专利名称：Plga猪流感dna疫苗微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及DNA疫苗微球的制备方法。
背景技术：
猪流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种猪的急性、传染性呼吸道疾病， 传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为猪流感病毒亚型较多、抗原易发生变异和可在种间传播，给流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑战。所以猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用，具有重大的公共卫生意义。DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、 人体临床实验结果表明DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了 DNA疫苗的研究进展。因此如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是当前DNA疫苗研究的国际热点。国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是猪流感DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究结果已经显示出了巨大的应用潜力，微球/纳米粒递送系统具有靶向作用，对DNA疫苗具有保护作用， 提高细胞转运效率，提高免疫效果并可经口服和鼻腔给药，诱导黏膜免疫等特点。因此，DNA 疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统是一个很好的递送系统，将促进DNA疫苗在畜牧业和临床的实际应用，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。目前，普通猪流感DNA疫苗的持续时间短，在体内易被降解，不能够实现缓释的目的。
发明内容
本发明的目的是为了解决现在猪流感DNA疫苗存在持续时间短，在体内易被降解，不能缓释的问题，而提供了 PLGA (聚乳酸/羟基乙酸共聚物)猪流感DNA疫苗微球的制备方法。PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备一、称取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，得复乳；二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心lOmin，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10 -50°C的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一 40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA 基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA ；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120 μ g/mL。
本发明以可生物降解材料聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体，以猪流感病毒 H3N2亚型HA基因重组质粒DNA为模型药物，采用复乳化-溶剂挥发法制备PLGA猪流感DNA 疫苗微球，通过考察超声乳化时间、乳化器搅拌速度、PVA的浓度、油相中PLGA的浓度(m/v) 和DNA疫苗与PLGA比例(mg/mg)等影响因素，筛选出了粒径适宜、载药量大、包封率高、药物稳定性好、工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了 DNA疫苗的活性、具有适宜释药速率的PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，并且本发明中的处方和工艺也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圆整，表面光滑，粒径为 6. 08 士 2. 34 μ m，包封率平均为60 % 士 3. 8 %，载药量平均为5. 5 % 士 0. 5 % ；在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间；因此，实现了药物的缓释、靶向给药，具有重要的理论价值和实际应用前景，用于动物体或人体一些流行性疾病的预防、治疗和诊断，市场规模巨大，必将创造巨大的经济效益。本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球生物相容性和生物黏附性好，经黏膜免疫大大增强了猪流感疫苗的机体局部和全身的体液免疫及细胞免疫效果；同时克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低。 本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球可用于猪流感免疫，经口服给药，按体重免疫注射给药，给药量为95 105 μ g/100 μ L。
图1是具体实施方式
一中PLGA猪流感DNA疫苗微球的扫描电子显微镜观察图；图2是具体实施方式
一中超声时间对DNA疫苗稳定性的影响琼脂糖凝胶电泳图， 其中M泳道=DL 15000 Markers ； 1-6泳道超声乳化时间分别为0、6、8、0、12、14s ；图3是具体实施方式
一中搅拌速度对DNA疫苗稳定性的影响琼脂糖凝胶电泳图， 其中 M 泳道=DL 15000 Markers ； 1-5 泳道搅拌速度分别为 0、6000、7000、8000、9000r/ min ；图4是Western blot检测蛋白在293T细胞中的表达情况，其中1泳道293T细胞对照，2泳道质粒DNA，3泳道PLGA猪流感DNA疫苗微球，4泳道空白PLGA微球；图5是免疫鼠血清中IgG抗体检测结果的曲线图，其中·表示裸DNA疫苗组， 表示PLGA微球疫苗试验组， 表示生理盐水对照组，▲表示空白微球。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备一、称取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，得复乳；
二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心lOmin，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10 -50°C的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一 40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA 基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA ；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120 μ g/mL。猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒按以下步骤构建根据对猪流感病毒四川分离株HA基因的分析，采用primer软件设计一对特异性扩增引物，上游 PBl :5，-GTGGTACCATGAAGACTATCATTGCTTTGAG-3，；下游 PB2 :5’ -TTGCG GCCGCTTACTAATACACT-CAAATG-3，。在其中分别引入KpnI和NotI酶切位点(加下划线部分)。采用PCR方法，以重组质粒pMD-HA为模板，扩增出猪流感病毒四川分离株HA基因； PCR反应参数为先95 °C预变性4min ；后94°C变性30s，60°C退火40s，72 °C延伸2min， 进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。采用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段，连接到pMDIS-T-simplevector，阳性质粒送往大连宝生物公司测序验证正确，命名为 pMD-simpIe-HA0将pMD-simple-HA经KpnI和NotI双酶切之后，回收约1. 7Kb大小的DNA片段。 同时用KpnI和NotI双酶切pcDNA3. 1 (+)，并回收；将经过双酶切后回收的目的DNA片段与 pcDNA3. 1 (+)的酶切回收产物进行连接、转化到E. coli DH5 α克隆菌，采用氨苄抗性筛选获得的质粒经PCR鉴定和双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒送往大连宝生物公司测序，得到猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒。将猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒命名为pcDNA3. 1_HA。猪流感病毒H3N2 亚型HA基因重组质粒的构建方法记载于《中国农学通报》2009年第25 (22) “猪流感H3N2 亚型HA基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究”中。本实施方式步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液的制备按照下述步骤1)转化猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒的感受态菌接种到加入相应抗生素的LB琼脂平板，37°C培养；形成菌落后，挑取单个菌落接种于5mL相应抗性的LB培养基中，37°C摇菌培养8 12h ；2)按1/1000的比例将新鲜的菌液接种到500mL LB培养基中，37°C继续摇菌培养 8 12h ；于37°C剧烈摇12 16h ；取1 2mL菌液用试剂盒提取后，用酶切电泳分析，以确定正确的质粒扩增；3)离心培养物4°C，8000r/min,离心IOmin后的沉淀物用STE溶液洗(每个500 离心管IOOmL),溶解重悬沉淀后，8000r/min、离心8min，4°C离心去上清；4)加18mL Solution I (染液I)重悬沉淀菌体，再加入ImL新配制的30mg/mL溶菌酶溶液；5)加40mL新配制的Solution II (染液II)，盖紧瓶盖，缓慢颠倒离心管数次，以充分混勻内容物，于室温放置5 IOmin ；6)加30mL冰预冷的Solution III (染液III)，盖紧瓶盖，缓慢颠倒离心管数次， 以充分混勻内容物，此时应不再出现分明的两个液相；置于冰上lOmin，应形成一白色絮状沉淀；
7) 4°C，9000r/min,离心25min ；(如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000r/min再离心 20min，然后将上清转入另一瓶中；未形成紧密沉淀块的原因通常是由于Solution III与细菌裂解物混合部充分)；8)用4层干净纱布把上清滤至500mL离心管中；根据上清液的体积，加入上清液体积0. 6倍的异丙醇，混勻后室温放置IOmin以上；9)室温下12000r/min离心25min，弃上清，回收核酸；10) 倒掉上清，敞开瓶口倒置离心管是残余上清流尽，于室温用1 2mL、70%乙醇洗1 2沉淀和管壁；于室温将离心管倒置于吸水纸上，使其残余痕量乙醇挥发殆尽；11)用 3mL TE (pH 8. 0)溶解核酸沉淀；12)将核酸溶液转入15mL离心管中，再加3mL冰预冷的5mol/L的LiCl溶液，充分混勻；再 4°C，12000r/min,离心 15min ；13)将上清转移到另一个30mL离心管中，加等量的异丙醇，充分混勻，室温 12000r/min，离心 IOmin ；14)小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后的残留的液滴流尽；用1 2mL、 70%乙醇洗沉淀及管壁；倒掉乙醇，于室温将离心管倒置于吸水纸上，使其残余痕量乙醇挥发殆尽；(应使沉淀保持湿润)15)用2mL含RNase (20 μ g/mL)的TE (pH 8. 0)溶解沉淀物，分装到1. 5mL的微量离心管中，室温或者37°C放置30min ；16)将质粒-RNase混合物用酚-氯仿(1 1)抽提一次，然后用氯仿抽提一次；17)加入2倍体积的无水乙醇，室温放置30min后，12000r/min, 4°C离心20min，弃
上清；18)用1 2mL、70 %的乙醇洗涤1 2次，离心管倒置在吸水纸或者滤纸上几分钟，浙干，但沉淀物应湿润；19)将质粒DNA沉淀用ImL灭菌水溶解，再加入0. 5mL PEG-MgCl2溶液；20)室温放置30min以上，用室温微量离心管机12000r/min离心15 20min，以回收沉淀质粒DNA ；21)沉淀用0. 5mL 70%乙醇重悬以去除微量PEG，用微量离心机13000r/min离心 5min以回收核酸；22)吸去乙醇，重复步骤21)，二次洗涤后，在离心管架上放置10 20min，使乙醇挥发；23)湿润的质粒沉淀用500 μ L TE (pH 8. 0)溶解，以1 100用TE稀释，用紫外分光光度计测定OD26tl和OD28tl,并计算OD26tZOD28tl比值及质粒DNA的浓度，调整浓度为2mg/ mL, _20°C保存，备用，得到猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液。本实施方式步骤一中超声乳化的时间为10s，所得初乳的乳化效果较好，且猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的降解不明显(如图2所示)。本实施方式步骤一中采用7000r/min的转速，所得复乳的乳化效果较好，且猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的降解不明显(如图3所示)。本实施方式步骤一中所得复乳的油相中PLGA的浓度(m/v)为4% ；DNA疫苗与 PLGA 的比例(mg/mg)为 0. 5%。
本实施方式方法制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球在_20°C条件下保存3个月，然后电镜观察(如图1所示)，PLGA猪流感DNA疫苗微球形态规贝U、外形圆整，表面光滑、分散性好，粒径为6. 08 士 2. 34 μ m。本实施方式制 备的PLGA猪流感DNA疫苗微球，加入2mL 二氯甲烷使其完全溶解， 溶解后加入5mL PBS,涡旋振荡30min，4000r/min离心lOmin，取上清用紫外分光光度仪测定萃取出的DNA的浓度，即可计算出DNA的含量。再根据公式计算出包封率和载药量包封率(％ ) = PLGA猪流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的测得含量+制备时猪流感DNA疫苗的理论载药量X 100%载药量(％ ) = PLGA猪流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的测得含量+PLGA猪流感 DNA疫苗微球的重量X 100%结果本实施方式中制备的制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球的包封率平均为 60% 士3.8%，载药量平均为 5.5% 士0.5%。本实施方式制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球，通过Western-blot检测微球包裹后猪流感DNA疫苗的体外表达情况。检测步骤如下接种293T细胞于经多聚赖氨酸处理的六孔细胞培养板内，次日将猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA从PLGA微球中提取出来。然后将提取出的4yg质粒转染生长状态良好的293T细胞，转染方法参照脂质体转染试剂盒(LipOfectamineTM2000reagent)说明书进行。转染48h后，收集细胞并用 RIPA裂解液溶解，将溶解物低温高速离心后，-20°C备用。Western blot实验按李国新等 艮道的方法执行(Li GX, Qiu HJ, Han CG, et al. Vaccination of plasmid DNA encoding somatostatin gene fused with GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces anti_GP5 antibodies and promotes growth performance in immunized pigs [J]. Agricultural Sciences in China. 2006,5(3) :234_240.)。上清液样品与IX SDS上样缓冲液混合，煮沸5min，制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，按20 μ L/ 孔点样，在100-120V条件下电泳，电泳结束后，在半干电转印仪上3ν条件下电转2h，将蛋白充分转移至硝酸纤维膜上。IXPBS洗膜5min，5%的脱脂乳4°C封闭过夜，然后用1 500稀释的兔抗H3N2亚型猪流感病毒的阳性血清与膜在37°C孵育lh，PBST洗4次(每次5min)， 然后用1 5000稀释的Odyssey红外标记的第二抗体于37°C避光孵育lh，PBST洗5次后， 再用PBS洗2次，每次5min。用Odyssey红外成像系统扫描分析。结果表明(见图4)，微球包裹后的猪流感DNA疫苗能够在体外培养的293T细胞中进行抗原表达，较好地保持了生物学活性。质粒TM主要是以非分泌形式表达，蛋白表达后大部分附着在细胞上，很少分泌到培养液中，其转染后的细胞裂解液在72-lOOkDa之间检测到了一条带。本实施方式制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球，通过BALB/c小鼠免疫接种试验检测本实施方式制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球的免疫效果。检测步骤如下选取6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠40只(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供并饲养)，随机分成4组，分别为PLGA微球疫苗试验组、裸DNA疫苗组、空白微球和生理盐水对照组。肌注给药的微球混悬于生理盐水中。免疫前2d，各组小鼠每只胫骨前肌注0.2%的盐酸利多卡因100 μ L，每个腿各50 μ L0免疫剂量为每只小鼠100 μ g质粒，后腿肌肉注射，共免疫3次，每次间隔3周。分别在三免后第2周、第4周、第6周、第8周断尾采血，分离血清。采用ELISA法和血凝抑制试验检测抗血清抗体水平。 试验结果(如图5和表1所示)表明，经PLGA微球包裹后的猪流感DNA疫苗能刺激特异性B细胞，增强体液免疫应答，产生的结合抗体水平有了显著的提高，PLGA猪流感 DNA疫苗微球组体液免疫明显高于裸猪流感DNA疫苗组，且抗体水平持续时间长起到了缓释的作用。 表1免疫小鼠HI抗体检测结果
权利要求
1. PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，其特征在于PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备一、称取25mg的PLGA溶于0.75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为 7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，得复乳；二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心lOmin，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10 _50°C的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一 40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA ；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120 μ g/mL。
全文摘要
PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，它涉及DNA疫苗微球的制备方法。它解决了现在猪流感DNA疫苗存在持续时间短，在体内易被降解，不能缓释的问题。方法一、PLGA溶于二氯甲烷中，加猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，乳化后加聚乙烯醇，得复乳；二、复乳磁力搅拌后离心，收集微球并洗涤，再真空冷冻干燥即完成。本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球大小均匀，外形圆整，表面光滑，粒径为6.08±2.34μm，包封率平均为60％±3.8％，载药量平均为5.5％±0.5％；在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，延长药物作用时间，实现了药物的缓释。
文档编号A61K9/14GK102319441SQ20111028058
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者赵凯 申请人:黑龙江大学