专利名称：抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体和抗0型 FMDV的中和性单克隆抗体，本发明还涉及上述单克隆抗体所识别的中和表位，本发明进一步涉及所述的单克隆抗体和中和表位在预防口蹄疫中的应用，属于口蹄疫的防治领域。
背景技术：
口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)属于小 RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8. 51Λ。口蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一，该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，导致巨大的经济损失。此外，由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大，全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登录号EF149009)，由于在我国江苏省首先分离，被称作Asial型江苏谱系。该谱系口蹄疫病毒在我国牛群中一经流行，传播趋势迅猛，造成的损失极为严重。本世纪初0型口蹄疫病毒泛亚谱系在中国(O/Tibet/CHA/99， GenBank 登录号AJ539138)及周边国家甚至欧洲(Mason Pff et al. J Gen Virol. 2003, 84 (Pt 6) :1583-93)均有流行，给许多国家造成巨大损失。因此，积极开展Asial型和0型口蹄疫(FMD)的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位点都不尽相同，存在广泛的抗原变异。利用单抗逃逸突变株序列分析和交叉中和试验，已鉴定了一些不同血清型FMDV的抗原位点，相关的研究主要来自0、A、C和 Asial型FMDV。中和性抗体在保护易感动物抵抗口蹄疫病毒感染过程中起主导作用，诱导机体产生中和性抗体的抗原位点主要位于各个血清型FMDV的VPl上，VPl的G-H环是病毒最重要的中和性抗原位点所在，该环中既存在线性表位，又存在构象型表位。在0型FMDV 的VPl蛋白中，G-H环133-157aa和C-末端200_213aa的线性表位组成重要的抗原位点1。 Miz等报道，FMDV A5亚型有2个中和性抗原位点，一个是线性表位，位于VPl的C-末端，关键残基在198aa，另一个位于VP2的B-C环上，由2个表位组成，包括72aa和79aa。Santina Graziolideng用大量单抗进一步确定，Asial型FMDV存在4个中和性抗原位点位点1位于VPl的14ha，与0型VPl的144aa相对应，在保守的RGD基序侧翼；位点2位于VP2的 B-C环区，包括67、72、74、77和79aa等多位残基，而且与VPl的49aa和207aa相关联；位点4位于VP3的B-B结节上，关键残基为58aa和59aa，该位点与位点2相关联；位点5位于VP3的C-末端，作为一个新发现的独立位点被首次提出，218aa为关键性残基。国外这些研究是用单克隆抗体压力筛选或用合成肽扫描技术，只能确定表位相关氨基酸或肽段，不能精确确定表位的性质和位置。我国已有Asial型和0型FMDV中和活性单克隆抗体的文章发表，然而尚未见到中和表位的研究报道，因此，这些已发表中和性单克隆抗体的功能性和价值尚不清楚。
发明内容
本发明目的之一是提供一株能分泌抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明目的之二是提供一株能分泌抗0型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明目的之三是分别提供由上述中和性单克隆抗体所识别的亚洲1型FMDV中和表位氨基酸序列和0型FMDV中和表位氨基酸序列；本发明目的之四是将上述单克隆抗体或中和表位用于诊断或预防口蹄疫。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株能分泌抗亚洲1型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCC 2692 ；保藏日期2008年10月8日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路。由该杂交瘤细胞系所分泌的抗亚洲1 型FMD的中和性单克隆抗体，命名为3E11 ；一株能分泌抗0型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCC 2691;保藏日期2008年10月8日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路；由该杂交瘤细胞系所分泌的抗0型 FMDV的中和性单克隆抗体，命名为8E8 ；由单克隆抗体3E11所识别的亚洲1型FMDV构象型中和表位，该构象表位的关键性氨基酸残基是由亚洲1型FMDV的VPl蛋白上Ser140或Ser141, Gly144、Leu146和Leu149组成；进一步优选的，所述构象表位的模拟表位的氨基酸序列为GSLXXL(SEQ ID N0:1)，其中， X选自任意一种氨基酸残基；由单克隆抗体8E8所识别的0型FMDV的VPl蛋白中的一段线性中和表位序列，其氨基酸序列为⑶LNVRT (SEQ ID NO 2)或者为其衍生序列；其中，所述的衍生序列是对GDLNVRT中的一个或多个氨基酸进行缺失和/或替换后所得到的任意一种的氨基酸序列，其中所述的缺失是将G缺失；所述的替换选自以下6种中的任意一种或一种以上进行的组合(1) G用W替换；(2) L用A替换；(3) N用Q、A或W替换；(4) V用I或T替换；(5) R用L、K或A替换；(6) T用A替换；经试验证实，上述的经过缺失和/或替换后所得到的衍生序列与GDLNVRT均具有相同的性能与用途。本发明技术方案的详细描述本发明用纯化的全病毒免疫BALB/c鼠制备抗Asial型FMDV江苏谱系Asial/YS/ CHA/05株、0型FMDV泛亚谱系0/YS/CHA/05株的单克隆抗体，各获得一株具有强中和活性的单克隆抗体3E11和8E8。间接免疫荧光和Western blot检测表明，3E11识别Asial型 FMDV—个构象型优势中和表位，该单抗与一个亲本变异株(144位由G突变为幻无反应， 由此推断VPl蛋白上144位Gly是单抗3E11识别表位的关键性氨基酸；8E8识别0型FMDV 一个广谱的线性中和表位。本发明进一步利用噬菌体展示随机12肽库筛选上述两个单抗识别的模拟表位，发现一个表位基序GSLXXL (X代表20种氨基酸残基任意一种)与单抗3E11具有结合活性， 而单抗8E8的模拟表位基序为⑶LNVRT。鉴于两个单抗的特性，用合成肽对单抗3E11识别的模拟表位基序的4个保守性氨基酸残基进行定点突变分析确定，这些氨基酸均为关键性氨基酸；同时合成Asial/YS/ CHA/05株VPl蛋白G-H环的136 153aa序列，该十八肽包含GSLXXL基序所有4个关键性氨基酸，肽ELISA检测显示与单抗3E11同样具有结合活性，从而确定该构象表位的关键性氨基酸残基是由VPl蛋白上Ser140或Ser141、Gly144、Leu146和Leu149组成。单抗8E8模拟表位基序与0/YS/CHA/05株VPl蛋白的146 152位氨基酸序列存在高度同源，因而将146⑶LQVLT152序列及其截短肽序列与GST融合表达并进行Western blot分析，确定147DLQVLTi52是0型FMDV VPl上的一个线性B细胞表位；针对病毒VPl真实序列中146 152aa肽(P-8E8)合成一系列定点诱变肽并进行竞争ELISA分析，结果显示， 氨基酸残基D对于该表位活性最为关键，残基V、L148、L151、Q和T对于表位活性起重要作用， 而且残基T不可缺失。鉴于上述两个单抗在体外具有很高的中和滴度，本发明进而用乳鼠保护试验在体内验证上述两个单克隆抗体对FMDV感染的免疫保护作用。试验结果表明，针对Asial型和 0型FMDV的单克隆抗体3E11和8E8腹水的半数保护量(PD5tl)分别为1995和2371 ；仅用 8PD50单抗3E11和IlPD5tl单抗8E8，就可完全保护乳鼠耐受致死剂量Asial型和0型FMDV 的攻击。被动免疫的乳鼠在攻毒后体重增长的百分率随单抗浓度的升高而升高，而且随着单抗浓度的升高，乳鼠的起始死亡时刻后延、终点死亡时刻前移。通过体外中和试验和体内动物被动免疫保护保护试验说明，本发明的3E11单抗和8E8单抗具有良好的被动免疫效果，这两株单抗均能应用于口蹄疫的紧急预防，可以对口蹄疫的被动免疫起到良好的免疫效果；用这两个单抗所识别的FMDV血清型的保护性抗原表位可以进一步研究或开发出口蹄疫二价表位疫苗，对于口蹄疫的免疫预防将具有重要的意义。
图IELISA方法筛选单抗3E11特异性亲和的噬菌体；用相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入用单抗3E11包被的微孔板中，并设同种抗体亚型的单抗4C6、含BSA的封闭液和原始肽库(Phage Library, PL)作为对照。图2合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；包被链酶亲和素，分别加入系列稀释的生物素化短肽P-S7和随机打乱肽P-S7-SCR，与3E11结合反应后，加入HRP 标记的羊抗鼠二抗，显色并测定吸光值。图3合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；用合成肽P_S7竞争抑制单抗3E11与病毒抗原的结合包被Iug病毒抗原，加入合成肽与单抗3E11预混液，最后加入羊抗鼠酶标二抗。图4合成肽P-S7及其突变肽与单抗3E11结合活性的检测；合成肽定点突变试验鉴定P-S7肽与单抗3E11相互作用的关键性氨基酸，以单抗3E11与未突变短肽P-S7反应的OD4tl5值为100%，计算其它短肽的结合率。图5合成的18-aa G-H环十八肽与单抗3E11的结合活性；包被链酶亲和素，加入系列稀释的生物素化短肽AsialpG-H，与单抗3E11反应，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，显色后测定OD4tl5吸光值。图6ELISA方法筛选单抗8E8亲和的噬菌体；以相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入包被有单抗8E8的微孔板中，设同种抗体亚型的单抗5F7、含BSA封闭液以及噬菌体肽库 (Phage Library, PL)作为对照。图7阳性噬菌体克隆的Wfestern blot分析。图8表位及其截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE (a)和^festern blot分析(b)。图9合成肽的竞争ELISA实验；用合成的突变肽竞争抑制单抗8E8与病毒结合。图10合成肽的竞争ELISA实验；肽浓度为lug/100ul，以P-8E8的抑制率为100%， 计算各合成突变肽的相对抑制率。图11合成肽的竞争ELISA实验；用合成的突变肽竞争抑制单抗8E8与病毒结合。图12合成肽的竞争ELISA实验；肽浓度为lug/100ul，以P-8E8的抑制率为100%， 计算各合成突变肽的相对抑制率。图13单抗3E11浓度与乳鼠存活率的关系；乳鼠经10LD5(1ASial/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗3E11 (即不同中和抗体半数保护量)导致乳鼠存活率的差异。图14单抗8E8浓度与乳鼠存活率的关系；乳鼠经IOLD5tl 0/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗8E8(即不同中和抗体半数保护量)导致乳鼠存活率的差异。图15单抗3E11浓度与乳鼠存活时间的关系；乳鼠经10LD5(1ASial/YS/CHA/05攻击后，不同浓度的单抗3E11导致乳鼠死亡时间的差异。图16单抗8E8浓度与乳鼠存活时间的关系；乳鼠经IOLD5tl 0/YS/CHA/05攻击后， 不同浓度的单抗8E8导致乳鼠死亡时间的差异。图17单抗3E11浓度与乳鼠体重增长百分率关系；乳鼠经10LD5(1ASial/YS/CHA/05 攻击后不同浓度的单抗3E11导致乳鼠体重增长百分率的的差异。图18单抗8E8浓度与乳鼠体重增长百分率关系；乳鼠经10LD5(10/YS/CHA/05攻击后不同浓度的单抗8E8导致乳鼠体重增长百分率的差异。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。一、材料和方法1.病毒、细胞、菌株和实验动物口蹄疫病毒株Asial/YS/CHA/05属于Asial型FMDV江苏谱系，口蹄疫病毒0/YS/ CHA/05株属于0型泛亚谱系；乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；质粒pGEX-6p-l和受体菌BL21由本实验室保存；清洁级雌性BALB/c小鼠、SPF级BALB/c乳鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。2.主要试剂融合剂PEG/DMS0 (Mw, 1450)、HAT 盐(50x)、HT 盐(50x)、HRP 或 FITC 标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自 Southern Biotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco公司；二甲基亚砜(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司；Ph. D. -12 肽库试剂盒购自New England Biolabs公司；HRP标记抗的M13噬菌体抗体购自于GE Healthcare公司；限制性内切酶 BamHI、XhoI, PstI 购自 TaKaRa 公司；T4DNA 连接酶购自 New England Biolabs 公司；高糖DMEM干粉购自GIBCO公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司； 96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司。3.鼠免疫与单克隆抗体的制备(1)将Asial型、O型FMDV细胞适应毒接种于长满单层的BHK-21细胞，待75%以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，初步裂解细胞，释放病毒。冻融后的病毒液以1 1000加入TritonX-IOO和4 10000加入甲醛裂解与灭活48h以上， 取灭活过的病毒液ImL上BHK-21细胞盲传三代，检测是否灭活彻底。将经冻融裂解后的培养液作9000rpm(Beckman高速离心机，JA-IO转子)、4°C离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀。按病毒液上清的体积加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室温搅拌池至完全溶解，4°C过夜沉淀。次日将上清9000rpm、4°C离心90min，弃上清，回收沉淀。用NET缓冲液于低温下将沉淀轻轻重悬。将重悬的上清^000rpm、4°C离心2h，回收沉淀，于低温下用适量的NET缓冲液轻轻重悬沉淀，充分混勻后分装，-70°C冻存备用。将提纯抗原用NET 缓冲液进行10倍、100倍、1000倍稀释，用分光光度计测量蛋白质的浓度。(2)用纯化的Asial型、0型FMDV抗原200 μ g/200uL加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经背部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；间隔2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射二倍量抗原。(3)细胞融合a)饲养层细胞的制备细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱白处死小鼠，将其浸泡于75%酒精中， IOmin后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将IOmL注射器内吸取的8-lOmL HAT完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mL HAT培养液中，吹散混勻细胞，分装于6块96孔培养板，100 μ L/孔。置于37°C、5% CO2培养箱中培养。b)骨髓瘤细胞的制备融合前36-4 ,将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mL DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管中。 IOOOrpm离心lOmin。将细胞沉淀重悬置20mL DMEM基础培养液中，混勻。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。c)免疫脾细胞的制备融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75%酒精中，IOmin后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加 DMEM基础培养液大约至30mL，混勻。IOOOrpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于IOmL DMEM基础培养液中，混勻。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合取65mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和 lmL50% PEG于37°C水浴中预热，另备盛有37°C水的200mL烧杯。按5份脾细胞数加1份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混勻。IOOOrpm离心lOmin，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均勻呈糊状。将离心管放入盛有37°C水的200mL烧杯中，一手均勻转动离心管，另一手用ImL 巴氏吸管吸取37°C 50% PEG溶液lmL，Imin内加完，静置anin。随后先慢后快地加入DMEM 基础培养液终止反应，37°C水浴静置lOmin。IOOOrpm离心lOmin，弃上清，加入65mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0. ImL接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37°C、 5%的(X)2培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换HT培养液。4.抗体检测 ELISA用提纯的病毒抗原包被于微孔板中，加入IOOuL杂交瘤细胞培养上清，37°C温育 Ih后洗涤，加入1 5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物OPD避光显色 IOmin,于波长492nm测定吸光值。5.间接免疫荧光微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4X 103TCID5(1/Well，出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50uL杂交瘤细胞培养上清，37°C温育40min后PBS洗涤三次，加入1 200稀释的荧光素标记羊抗鼠IgG抗体，37°C温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察，以+号数目记录荧光强度。6.微量细胞中和试验(1)病毒毒价的测定将病毒接种于单层细胞，37°C吸附Ih后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75%以上，收获病毒悬液冻融3次，以3000r/min离心lOmin，取上清液，定量分装成Iml小瓶置_70°C保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。取自-70°C冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即ΙΟ"1, ΙΟ"2,10-11……，每孔病毒悬液量为50 μ 1，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5% CO2温箱37°C培养，从48-7 逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed 和 Muench 两氏法计算 TCID50。表 1TCID50计算(接种剂量50 μ 1)
权利要求
1.一株能分泌抗0型口蹄疫病毒的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCC洸91。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用，属于口蹄疫的防治领域。所述能分泌抗O型FMDV的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其微生物保藏号是CGMCC No.2691。本发明还公开了上述单克隆抗体所分别识别的O型FMDV VP1蛋白的线性中和表位的氨基酸序列。体外中和试验和体内动物保护试验说明，本发明的单克隆抗体具有良好的被动免疫效果，能应用于口蹄疫的紧急预防，可对口蹄疫的被动免疫起到良好的免疫效果。
文档编号A61K39/42GK102277333SQ20111016255
公开日2011年12月14日 申请日期2008年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者于力, 周国辉, 张春媛, 赵磊 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所