收1 μ m Dragon Green聚苯乙烯微粒的作用。大鼠血清、纤连蛋白、玻璃体结合蛋白和FasFc修饰微粒全部以与对照1相同的密度接种(1 X IO5 微粒/孔)。与对照和配体的其它类型相比，FasFc修饰诱导了神经元中显著量的微球吸收。
图11显示了以DRG神经元进行的未修饰颗粒和FasFc修饰颗粒的TEM研究。通过TEM研究了 FasFc修饰对DRG神经元吸收1 μ m DragonGreen聚苯乙烯微粒的作用。在 24h期间向培养物中加入未修饰微粒和FasFc修饰微粒QX IO6微粒/孔)。可在细胞质中观察到摄取的微粒具有电子致密(深色)、大约1微米直径的规则的球体(箭头)。与对照相比，FasFc修饰诱导了神经元中显著量的微球吸收。
图12显示了加入Daoy人髓母细胞瘤细胞系中的!^asFc修饰聚苯乙烯颗粒。此图表显示了与用于Daoy细胞的未涂布的微粒或用其它配体涂布的颗粒相比，FasFc微粒表面修饰对吸收的作用。在未处理的微粒(直接应用于培养物)和缓冲液(无配体)中经受涂布过程的未涂布微粒之间吸收无显著差异。对于0. 5 μ m微粒，在未涂布微粒和IgG调理的微粒之间吸收无显著差异(P > 0. 05)，但是在纤连蛋白和未涂布微粒之间(ρ < 0. 05)*,以及在!^asFc和未涂布微粒之间(ρ < 0.05)*存在显著差异。对于1. 0 μ m微粒，在IgG涂布的微粒与未涂布对照的吸收之间(P < 0.05)*，纤连蛋白涂布的与未涂布对照的吸收之间 (P < 0. 001)***，以及i^isFc与未涂布对照的吸收之间(ρ < 0. 001)***存在显著差异。图表还显示尺寸之间吸收的差异。结果还显示，富含Fc的IgG没有增加微粒的吸收至与hsFc 涂布的微粒相同的程度，且因此融合蛋白的Fas部分是观察到的增加的关键。误差棒显示 SEM, η = 3。每60mm陪替培养皿加入1 X IO7微粒；
图13显示了加入ND7/23感觉神经元细胞系中Wi^tsFc修饰聚苯乙烯颗粒。此图表显示了与未涂布微粒相比，FasFc微粒表面修饰对ND7/23细胞吸收的作用。如右上象限 (Q2)中所示，与未涂布微粒(3.4%)相比，FasFc涂布的0.5μπι微粒被明显更高百分比的细胞(18% )吸收。每35mm陪替培养皿加入IX IO5微粒。
图14显示了加入Daoy/皮层神经元共培养物中的FasFc修饰聚苯乙烯颗粒。这些图表显示了培养M小时后Daoy人髓母细胞瘤细胞系和来自小鼠的初级皮层神经元之间比较的!^asFc微粒(Ιμπι)表面修饰吸收。Daoy癌症细胞比皮层神经元及培养物中其它细胞类型(神经胶质细胞等等)摄取更多颗粒。用Ρ7皮层神经元(A)进行实验并用Ρ14皮层神经元(B)重复。每60mm陪替培养皿加入IX IO7微粒。
图15显示了利用加入DRG初级神经元中的i^asFc修饰颗粒的细胞内染料递送。(A)合并图像(X630M), (B)Hoechst染色的细胞核，(C) β III微管蛋白神经元标记和(D) 负载乙啡啶同型二聚体的PLGA颗粒(直径< 1. 2 μ m)，因为其缺乏颗粒而没有神经元细胞质染色，(E)合并图像(X630M)，(F)Hoechst染色的细胞核，(G) β III微管蛋白神经元标记和(H)负载乙啡啶同型二聚体的PLGA颗粒，48小时后释放核酸染料并标记细胞质核酸。
图16显示了利用加入ND7/23感觉神经元细胞系中的FasFc修饰颗粒的细胞内染料递送。FasFc修饰颗粒整夜加入ND7/23细胞培养物并通过FACS分离摄取的负载阿霉素的颗粒的细胞之后(左上图)，在接下来的两个星期内对照细胞(右上图像)继续正常地增殖(在显微镜下观察)，而摄取负载阿霉素的颗粒的那些细胞(在左上图表上；下部图像中右下图像显示负载阿霉素的颗粒荧光)完全没有增殖(分离后在显微镜下观察两个星期)。 这些观察显示了利用本发明负载抗有丝分裂药物阿霉素的ND7/23感觉神经元细胞系中的功能药物递送；
图17显示了利用加入Daoy人髓母细胞瘤细胞系中的FasFc修饰颗粒的细胞内药物递送。㈧加入1 μ m负载紫杉醇的PLGA微粒后测量7AAD阳性细胞的Daoy细胞的流式细胞术散射图(左)。未经7AAD处理的对照细胞未在FL3-H通道(Rl区域)中高度地记录。 7AAD测定后，未经任何药物处理的或安慰剂处理的对照细胞显示最小的细胞死亡。7AAD测定后，过氧化氢处理的对照细胞显示高百分比的细胞死亡。在第1&3天时，与负载安慰剂的 PLGA微粒相比，观察到负载紫杉醇的PLGA微粒的功能作用，发生细胞死亡并与裸紫杉醇处理相当。SSC-H侧向散射；FL3-H =用于7AAD记录细胞的通道。(B) 7AAD测定后测量的百分比细胞死亡(概括自流式细胞术数据)。数据显示，与安慰剂相比，在第1&3天时对于负载紫杉醇的颗粒的细胞死亡增加。此数据说明了利用本发明负载促凋亡药物紫杉醇在Daoy 髓母细胞瘤细胞系中的功能药物递送；和
图18显示FasFc (⑶95_Fc)修饰在体内增强了负载紫杉醇的微粒的效力。实验使用了未负载的(安慰剂)或以25% w/w负载紫杉醇的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)生物可降解微粒(直径大约1. 5 μ m)。然后将微粒表面涂布⑶95-Fc或假涂布(-⑶95_Fc)。(A) 显示了关于侵蚀性生长髓母细胞瘤皮下异种移植物的肿瘤体积的变化。(B)单一瘤内注射之后的第7天，与单独紫杉醇相比，对于+CD95PLGA安慰剂、-CD95PLGA紫杉醇和+CD95PLGA 紫杉醇，肿瘤生长被更有效地抑制。平均士SEM，n = 4。(C)在腹膜卵巢癌散布的鼠模型中(IGR0V1萤光素酶表达癌细胞)，显示了与配制为紫杉酚(溶解于聚氧乙烯蓖麻油中) 的紫杉醇的等效剂量相比，+CD95-Fc PLGA紫杉醇的抗肿瘤效力，4周治疗施用后肿瘤生物发光差异> 65倍。平均值+SEM，η = 5。暂停处理后，对于+⑶95_Fc PLGA紫杉醇组，肿瘤再生长相对较慢。由于疾病蔓延的程度，到28天时安慰剂组均不得不被处死；到35天时，-⑶95-Fc PLGA紫杉醇组中的1个动物被处死；到48天时，-⑶95_Fc PLGA紫杉醇组中的另外2个动物、紫杉醇组中的2个动物和+⑶95-Fc PLGA紫杉醇组中的1个动物被处死。 显示了统计比较(双尾t检验)，第35天紫杉醇对比+⑶95-Fc PLGA紫杉醇*P = 0. 012 ； 第；35天紫杉醇对比-CD95-Fc PLGA紫杉醇p = ns ;第41天紫杉醇对比+CD95_Fc PLGA 紫杉醇*P = 0. 03 ；第41天紫杉醇对比-⑶95-Fc PLGA紫杉醇P = ns ；第48天紫杉醇对比+CD95-Fc PLGA紫杉醇:**P = 0. 0093 ；第48天紫杉醇对比_CD95_Fc PLGA紫杉醇 *P = 0.02。(D)卵巢癌研究的活体成像(Live imaging)实例。实施例
材料和方法
重要材料
FasFc 嵌合体-商品目录号F8799_50ug ；供应商Sigma Aldrich (UK)
聚苯乙烯荧光微粒DragonGreen 0. 5 μ m-目录号FS03F/5069 ；
Dragon Green 1. Oym-目录号FS03F/7220 ；供应商=Bangs Laboratories(USA)
乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)-目录号.Resomer RG502H ；供应商Alfa Chemicals(UK)
细胞系和原代培养物
在37°C和5%C02下，在具有10%胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素(P/S) 的DMEM(含有谷氨酰胺)培养基中培养Daoy和ND7/23细胞系。将细胞铺板于60mm培养皿中，每个实验组三个培养皿。在流式细胞术之前五天，在培养物中用神经生长因子(NGF) 分化ND7/23细胞系。在没有NGF并没有分化所需的额外的生长因子的条件下培养Daoy细胞。
从成年雄性Wistar大鼠个月，> 180g)中切割背根神经节(DRG)感觉神经元。在供应商指示的浓度下在含有BSA、N2添加物、NGF和青霉素-链霉素的培养基中培养DRG神经元。
C57BL/6株的小鼠用于获得皮层神经元(按照内政部(Home Office)法规)。从出生后0-3天的小鼠脑中切割皮层神经元。在含有马血清、青霉素-链霉素和2% B-27添加物的neurobasal培养基中培养皮层神经元。
将微粒加入培养物中并在进一步分析之前与细胞系孵育M、48、72或244小时。
免疫荧光和共聚焦显微术分析
利用显微术从孔培养载玻片上直接观察免疫细胞化学标记的细胞。Leica DMRD显微镜(Leica，UK)仅用于荧光显微术，且kiss LSM 510显微镜(kiss，UK)用于共聚焦分析。连接到显微镜的软件和AdobePhotoshop 7. O被用于捕获并呈现图像。
电子显微术
对于透射电子显微术，将细胞在缓冲于磷酸盐中的4%戊二醛中固定1小时并留于缓冲液中一整夜。将细胞用四氧化锇后固定30分钟。分别在一系列等级的Durcupan 溶液(50、70、90、100和100% ),100% Durcupan和包埋介质的混合物及纯包埋介质中进行脱水。在铜载网上收集测量70-80nm的超薄切片并在以SOkV加速电压检查之前用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。
对于扫描电子显微术，用磷酸盐缓冲液润洗盖玻片上的细胞并用缓冲于磷酸盐中的1. 5%戊二醛固定至少2小时。将细胞用四氧化锇后固定1小时并在一系列等级的甲醇中脱水。然后将细胞暴露于六甲基二硅氮烷并留于室温下干燥一整夜。除去盖玻片， 在以IOkV电压观察之前安装在铝头上并镀金。
流式细胞术
具有细胞搜索软件的FACScan流式细胞仪(Beckton Dixon)用于研究。按照规定制备来自每个实验组的细胞并转移到标记的流式细胞术管中用于分析。利用合适的门控和控制器。利用合适的抗体检测细胞。为了内化研究，聚苯乙烯颗粒在FITC通道中是荧光的。
7AAD细胞死亡测定
利用7AAD(7_氨基放线菌素D)测定鉴定死亡细胞群。H202用作阳性对照并在 37°C下于4小时内以IOOmM的终浓度加入培养物中。将浮动的细胞从每个培养皿转移至 falcon管中并离心准备细胞用于流式细胞术。为了 7AAD测定，向每个流量管中加入10 μ 1 7AAD，并分析样品以评估细胞死亡。
用！^asFc修饰微粒
通过简单吸附用纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、大鼠血清、IgG或!^asFc表面修饰微粒。将其以10 μ g/200 μ 1各自的配体悬浮至少90分钟，而将未涂布的微球悬浮于相同体积的磷酸盐缓冲盐水中。每30分钟涡旋悬浮液以确保微粒充分涂布。还可利用不同的化学轭合技术修饰微粒或可将配体掺入到生物可降解微粒的基质中。
负载药物的微粒
利用标准双乳化法(standard double emulsion technique)合成负载阿霉素或紫杉醇的PLGA微粒。通过单乳化溶剂蒸发法(single emulsionsolvent evaporation technique)-微蹄乳化(microsieve emulsification)制备 PLGA(RG502H，Boehringer hgelheim，德国)安慰剂(未负载)微球。在乳化之前，通过0. 2 μ m PTFE过滤器过滤7% w/v PLGA 二氯甲烷溶液。此后，通过微筛膜(Nanomi BV，荷兰)将PLGA乳化到含有乳化剂的水溶液中，该微筛膜是沿着表面具有均勻孔隙的微制造膜。使得到的乳状液在室温下搅拌至少三小时以蒸发溶剂。通过过滤浓缩变硬的微球并重复洗涤。随后，将颗粒冷冻干燥并在-20°C下存储直到评价。对于负载紫杉醇的PLGA(RG502H，Boehringer hgelheim，德国)微球，将紫杉醇加入并溶解于6% w/v PLGA 二氯甲烷溶液中以便达到25% w/w的最终微粒药物浓度。通过0.2ym PTFE过滤器过滤溶液并通过硅微筛乳化。含有乳化剂的超纯水用作连续相。在室温下磁力搅拌乳状液至少3小时以蒸发二氯甲烷。固化后，微球同样通过过滤收集并重复洗涤。随后，将颗粒冷冻干燥并在_20°C下存储直到评价。从Nanomi BV (荷兰)获得均勻尺寸的负载紫杉醇的微粒和安慰剂微粒(大约1. 5 μ m)。
卵巢癌异种移植
在第1天将切106 IGR0V1-萤光素酶细胞腹膜内接种到雌性Balb Cnu/nu小鼠中。 每星期腹膜内施用紫杉醇(20mg/kg)和PLGA微球一次(第7、14、21和观天)。为了生物发光成像，用125mg/kg D-萤光素(CalliperLife Sciences, UK)腹膜内注射小鼠，且然后麻醉(通过吸入2 %异氟烷)。五分钟后，仍然在麻醉条件下，将其放置于不透光的室中的加温载物台上(37°C )，且从腹侧面上确定的目标区域中发射的光成像于Xenogen IVISImaging System 100 (Alameda, CA, USA) ±。禾Uffi Living Image (Xenogen, Alameda, CA, USA)分析数据并呈现为相对辐射强度(由平均辐射强度光子/s/cm2/sr计算)。
统计分析
平均值的标准误差(SEM)用于评估每个实验组之间的一致性。单向方差分析与 Bonferroni后检验用于评价组之间的差异。双尾t检验用于比较两组。
MM
非专门吞噬细胞中未修饰聚苯乙烯颗粒的吸收
先前发明人已说明了神经元在体外和体内吸收微粒和碎屑的能力(Bowen等人， 2007)。图(1似)显示了在聚苯乙烯颗粒的情况下初级感觉神经元培养物中的此实例，并还包括关于另一个药物递送系统-聚合电解质胶囊的先前未公布的数据。发明人还通过流式细胞术实验显示了由其它细胞包括Daoy人髓母细胞瘤细胞系(图幻、ND7/23感觉神经元细胞系(图4)和初级皮层神经元(图5)吸收未修饰合成颗粒。
未修饰聚苯乙烯颗粒的毒性研究
这些研究考察加入未修饰1 μ m聚苯乙烯(PS)微球对不同细胞类型的存活力的作用。以增加的浓度加入微球，且24h后定量每个视野的DRG神经元、其它细胞的数目(图 6)。关于此模型的重要的观察是，在微球的存在下，即使在极高的浓度下，未见细胞数目减少。这表明这些培养物中吸收颗粒未导致任何显著的毒性。在独立的重复实验中也证实了这点，独立的重复实验包括通过透射电子显微术和扫描电子显微术的详细的超微结构研究 (图7)。利用Daoy人髓母细胞瘤细胞系(图8)和ND7/23感觉神经元细胞系(图9)的流式细胞术实验以7-AAD细胞死亡测定考察对细胞存活力的作用。
利用FasFc修饰聚苯乙烯颗粒的吸收研究
用FasFc融合蛋白表面修饰颗粒导致某些类型的神经元细胞和癌细胞吸收的颗粒显著增加。图10说明对于背根神经节初级神经元与对照和用其它配体修饰相比的这种增加。这些结果强烈地说明了由本发明实现的神经元颗粒吸收的改善。利用透射电子显微术(图11)的研究证实了背根神经节初级神经元中的这些结果。Daoy人髓母细胞瘤细胞系(图12)和ND7/23感觉神经元细胞系(图13)的另外的示例显示了通过利用FasFc修饰颗粒增加某些细胞类型中的吸收的能力。此外，在Daoy人髓母细胞瘤细胞与小鼠皮层神经元的共培养中，观察到，与皮层神经元相比，颗粒优先被Daoy细胞吸收，显示了在治疗脑肿瘤中的实用性(图14)。
利用FasFc修饰PLGA颗粒的细胞质药物递送
利用建立的双乳化方法或利用其专有的微筛TM技术的来自NanomiBV(荷兰)的颗粒(www.nanomi.com)来合成乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)生物可降解颗粒。在合成过程中，可将一系列药物活性剂或标记包括小分子、肽、蛋白质及核酸掺入到的颗粒中。发明人利用掺入乙啡啶同型二聚体核酸染料及抗癌药物阿霉素和紫杉醇的微粒示例了我们的发明。发明人表明，FasFc修饰的负载乙啡啶同型二聚体的PLGA增强了吸收及随后的剂的递送(图15H)，在未摄取颗粒的对照细胞中未见细胞质核酸染色(图15D)。当未修饰的对照颗粒加入对照组中时，未发现吸收和剂递送的实例。相似地，发明人向ND7/23细胞中加入负载阿霉素的PLGA颗粒，且用FACS分离细胞后，在摄取负载阿霉素的颗粒的那些细胞中细胞增殖被抑制(图16)。与未负载的安慰剂颗粒相比，当负载紫杉醇的颗粒加入Daoy人髓母细胞瘤细胞中时，对于负载紫杉醇的颗粒在第1天和第3天观察到了关于裸药物的功能作用(图17)。这些结果说明本发明在药物递送应用中的实用性。
i^asFc (⑶95-Fc)修饰在体内增强了负载紫杉醇的微粒的效力
转移至临床上更相关的情况，发明人通过腹膜内注射利用原位卵巢癌模型在其它竞争细胞类型(例如巨噬细胞)的存在下在区划空间内靶向CD95L表达IGROVl-萤光素酶细胞(图18C，D)。活体成像显示，与等效剂量的紫杉酚(临床护理标准治疗(紫杉醇溶解于聚氧乙烯蓖麻油中))相比，+⑶95-Fc PLGA紫杉醇治疗组到第4周时肿瘤生物发光> 65-倍减(图18C)。未修饰(-⑶95-Fc)PLGA紫杉醇匹配紫杉酚。在此模型中，安慰剂治疗 (+⑶95-FC&-⑶95-Fc)均是无效的。暂停处理后，+⑶95_Fc PLGA紫杉醇治疗的显著的肿瘤减少作用持续(图18C)。这组中的小鼠全部存活直到第48天，且第62天终止时，剩余80% 无症状的动物(数据未显示)。先前的研究强调了利用以高剂量再配制的紫杉醇抑制肿瘤生长的潜能。由于报道死亡风险减少25%，在临床环境中还存在从静脉注射治疗向腹膜内递送卵巢癌药物的转变。然而，以标准剂量时很难发现如本文所报道的肿瘤负担减少。数据强烈支持了 CD95修饰的负载药物的微粒用于在卵巢癌中增强靶向细胞内药物递送的重要作用。这是临床需要的重要领域，因为在卵巢癌的晚期很难实现治疗成功。
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权利要求
1.一种用于将药学活性剂或标记递送至细胞的递送运载体，包括特异性针对Fas配体的配体结合部分，和所述药学活性剂或标记的载体。
2.如权利要求1所述的递送运载体，其中所述载体是微粒、纳米颗粒、微胶囊、微球、胶束或脂质体。
3.如权利要求2所述的递送运载体，其中所述载体是微粒。
4.如权利要求3所述的递送运载体，其中所述微粒具有达0.01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、 0. 2μπι、0· 5卩111、1卩111、2卩111、5卩1]1或10卩1]1的平均直径，或0· lymMl0ym>0. 2ymM5ym> 0· 3μπι至 2μπκ0· 4μπι至 1· 5 μ m、或 0· 5 μ m 至 Ιμπ 的平均直径。
5.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中特异性针对Fas配体的所述运载体的所述配体结合部分包括或由以下组成(a)Fas受体或其衍生物；(b)全长Fas蛋白，或其片段； (C)Fas蛋白的胞外域，或其片段；或， (d)Fas蛋白的配体结合域。
6.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中特异性针对Fas配体的所述运载体的所述配体结合部分是(a)肽、蛋白质、适体、抗体、抗体片段、融合蛋白或嵌合蛋白质；(b)Fas蛋白或其片段，与免疫球蛋白的可结晶片段区(Fe区)融合以形成嵌合融合蛋白。
7.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其包括多个特异性针对Fas配体的配体结合部分。
8.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述配体结合部分或每个配体结合部分是人类的或鼠类的。
9.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述配体结合部分或每个配体结合部分通过表面吸收、吸附、化学轭合或基质掺入与所述载体偶联。
10.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述配体结合部分或每个配体结合部分共价地或非共价地与所述载体缔合。
11.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述配体结合部分或每个配体结合部分通过连接分子与所述载体偶联。
12.如权利要求12所述的递送运载体，其中所述连接分子是免疫球蛋白的可结晶片段区(Fe)。
13.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂、标记或药物优选地不是能够与Fas配体特异性结合的剂。
14.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂或标记连接到所述载体，或容纳或包封于所述载体，优选地用于在靶细胞处或靶细胞内释放。
15.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述递送运载体是含有药学活性物质的微粒，其中所述微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价或非共价 φ π O
16.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂是蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、多糖、脂质、小分子药物或任何其它生物活性物质。
17.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂是细胞内活性的，或特异性针对靶细胞内的组分。
18.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂，优选地是抗癌剂，尤其是阿霉素或紫杉醇。
19.如权利要求1-14中任一项所述的递送运载体，其中所述标记是荧光标记，放射性核素或造影剂。
20.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂或标记容纳或包封于所述载体或微粒。
21.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述药学活性剂或标记通过化学键合被束缚至所述载体或微粒或被束缚于所述载体或微粒中，或物理地掺入形成所述载体或微粒的材料基质中。
22.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，用于药物。
23.如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，用于治疗。
24.如权利要求22或23所述的递送运载体，其中所述药学活性剂或标记连接到所述载体，或容纳或包封于所述载体。
25.如权利要求22-M任一项所述的递送运载体，用于治疗与瘤或神经障碍相关的疾病或医学病症。
26.一种治疗疾病或医学病症的方法，包括向受治疗者施用如前述权利要求中任一项所述的递送运载体，其中所述递送运载体包括有效量的药学活性剂。
27.如权利要求25所述的递送运载体，或如权利要求沈所述的方法，其中所述疾病或病症是脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜内肿瘤、卵巢肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌或肿瘤细胞中表达Fas配体的癌症类型或肿瘤。
28.如权利要求25所述的递送运载体，或如权利要求沈所述的方法，其中所述疾病或病症是神经系统疾病，任选地，运动神经元病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经性疼痛综合征或周围神经或脊髓损伤。
29.如权利要求1-22中任一项所述的递送运载体，用于包括检测Fas配体表达细胞的诊断法中，其中标记连接到所述载体，或容纳或包封于所述载体。
30.一种诊断方法，包括通过向受治疗者施用如权利要求1-22中任一项所述的递送运载体来检测Fas配体表达细胞，其中标记连接到所述载体，或容纳或包封于所述载体。
31.如权利要求四所述的递送运载体，或如权利要求30所述的方法，其中所述诊断法或诊断方法是诊断瘤或神经障碍的方法。
32.一种药物组合物，其包括如权利要求1-25、27-四及31中任一项所述的递送运载体和一种或多种生理学上或药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
33.一种用于制备如权利要求1-25、27-四及31中任一项所述的递送运载体的方法，包括形成容纳或包封药学活性剂、标记或药物的微粒和将特异性针对Fas配体的配体结合部分连接到所述微粒的步骤。
34.一种含有药学活性物质的微粒，其中所述微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价地或非共价地缔合。
35.根据权利要求34所述的微粒，其中所述微粒具有达0.01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、 0. 2μπ 、0· 5μπ 、1μπ 、2μπ 、5μπ 或 ΙΟμ 的平均直径。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的微粒，或根据权利要求1-25、27-四及31 中任一项所述的递送运载体，其中所述载体或所述微粒包括PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物基质)、PLA(聚乳酸)、PCL(聚-ε -己内酯)或PHB (聚羟丁酸酯)或为可生物降解的壳聚糖微球、基于硅的颗粒、聚合电解质胶囊、树枝状聚合物或脂质体。
37.根据权利要求34或权利要求35所述的微粒，或根据权利要求1-25、27-四及31中任一项所述的递送运载体，其中所述载体或所述微粒包括选自由以下组成的组的聚合物 聚烷撑、聚碳酸酯、聚对二氧杂环己酮、聚酐、多羟基酸、聚延胡索酸酯、聚己内酯、聚酰胺、 聚缩醛、聚醚、聚酯、聚原酸酯、聚羟丁酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚芳酯、聚碳酸酯、聚延胡索酸丙烯酯、 聚羟基链烷酸酯、聚缩酮、聚酰胺酯、聚羟基戊酸酯、聚原碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚草酸亚烷酯、聚琥珀酸亚烷酯、聚苹果酸、聚甲基乙烯醚和聚马来酸酐。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的微粒，或根据权利要求1-25、27-四及31中任一项所述的递送运载体，其中所述载体或所述微粒是非聚合的。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的微粒，其中所述微粒通过表面吸收、吸附、化学轭合或基质掺入与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价地或非共价地缔合。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的微粒，其中所述Fas衍生物是全长i^as、 !^asFc、或Fas的融合蛋白。
41.如权利要求40所述的微粒，其中所述Fas配体的特异性结合分子是肽、蛋白质、适体、抗体或抗体片段。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的微粒用于药物。
43.根据权利要求34-42中任一项所述的微粒用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症选自由以下组成的组脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜内肿瘤、卵巢肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌和肿瘤细胞中表达Fas配体的癌症类型和肿瘤。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的微粒用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症选自由以下组成的组神经系统疾病、运动神经元病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经性疼痛综合征和周围神经和脊髓损伤。
45.一种用于将根据权利要求34-41中任一项所述的微粒或根据权利要求1-25、27-四及31中任一项所述的递送运载体递送至细胞中的方法，包括向所述细胞施用所述递送运载体或微粒。
46.一种治疗疾病或病症的方法，包括以有效治疗所述疾病或病症的量向患者施用权利要求34-41中任一项所述的微粒。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜内肿瘤、卵巢肿瘤、胃肠道肿瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌和肿瘤细胞中表达Fas配体的癌症类型和肿瘤。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组神经系统疾病、运动神经元病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经性疼痛综合征和周围神经和脊髓损伤。
49.!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子在修饰含有药学活性物质的微粒中的用途，其中所述修饰导致通过表面吸收、吸附、化学轭合或通过将Fas基质掺入到颗粒中而将所述微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子共价地或非共价地缔合。
50.一种用于制备含有药学活性物质的微粒的方法，其中所述微粒与!^s、其衍生物或 Fas配体的特异性结合分子共价地或非共价地缔合，其包括通过表面吸收、吸附、化学轭合或通过基质掺入而将所述微粒与!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子缔合。
51.如权利要求49所述的用途或权利要求50所述的方法，其中所述Fas衍生物是全长 Fas、FasFc、或Fas的融合蛋白。
52.如权利要求49所述的用途或权利要求50所述的方法，其中所述Fas配体的特异性结合分子是肽、蛋白质、适体、抗体或抗体片段。
53.一种药物组合物，包括权利要求34至41中任一项所述的微粒和合适的赋形剂。
54.一种药物轭合物，包括药物和!^s、其衍生物或Fas配体的特异性结合分子。
55.根据权利要求M所述的药物轭合物，其中所述Fas衍生物是全长i^as、i^asFc、或 Fas的融合蛋白。
56.根据权利要求讨所述的药物轭合物，其中所述Fas配体的特异性结合分子是肽、蛋白质、适体、抗体或抗体片段。
57.权利要求讨-56中任一项所述的药物轭合物用于药物。
全文摘要
一种用于将药学活性剂或标记递送至细胞的递送运载体，包括特异性针对Fas配体的配体结合部分，和所述药学活性剂或标记的载体。
文档编号A61K47/48GK102497886SQ201080041671
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者乔安妮·伊丽莎白·马丁, 戴维森·达·阿捷赫 申请人:玛丽皇后与斯特菲尔德学院