专利名称：包含多聚谷氨酸纳米粒子和如cd40激动剂的多肽的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物，其用于刺激受试者的免疫系统，例如用于治疗癌症或病毒感染或在疫苗接种期间。
背景技术：
癌症免疫疗法癌症是发达国家中死亡的第二个主要原因。近十年来，某些肿瘤的治疗已经被显著地改善。然而，传统的癌症治疗方法，如外科手术、放射疗法和化学疗法，需要通过可替代的方法来补充，特别是对于已扩散的癌症形式。一个有前途的方法是癌症免疫疗法，其目的在于诱导能够控制和摧毁癌症细胞的有效的和特异性的免疫应答。即使癌症细胞经常唤起特异性免疫应答，但是对于清除恶性肿瘤细胞而言，该应答通常是不足的。这归因于阻断抗肿瘤免疫应答的肿瘤介导的免疫抑制机制^然而，这些抑制机制能够被免疫治疗策略逆转，所述免疫治疗策略目的在于I)通过例如CD40或Toll样受体(TLR)来激活专职性抗原提呈细胞(APC)如树突细胞(DC)，2)使用细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-α来刺激淋巴细胞，或者3)通过靶向例如细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)或抑制受体程序性死亡I (PD-I)来阻断抑制T细胞活化的信号。免疫疗法已经被用于治疗例如膀胱癌和恶性黑色素瘤。已经证明，膀胱癌中的细胞因子环境具有免疫抑制属性，这使其成为免疫治疗性干预的优良靶点2。事实上，用活的、减毒的杆菌卡介苗(BCG)的膀胱内治疗通常被用于膀胱癌中的免疫疗法2。业已尝试许多免疫疗法来治疗恶性黑色素瘤。使用肿瘤浸润性T淋巴细胞输注联合大剂量的IL-2的免疫治疗方法已显示产生了显著的客观反应率(objective response)。然而,仍然迫切需要针对这些适应症的更有效的免疫治疗策略。CD40在免疫系统中起核心作用，这使其成为免疫疗法的令人高度关注的靶点。它是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族中的一员，并且在免疫系统的各种细胞上表达，如B细胞、单核细胞和树突细胞，然而⑶40配体(⑶40L)主要表达于活化的T细胞上3。⑶40L介导的信号传导引发数个生物学事件，包括激活、增殖、细胞调亡的补救，以及细胞因子和趋化因子的产生3。在包括动物模型和临床试验的免疫治疗设置中，已经将抗⑶40抗体用于⑶40的直接刺激3_6，以阻断CD40-CD40L的相互作用，或通过直接靶向肿瘤细胞来治疗自身免疫性疾病7’8。抗CD40抗体已经被描述为是激动性的(即能够通过CD40激活细胞)或是拮抗性的(即能够阻断CD40L诱导的CD40的激活)。由于免疫治疗性应用目的在于激活免疫应答或破坏耐受，因此正在寻找强力的激动性抗体。能够提高这样的抗体的刺激/激活效力的方法将是非常有益的。CD40是一种I型膜蛋白，其在免疫系统中起核心作用。它是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的一员并且表达于各种细胞上，例如B细胞和树突细胞(DC)以及数种类型的癌细胞上⑶40配体(⑶40L)主要表达于活化的T细胞上H。⑶40L介导的信号传导引发各种生物学事件，包括免疫、细胞激活、增殖，以及细胞因子和趋化因子的产生(由U评述)。另外，它还能够诱发数个癌细胞中的细胞凋亡(由8_1(|评述)。已经显示，通过⑶40诱导信号的最低要求是受体二聚体的形成n，并且受体介导的信号的强度与细胞外应用的配体增加的化合价有一一对应的关系12。通过CD40的细胞内信号传导取决于与不同的细胞内识别基序(recognition motifs)相互作用的适配分子(最显著的是TNFR相关因子(TARF)家族)13_15。⑶40的细胞外交联导致这些细胞内适配分子的稳定，其反过来引发信号传递级联。⑶40激动剂具有两方面的作用1)免疫激活导致肿瘤特异性T细胞应答，和ii)对表达CD40的肿瘤的直接凋亡作用(取决于肿瘤的种类)。在许多研究中，很难辨析其机制，但是已经证明，CD40激动剂对CD40阴性肿瘤同样具有抗肿瘤作用16。CD40刺激还具有被用作癌症疫苗中的佐剂的潜力。临床前研究已经阐述数种癌症类型的激动性抗CD40抗体治疗的观念验证16_21。已 经证明对淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌等的抗肿瘤作用。除了潜在的抗肿瘤作用，已经显示出系统性抗CD40治疗还引起副作用(休克综合症、细胞因子释放综合症(CRS))。然而，当将抗CD40抗体直接注射入肿瘤中时，没有发现这些副作用，但是其引起系统性抗肿瘤作用16。一侧肿瘤内处理的小鼠能够清除对侧的肿瘤16。这种抗肿瘤作用取决于DC激活和随后的CTL应答的激活21，其还导致对于肿瘤再次挑战的保护性免疫。这些结果已经由Jackaman等人证实22。他们研究恶性间皮细胞瘤模型(C57BL/6J)中抗⑶40抗体单独或与IL-2联合的肿瘤内注射。已经在临床前模型中评价了数个人源化的或人的抗⑶40抗体23_31。主要在基于人类肿瘤异种移植入SCID小鼠的体内模型中评价了这些抗体。在一项研究中，使用人类单核细胞衍生的树突细胞(单核细胞衍生的树突细胞)和初始T细胞(naive T cell)重新住入的SCID已经证明对CD40阴性肿瘤的作用(Gladue，2008, ASC0)。因此，在癌症治疗中使用CD40激动剂的绝大多数的临床前研究已经证明非常潜在的抗肿瘤作用。已经证明本位的、肿瘤内CD40刺激产生了系统性抗肿瘤和转移清除的作用，而没有与系统性CD40刺激相关的副作用。在I期临床试验中，抗⑶40治疗已经产生有前途的结果，并且到目前为止已测试的每一个抗CD40蛋白质药物均报道了其客观的临床反应1(1。已经在临床试验中用于癌症治疗的(最近由Vonderheideici;32评述)CD40激动剂包括CD40L (Avrend) 33, 一种强的激动性抗 CD40 抗体(Pfizer 的 CP-870, 893)34,和一种弱的激动剂(SGN-40, dacetuzumab, SeattleGenetics/Genentech)ο纳米粒子纳米粒子(即典型地具有约100至300nm的直径的粒子)是在免疫疗法领域中具有巨大潜力的新型工具。它能够被用作生物分子的有效转运体，所述生物分子如DNA、RNA或蛋白质，其或者附着于粒子表面或者包封于粒子之中。对于所载生物分子的缓释以及诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的抗原提呈细胞的激活，不同的纳米粒子变体已经显示出巨大的潜力 ' 目前在纳米药物应用中评价了数个不同的粒子类型，如聚苯乙烯粒子、聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)粒子和聚(Y-谷氨酸)(Y -PGA)粒子。聚苯乙烯粒子已经显示出在产生DC熟化方面是有效的n，然而，它们不是可生物降解的，因此较不适合于治疗应用。另一方面，PLGA粒子是完全可生物降解的，然而，该方法也存在一些问题，如水溶性蛋白质的低包封率和在纳米粒子的制备、储存和冻干过程中引起的不稳定性。近来，已经描述基于自组装两亲性聚合Y -PGA纳米粒子的新型蛋白质递送系统，其是完全可生物降解的36。已经证明，这些粒子对于蛋白质递送而言是有效的并且能够用于诱导疫苗模型系统中的特异性T细胞应答1(1。已经报道了用于癌症治疗的包含被包封在基于右旋糖酐的粒子中的抗⑶40抗体的缓释组合物 ' 所使用的右旋糖酐粒子是微尺度级的并且被构建为将抗体包封在粒子之中。在局部施用方法中使用这样的缓释制剂具有数个目的，包括使抗体从待治疗的局部区域的渗漏最小化，以便于降低毒性和与抗体的系统性释放相关的其它不良反应。另外，缓释可以达到减少的给药频率。尽管在免疫疗法和纳米粒子应用领域中具有上述发展，但是仍然需要新的治疗方法用于刺激免疫系统，特别是治疗癌症
发明内容
·本发明的第一个方面提供一种药物组合物，其包含在药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的(a)免疫刺激性多肽；和(b)纳米粒子；其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。如本文使用的，“药物组合物”指根据本发明的治疗有效的制剂。如本文使用的，“治疗有效量”，或“有效量”，或“治疗有效的”指的是对于给定条件和施用方案提供治疗效果(例如刺激免疫系统)的量。这是一个经计算以产生合意的治疗效果的活性物质的预定量联合所需的添加剂和稀释剂，即载体或施用载体。另外，其是指足以降低并且最优选预防在宿主的活性、功能和应答方面临床上的显著性缺陷的量。作为选择的，治疗有效量足以引起宿主中临床上的显著症状的改善。如本领域技术人员所领会的，化合物的量可以根据其特定的活性而改变。适当的剂量可以包括经计算以产生合意的治疗效果的活性化合物的预定量联合所需的稀释剂。在用于生产本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。如本领域所公知的，治疗有效量能够由本领域的普通医学或兽医学人员基于患者的特征，如年龄、体重、性别、症状、顺应性、其它疾病等而确定。本领域技术人员将领会本发明组合物的这样的有效量可以被作为单次剂量递送(即急性施用)，或者更优选地，被作为经时的一系列剂量递送(即慢性施用)。所述组合物的有效量还可以通过局部施用或系统性施用被递送。在一个实施方案中，所述免疫刺激性多肽和纳米粒子作为混合物提供(即组分彼此不是共价结合或不被包封在彼此之中，例如将免疫刺激性多肽包封在纳米粒子之中)。这样的混合物可以通过两种组分的简单混合而方便地制备，任选地具有洗涤步骤，因此允许一种快速的和稳健的方案，其避免了对于可能损坏免疫刺激性多肽组分的完整性的溶剂的需要(参见下面的实施例)。本领域技术人员将领会，尽管最初于组合物中分别配制，然而混合的组分可以非共价地彼此联合或吸附。因此，在一个实施方案中，一些或者全部的免疫刺激性多肽分子可以被非共价地固定在纳米粒子上，例如被吸附于纳米粒子的表面上。这种吸附是非常温和的，并且与使用化学修饰的方案(如将抗体共价偶联于或固定于纳米粒子的表面上)相比，这种吸附引起免疫刺激性多肽(例如抗体)的功能活性的较小损失36。在一个优选的实施方案中，所述组合物在体外和/或体内能够展现出协同的免疫刺激作用。本上下文中的“协同的”是指与分别施用组分(a)和(b)的附加免疫刺激作用相比，包含两种组分(a)和(b)的组合物更大程度地激活免 疫系统(或者其组分)。本领域技术人员将领会，出于许多不同的目的，本发明的组合物适合于刺激受试者的免疫系统。因此，本发明涵盖抗癌组合物、疫苗组合物和抗病毒组合物。本发明组合物的第一个必备组分是免疫刺激性多肽。在一个实施方案中，所述多肽能够激活专职性抗原提呈细胞(APC)，如树突细胞(DC)。使用本领域熟知的方法可以完成这样的多肽的鉴定,例如Baal JW等人，An improvedprotocol for generation of immuno—potent dendritic cells through directelectroporation of CD14+monocytes. J Immunol Methods 2007; 321 (1-2) : 94-106 中所描述的。根据权利要求6所述的组合物，其中所述多肽能够激活⑶40。可选地，或者另外地，所述多肽能够刺激淋巴细胞。此外，使用本领域熟知的方法可以鉴定展示出这样的属性的多肽，例如Pound JD等人，Minimal cross-linking andepitope requirements for CD40_dependent suppression of apoptosiscontrast withthose for promotion of the cell cycle and homotypic adhesions in human B cells.Int Immunol 1999; 11 (I) : 11-20 中所描述的。在一个特别的实施方案中，本发明组合物的多肽组分是抗体，或所述抗体的抗原结合片段。对于“抗体”，包括大体上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、单链抗体、双特异抗体(例如，对于CD40和另一种免疫刺激性受体，如CD137均有亲合力)、重链抗体、轻链抗体、重链和/或轻链抗体的同源二聚体和异源二聚体，以及所述抗体的抗原结合片段和衍生物。对于“抗原结合片段”，指能够如同完整的“母源”抗体一般结合至相同抗原的抗体的功能性片段。例如,所述抗原结合片段可以选自Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)、单可变结构域(例如V1^P \结构域)以及结构域抗体(dAb,包括单式或双式[即dAb-接头_dAb])。使用抗体片段而不是整个抗体的可能的优势是多方面的。尺寸更小的片段可以导致改善的药理学属性，如固体组织的更好的渗透。此外，抗原结合片段，如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段能够在大肠杆菌中表达并且从大肠杆菌中分泌出来，因此允许大量所述片段的简易生产。本发明的范围中还包括抗体及其抗原结合片段的修饰体，例如通过聚乙二醇或其它适当的聚合物的共价结合来修饰。产生抗体和抗体片段的方法是本领域熟知的。例如，通过采用诱导抗体分子的体内产生、免疫球蛋白库的筛选(Orlandi.等人，1989. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 86:3833-3837;Winter et al. , 1991, Nature 349:293-299)或通过培养物中的细胞株产生单克隆抗体分子的数种方法中的任何一种可以产生抗体。这些包括，但不限于，杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术，和Epstein-Barr病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler等人，1975. Nature 256:495-497;Kozbor 等人，1985.J.Immunol. Methods81:31-42;Cote等 A , 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole 等人，1984. Mol. Cell.Biol.62:109-120)。通过已知的技术可以制备针对选定抗原的适当的单克隆抗体，例如在“Monoclonal Antibodies:Amanual of techniques”，H Zola (CRC 出版社，1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications，，，J G R Hurrell(CRC出版社，1982)中描述的那些。使用本领域熟知的方法能够得到抗体片段(参见，例如，Harlow &Lane, 1988, “Antibodies:A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)。例如，根据本发明的抗体片段能够通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中编码所述片段的DNA的 表达来制备。可选地，通过常规方法的整个抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化能够获得抗体片段。本领域技术人员将领会，对于人类治疗或诊断而言，优选使用人的或人源化抗体。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是经基因工程处理过的嵌合抗体和优选具有衍生自非人类抗体的最小部分的抗体片段。人源化抗体包括这样的抗体，其中人类抗体(接受者抗体)的互补决定区被来自于具有合意的功能的非人类物种(提供者抗体)例如小鼠、大鼠或兔子的互补决定区的残基替代。在某些情况下，人类抗体的Fv框架残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体还可以包含这样的残基，其既没有在受体抗体中被发现也没有在输入的互补决定区或框架序列中被发现。总之，所述人源化抗体将包含大体上全部的至少一个(并且典型地两个)可变结构域，其中全部的或大体上全部的互补决定区相当于非人类抗体的那些，并且全部的(或大体上全部的)框架区域相当于相关人类共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还包括至少一部分的典型地衍生自人类抗体的抗体恒定区，如Fe 区(参见，例如 Jones 等人,1986. Nature 321:522-525; Riechmann 等人,1988, Nature332:323-329;Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596)。用于人源化非人类抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入到其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基(通常被称为输入残基)典型地取自输入可变结构域。按照描述(参见，例如Jones等人，1986，Nature321:522-525; Reichmann 等人,1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen 等人,1988, Science239:1534-15361;US 4，816，567)通过采用相应的啮齿类互补决定区取代人类互补决定区基本上能够实施人源化。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于一个完整的人类可变结构域被来自于非人类物种的相应序列取代。事实上，人源化抗体可以典型地为人类抗体，其中一些互补决定区残基以及可能的一些框架残基被来自于啮齿类抗体中类似位点的残基取代。还能够使用本领域已知的各种技术来鉴定人类抗体，包括噬菌体展示库(参见，例如，Carlsson & Soderlind, 2001, Expert Rev Mol Diagn. I (I) : 102-8; Hoogenboom &Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks 等人,1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Cole 等人，1985，In:Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77;Boerner等人，1991. J. Immunol. 147:86-95)。一旦获得适当的抗体，可以测试它们的活性，例如通过ELISA。因此，在一个实施方案中，所述多肽可以是整个抗体(如IgG分子)。可选地，所述多肽可以是这样的抗体的抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体是重组抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。所述抗体(或其抗原结合片段)可以靶向已知在免疫系统中具有调节作用的任何抗原。然而，优选地，其中所述抗体(或其抗原结合片段)能够特异性结合至选自CD40、 CD 137、0X-40及其受体的抗原。在一个优选的实施方案中，所述抗体(或其抗原结合片段)能够特异性结合至CD40(如人类CD40，例如参见NCBI参考序列:NP 001241.1)。⑶40包含四个细胞外结构域(指定为D1、D2、D3和D4)，其中每一个被细分为A-模块和 B 模块(参见 Naismith 等人，Modularity in the TNF-receptor family. Trends inBiochem. Sci 1998，23:74_79)。在一个实施方案中，所述抗体(或其抗原结合片段)能够特异性结合至CD40的结构域I的模块B2 (或包含所述模块的表位)。适当的抗体(以及其抗原结合片段和变体)在Ellmark等人，Modulation of theCD40-CD40 ligand interaction etc 2002 Immunology 106:456-463 中有所描述。在关于本发明组合物的另一个优选的实施方案中，所述免疫刺激性多肽是CD40激动剂(即所述多肽活化剂，至少部分是CD40受体)。使用本领域熟知的方法可以鉴定具有 CD40 激动剂属性的多妝,例如 Pound JD Int Tmmunol 1999; 11 (I) : 11-20，Ledbetter 等人，Critical Reviews in Immunolog 1997，Ellmark 等人 2002Immunolog 中所描述的。适当的⑶40激动剂包括(但不限于)0)40L (如Avrend[Immunex Corp])、抗0)40抗体以及所述抗体的抗原结合片段和变体(如CP-870-893 [Pfizer]和SGN-40 [SeattleGenetics/Genentech])。在另一个优选的实施方案中，所述多肽能够通过⑶40直接激活T细胞和/或通过经由CD40的树突细胞的激活间接激活T细胞，和/或能够对表达CD40的肿瘤细胞产生直接的凋亡作用。本发明组合物的第二个必备组分是PGA纳米粒子。在一个实施方案中，所述PGA可以选自Y -PGA, a -PGA、PGA的水溶性盐和PGA的
金属盐。因此，在一个实施方案中，所述纳米粒子包含Y-PGA或由Y-PGA组成。人们相信可生物降解的Y -PGA纳米粒子能够提供数个优势，包括纳米级范围的有利的尺寸，吸附抗体的有利的释放属性和有利的生物分布44 (由纳米粒子的尺寸引起)。Y-PGA纳米粒子具有独特的释放属性，其归因于纳米粒子的性质和吸附于它们表面的免疫刺激性多肽(例如抗体)的特异性类型，这可以提供癌症治疗中增强的作用。可以影响纳米级粒子的生物分布的另一个因素在于它们与病毒处于相同的尺寸范围。抗原提呈细胞(APC，例如B细胞、巨噬细胞和树突细胞)在摄取和加工这种尺寸的粒子上特别有效46’47。当靶向APC时，通过向合适的细胞提供刺激性信号，进而促进纳米粒子的摄取和降解，可以证明这种优势。与微米级的粒子相比，小尺寸的纳米粒子还增加了表面与质量的比例，这允许免疫刺激性多肽的更加有效的吸收。在另一个实施方案中，所述纳米粒子进一步包含疏水性氨基酸，或其酯。例如，所述疏水性氨基酸可以是苯丙氨酸。因此，所述纳米粒子可以包含轭合于YPGA链上的苯丙氨酸乙酯或由轭合于Y PGA链上的苯丙氨酸乙酯组成。在一个优选的实施方案中，所述纳米粒子是可生物降解的。本领域技术人员将领会，所述纳米粒子可以具有统一的或可变的尺寸。在一个实施方案中，所述纳米粒子具有25至500nm,例如IOOnm至300nm的平均粒径。例如，所述纳米粒子可以具有200nm的平均粒径。在另一个实施方案中，所述纳米粒子具有负性表面电荷。例如，所述负性表面电荷·可以在-IOmV至-35mV之间，例如约-15mV。在另一个实施方案中，所述纳米粒子能够结合至toll样受体(TLR)Jn TLR-2和/或 TLR-4。本领域技术人员将领会，本发明的两个必备组分的上述实施方案可以以任何组合的形式来组合。因此，在一个实施方案中，本发明第一个方面的组合物可以包含以下物质的混合物(a)CD40 激动剂；和(b) Y PGA 纳米粒子。例如，所述组合物可以包含(a)抗⑶40抗体或其抗原结合片段；和(b)包含轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯或由轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯组成的纳米粒子。在一个这样的优选实施方案中，所述纳米粒子具有200+/_50nm的平均粒径。本领域技术人员将进一步领会，本发明的组合物可以包含另外的组分。因此，在一个实施方案中，所述组合物可以包含第二种免疫刺激性多肽。因此，所述组合物可以包含这样的多肽的组合，例如包含下述多肽的两种或多种CD 137 抗体、CD40 抗体和 0X-40 抗体。在另一个实施方案中，所述组合物可以包含抗原。因此所述组合物可以包含癌细胞抗原。本发明的组合物可以适合于通过任何已知的途径来施用，包括外用的、局部的和系统性的。本发明组合物的活性组分能够以各种浓度来配制，这取决于正在使用的多肽/纳米粒子的功效/毒性及其所针对的适应症。例如，所述组合物可以包含浓度介于O. ΙμΜ至ImM之间，更优选ΙμΜ至100 μ M之间，5 μ M至50 μ M之间，10 μ M至50 μ M之间，20 μ M至40 μ M之间并且最优选约30 μ M的多肽组分。本领域技术人员将领会，所述活性组分通常与根据预期施用途径和标准药学实践而选择的适当的药学赋形剂、稀释剂或载体混合施用(例如，参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy, 19th 版,1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack PublishingCompany,Pennsylvania, USA)。例如,所述组合物可以被配制以便适合于非肠道的、夕卜用的、经口的、通过吸入的和以栓剂或子宫托形式的施用。因此，在一个实施方案中，所述组合物用于非肠道的，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部的(如肿瘤内的、瘤周内的、瘤周的、结节内的)、静脉内的、肌肉内的、皮下的、鞘内的、颅内的和/或脑室内的施用，或者它们可以通过输注技术来施用。这样的组合物最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可以包含其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使得溶液与血液等渗。如果必要的话，所述水溶液应为适当地缓冲的(优选至pH从3至9)。通过本领域技术人员熟知的标准药学技术很容易完成无菌条件下适当的非肠道制剂的制备。适合于非肠道施用的制剂包括水性的和非水性的无菌注射溶液和水性的和非水性的无菌混悬液，所述水性的和非水性的无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；并且所述水性的和非水性的无菌混悬液可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在使用之前立即被储存于仅需加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻 干)的条件中。临时的注射溶液和混悬液可以由之前描述的无菌粉末、颗粒和片剂种类来制备。本发明的组合物还能够鼻内的或通过吸入施用，并且以干粉吸入剂或气雾喷雾剂的形式方便地递送，所述干粉吸入剂或气雾喷雾剂从使用适当的抛射剂的加压容器、泵、喷雾器或雾化器中呈现出来所述适当的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如I, I, 1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或I, I, 1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供一个按计量递送的阀门来确定剂量单位。所述加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物的溶液或混悬液，例如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，例如山梨坦三油酸酯。可以配制在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如从明胶制得)以含有本发明化合物与适当的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。优选安排气雾剂或干粉制剂以便每一个计量或“喷(puff)”含有至少Img的用于递送至患者的本发明化合物。将领会的是，气雾剂的整体日剂量将在患者与患者之间发生变化，并且以一天当中可以单剂量或者(更普遍的)分次剂量来施用。可选地，本发明组合物能够以栓剂或子宫托的形式来施用，或者它们可以洗剂、溶液剂、霜剂、软膏剂或粉状散剂的形式来外用。本发明的组合物还可以被经皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂。它们还可以通过眼睛途径来施用。对于眼科用途而言，本发明试剂能够被配制成在等渗的、pH调节的、无菌的生理盐水中的微粒化混悬剂，或者优选地，被配制成在等渗的、PH调节的、无菌的生理盐水中的溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。可选地，它们可以被配制成软膏剂如凡士林。对于外部应用于皮肤而言，本发明的组合物能够被配制成适当的软膏剂，所述软膏剂含有活性化合物，所述活性化合物悬浮或溶解在以下一种或多种物质的混合物中，所述物质例如矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚丙乙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，它们能够被配制成适当的洗剂或霜剂，其悬浮或溶解在以下一种或多种物质的混合物中，所述物质例如矿物油、山梨坦单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六醇酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。适合于在嘴中外部施用的制剂包括在调味基质中包含活性成分的糖锭，所述调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或者黄芪胶；在惰性基质中包含活性成分的锭剂，所述惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及在适当的液体载体中包含活性成分的漱口剂。在一个特别的实施方案中，所述组合物被配制成缓释药物递送系统。可选地，本发明的组合物能够通过将药物直接释放至所需位点的外科植入式装置来施用。本发明的第二个方面提供用于药物的如上所述的组合物。本发明的第三个方面提供用于刺激患者免疫系统的如上所述的组合物。·在一个实施方案中，所述组合物用于治疗癌症。例如，所述癌症可以选自淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和白血病。对于“治疗”，包括患者的治疗性治疗和预防性治疗。术语“预防性”被用于涵盖本文描述的多肽或制剂的用途，其或者预防或者降低患者或受试者中癌症的可能性。本领域技术人员将领会，所述组合物可以与一种或多种常规抗癌疗法联合使用，如化学疗法、放射疗法和/或外科手术。在另一个实施方案中，所述组合物用于治疗病毒感染(例如，HIV/AIDS)。在另一个实施方案中，所述组合物用于治疗自身免疫性疾病。本发明相关的第四个方面提供根据本发明第一个方面的组合物在制备用于刺激患者免疫系统的药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症。例如，所述癌症可以选自淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和白血病本领域技术人员将领会，所述药物可以与一种或多种常规抗癌治疗方法联合使用，如化学疗法、放射疗法和/或外科手术。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗病毒感染(例如，HIV/AIDS)。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。本发明的第五个方面提供用于刺激受试者免疫系统的方法，其包含向所述受试者施用根据本发明第一方面的组合物。在一个实施方案中，所述方法用于治疗受试者中的癌症(如上所讨论)。在另一个实施方案中，所述方法用于治疗受试者中的病毒感染(如上所讨论)。在另一个实施方案中，所述方法用于治疗受试者中的自身免疫性疾病(如上所讨论)。本领域技术人员将领会，所述组合物可以通过本领域已知的任何途径施用于受试者。因此，所述组合物可以非肠道地于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用于受试者。在本发明的用途和方法的一个实施方案中，所述组合物用于在位点处或在位点附近的局部施用，在那里免疫刺激将有益于患者。这样的用途提供了免疫系统的增强的局部刺激(例如在肿瘤中和在肿瘤周围)，包括THl-型细胞因子的释放。同时，本发明组合物可以提供降低的系统性免疫刺激，例如降低与细胞因子向身体的“全球性”释放有关的不良反应(如肝损伤)。本发明的第六个方面提供各部分的试剂盒，其包含(a)免疫刺激性多肽；和(b)纳米粒子。在一个实施方案中，在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中分别配制组分(a)和(b)。可以适合于与其它组分共同施用的形式提供每一个组分(a)和(b)。对于术语“与……共同施用”，包括所述试剂盒的两个组分(免疫刺激性多肽和纳 米粒子)或者一起或者在时间上充分紧密地施用(任选反复地)，以便能够对患者产生有益效果，所述效果在相关症状的整个治疗过程中与如果单独施用(任选反复地)仅包含免疫刺激性多肽，或仅包含纳米粒子，而不存在其他成分的制剂，在相同的整个治疗过程中产生的效果更大。关于治疗特定症状以及在治疗特定症状的整个过程中一种组合是否提供更大的有益效果的确定取决于治疗或预防的症状，但可以由本领域技术人员常规地获得。在一个实施方案中，组分(a)和/或(b)是冷冻干燥的。在另一个实施方案中，在密封的、灭菌的容器中提供每一个组分(a)和(b)。本领域技术人员将领会，组分(a)可以如上面关于本发明的第一个方面所述。同样地，组分(b )可以如上面关于本发明的第一个方面所述。本发明的试剂盒可以进一步包含用于实施根据本发明第五个方面的方法的说明。本发明的第七个方面提供用于药物的，与纳米粒子联合的免疫刺激性多肽，其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。在一个实施方案中，所述免疫刺激性多肽如上面关于本发明的第一个方面所述。因此，所述免疫刺激性多肽可以为CD40激动剂，如抗CD40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述免疫刺激性多肽与Y PGA纳米粒子联合用于药物。在另一个实施方案中，所述免疫刺激性多肽用于治疗癌症。所述免疫刺激性多肽可以非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用。本发明的第八个方面提供用于药物的，与免疫刺激性多肽联合的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。在一个实施方案中，所述纳米粒子如上面关于本发明的第一个方面所述。因此，所述纳米粒子可以包含Y PGA或由Y PGA组成。例如，所述纳米粒子可以包含轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯或由轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯组成。在另一个实施方案中，所述纳米粒子与CD40激动剂联合用于药物，所述CD40激动剂如抗CD40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述纳米粒子用于治疗癌症。所述纳米粒子可以非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(例如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用。本发明的第九个方面提供用于制备根据本发明第一个方面的组合物的方法，其包含将免疫刺激性多肽和纳米粒子与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合。
下面将参考以下附图，描述体现本发明某些方面的优选的、非限定性实例图Iy -PGA纳米粒子和抗⑶40抗体的混合物对⑶40诱导的B细胞增殖具有强的协同作用。将来自于血液的人CD19+B细胞与不同浓度的抗CD40抗体在不存在或存在100 μ g/ml y -PGA纳米粒子的条件下培养72h。未处理的细胞或采用Y -PGA纳米粒子单独处理的细胞用作对照。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SEM的刺激指数(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=I，n=3个供体。图2通过采用固定在Y-PGA纳米粒子上或与Y-PGA纳米粒子混合的抗⑶40抗体刺激而诱导的B细胞增殖的比较。将人血CD19+B细胞与不同浓度的抗CD40抗体单独培养72h,所述抗⑶40抗体固定在Y -PGA纳米粒子上(imm)或与Y -PGA纳米粒子混合。未处理的细胞和采用在采用固定的/混合的CD40抗体的刺激中存在的对应浓度的Y -PGA纳米粒子刺激的细胞用作对照。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SEM的刺激指数(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=1，n=3个供体。图3对采用包封于Y -PGA纳米粒子中的抗CD40抗体的刺激作出应答的B细胞增殖。将人血⑶19+B细胞与不同浓度的游离的或包封的(ecp)抗⑶40抗体培养72h。未处理的细胞和采用在采用包封的CD40抗体的刺激中存在的对应浓度的Y -PGA纳米粒子刺激的细胞用作对照。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SEM的刺激指数
(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=I，n=3个供体。图4将鼠类脾脏⑶19+B细胞与不同浓度的抗⑶40抗体(FGK-45)在不存在或存在100 μ g/ml y -PGA纳米粒子的条件下培养72h。未处理的细胞或采用Y -PGA纳米粒子单独处理的细胞用作对照。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SEM的刺激指数(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=1，n=2个脾脏。图5单核细胞衍生的树突细胞上TLR2或TLR4的阻断减少了 Y-PGA纳米粒子(NP)的刺激性作用。将未成熟的单核细胞衍生的树突细胞与20 μ g/ml TLR2或TLR4中和的抗体(Ab)孵育lh，然后采用100 μ g/ml Y-PGA纳米粒子刺激48h。采用流式细胞术来分析HLA-DR、⑶86和⑶80表达水平的变化。C表示未处理的对照。图中显示了平均荧光强度(MFI) 土SEM，n=5。通过配对的学生氏双尾t检验来确定统计学显著性(*=p〈0. 05，**=ρ〈0· 01)。图6
将CD40抗体吸附在Y -PGA纳米粒子表面上。将Y -PGA纳米粒子(100 μ g/ml)和抗⑶40抗体(B44，4. 3 μ g/ml)的混合物于4°C孵育15分钟，然后通过离心洗涤三次。采用
Y-PGA纳米粒子和抗CD40抗体的新鲜混合物(第O次洗涤)或在第1、2或3次洗涤之后回收的抗⑶40抗体/y-PGA纳米粒子混合物将人⑶19+B细胞刺激72h。未处理的细胞或采用Y-PGA纳米粒子或抗⑶40抗体单独处理的细胞用作对照。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SD的刺激指数(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=0，n=2个供体。图7不同的基于聚合物的纳米粒子的比较。将人⑶19+B细胞与100 μ g/ml Y-PGA或聚交酯纳米粒子，与或不与抗⑶40抗体(4. 3 μ g/ml)孵育72h。通过[3H]胸苷掺入量来分析增殖。数据代表基于CPM值+/-SD的刺激指数(SI)，其中所述未处理的对照代表SI=0，n=4个供体。·图8本发明的纳米粒子组合物预防与CD40激动剂的系统性施用典型相关的细胞因子的释放。在C57BL/6小鼠的皮下MB49 (膀胱癌)肿瘤中，采用抗⑶40抗体、与Y-PGA纳米粒子混合的抗CD40抗体或与Y -PGA纳米粒子混合的同型对照抗体处理之后，研究了细胞因子的释放。处理后的4个小时采集血清样品，并分析IL6、ILlO和TNF-α的水平。学生氏T检验显示FGDK45相对于与Y -PGA纳米粒子混合的FGK45的统计学显著性，对于IL6第22 天，ρ〈0· 05，对于 ILlO 第 15 天，ρ〈0· 00004，对于 TNF α 第 8 天 ρ〈0. 02，第 22 天 ρ〈0. 03。
具体实施例方式实施例I :通过Y -PGA纳米粒子和抗⑶40抗体的混合物的⑶40的协同激活本发明提供药物制剂，所述药物制剂由纳米粒子和蛋白质药物组成，所述蛋白质药物显著地增加所述药物制剂的治疗作用。所述制剂在增加激动性属性、增加蛋白质药物靶向免疫调节分子的交联、增加药物的持续时间和组织滞留方面具有潜力。此外，它们在发挥控释载体功能和减少给药频率方面具有潜力，因此增加了患者的便利性并降低了系统性渗漏和因此产生的系统性副作用的风险。本文所述的协同作用基于CD40进行展示，但是也延伸至其它免疫调节和其它细胞受体，以及受体的组合。因此，本发明提供癌症治疗(免疫疗法)、接种疫苗(癌症、病毒等)以及HIV/AIDS疗法的显著益处。材料和方法使用人CD 19 磁性微球(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)从外周血液(Lund University Hospital, Lund, Sweden)中分离人 CD19-阳性 B 细胞。将细胞在补充有 2mM L-谷氨酰胺和 50 μ g/ml 庆大霉素(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO，USA)以及10% (v/v)高温灭活胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640介质中培养于96孔板中(150. 000 细胞 / 孔)。3H-胸苷(O. 0185MBq/孔或 O. 5μ Ci/孔)购自 Perkin Elmer(Waltham, MA, USA) 将样品在五个平行试验中测试,在β闪烁计数器(Matrix 96 Directbeta counter, Packard, Meriden, CT)中测量 3H_ 胸苷惨入量。通过将疏水性氨基酸(苯丙氨酸)轭合至Y -PGA链上，形成Y -PGA疏水性衍生物(Y -hPGA)来合成所使用的两亲性Y -PGA粒子。具有53%的L-Phe接枝度，具有约200nm的直径的预制备Y-hPGA纳米粒子(由Akashi教授提供，也可参见EP I 932 538 A)用于混合和固定实验(图I和2)。对于具有包封的蛋白质药物的纳米粒子而目(图3),使用粗品(y-hPGA)0⑶40抗体与纳米粒子的混合在将纳米粒子与抗⑶40抗体混合之后，将该混合物加入至细胞培养物中。固定首先通过I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(WSC) (lmg/ml)来活化
Y-hPGA纳米粒子(磷酸盐缓冲液中10mg/ml，pH 5. 8)的羧基基团20分钟。然后将通过离 心(14，OOOXg持续15分钟)获得的纳米粒子(5mg)与Iml蛋白质(I. 75mg/ml)在磷酸盐缓冲的生理盐水中(PBS，pH 7. 4)混合，并且将混合物于4°C孵育24小时。终止反应后，通过离心分离纳米粒子，采用PBS或水洗涤两次，并在PBS中再次悬浮至10mg/ml。将蛋白质包封的纳米粒子添加至相同体积的4%十二烷基硫酸钠(SDS)中以溶解纳米粒子，然后通过Lowry法来确定蛋白质负载量。包封为了制备蛋白质包封的Y-hPGA纳米粒子,将O. 25_4mg蛋白质(Ab)溶解于Iml生理盐水中，并向所述蛋白质溶液中加入Iml Y-hPGA(DMSO中10mg/ml)。将含有包封Ab的纳米粒子的所得溶液于14，OOOXg离心15分钟,并重复漂洗。通过Lowry法来测定蛋白质负载量。将蛋白质包封的纳米粒子添加至相同体积的4%十二烷基硫酸钠(SDS)中以溶解纳米粒子，然后通过Lowry法来确定蛋白质负载量。B细胞增殖分析将人⑶19+B细胞与具有或不具有100 μ g/ml Y -PGA纳米粒子的抗⑶40抗体(O. 07,0. 27、I. 08或4. 33 μ g/ml),或单独与100 μ g/ml y -PGA纳米粒子培养72小时。将包封的和固定的抗CD40抗体以相同的浓度(基于抗体浓度)添加至B细胞中。未处理的细胞用作对照。在孵育的最后16小时期间内加入3H-胸苷以便于评价增殖。根据公式计算刺激指数(SI)值[处理细胞的CPM (每分钟计数)-未处理细胞的CPM]/未处理细胞的CPM。从基于不同供体的三个独立实验中获得数据，根据计算的归一化因子来测量数值。将鼠类⑶19+B细胞与具有或不具有100 μ g/ml Y -PGA纳米粒子的抗⑶40抗体(O. 07、O. 27、I. 08 或 4. 33 μ g/ml),或单独与 100 μ g/ml y -PGA 纳米粒子培养 72 小时。如图I所示，人们发现，Y -PGA纳米粒子和抗⑶40抗体的混合物对⑶40激活具有强烈的协同作用，如B细胞增殖所展示的。这些结果在每一种抗体浓度上是一致的。即便是当增加刺激信号时，单独的CD40抗体和单独的纳米粒子的激活功效也比纳米粒子和抗⑶40抗体的混合物低得多。当将纳米粒子共价固定时(图2)或者当将抗CD40抗体包封于纳米粒子中时(图3)，没有发现这样的作用。如图5中能够看到的，Y-PGA纳米粒子自身具有较小的免疫刺激作用。结合至TLR-2/4并且阻断TLR-2/4的抗体显著地降低了 Y -PGA纳米粒子对moDc的这种免疫刺激作用。因此，所述纳米粒子可以结合于TLR-2/4并且这种相互作用可以成为图I所示的协同作用的基础(至少有一部分)，这将是显而易见的。益论已经显示，通过⑶40来诱导信号的最低要求是受体二聚体的形成n，并且受体介导的信号的强度与细胞外应用的配体增加的化合价有一一对应的关系12。通过CD40的细胞内信号传递取决于与不同的细胞内识别基序相互作用的适配分子(最显著地为TNFR相关因子(TRAF)家族)14;15;35。⑶40的细胞外交联导致这些细胞内适配分子的稳定，其反过来引发信号传输级联。受体交联的越多，则产生越多/越大和越稳定的信号传输复合物。因此可以推测，协同的信号传输作用(显著地高于单独的CD40抗体或单独的纳米粒子的信号传输作用，见图I)归因于更高的⑶40交联等级。已经展示，蛋白质能够非常有效地吸附至这些纳米粒子36。吸附至纳米粒子的⑶40抗体具有交联多个(多于两个)⑶40的潜力。出乎意料地，具有固定至其表面的CD40Ab的纳米粒子(图2)不提供相似的协同作用。尽管它们确实诱导了 CD40激活，但是它们并不比单独的CD40抗体的作用高。CD40抗体的包封展示了甚至更低的激活功效(图3)。 因此，在该实施例中描述的制剂显现了独特的，强烈的协同CD40激活作用，这不但暗示出癌症治疗(膀胱、黑素瘤、乳腺、结直肠、胃、胰腺等)中显著的治疗作用，而且暗示出针对(癌症、病毒、寄生虫、细菌等)的数种类型的疫苗接种制剂中的佐剂效应。另外，这样的⑶40激活作用暗示出HIV/AIDS治疗中的治疗作用42。除了增加所述的抗CD40激活功效以外，本发明的组合物可以增加蛋白质药物靶向免疫调节分子的功能，所述功能的增加通过提高功效(归因于增加的药物持续时间和组织滞留)，减少给药频率进而增加患者的便利性以及降低系统性渗漏和因此产生的系统性副作用的风险来实现。实施例2 :将抗⑶40抗体吸附在Y -PGA纳米粒子的表面上材料和方法为了调查游离的混合⑶40抗体吸附在Y -PGA纳米粒子表面上的程度，将Y -PGA纳米粒子(100 μ g/ml)和抗CD40抗体(B44，4. 3 μ g/ml)的混合物于4°C孵育15分钟。然后将混合物于13000rpm离心10分钟并移除上清液。将剩下的小球重新悬浮至确定的纳米粒子浓度并收回样品。然后重复该步骤两次，总共三次洗涤。在采用新鲜的Y -PGA纳米粒子和抗⑶40抗体的混合物(第O次洗涤)或在第I、
2、3次洗涤之后回收的抗⑶40抗体/ Y -PGA纳米粒子混合物刺激72小时的人⑶19+B细胞上评估增殖。从基于不同供体的两个单独实验中获得数据，根据计算的归一化因子来测定数值。吸附试验研究的结果如图6所示。数据展示，在进行洗涤步骤后本发明示例性的CD40抗体/ Y -PGA纳米粒子组合物保持其对于B细胞刺激的协同作用。在Y-PGA纳米粒子组合物上进行第三轮洗涤后观察到的协同作用与不包括洗涤所观察到的作用低50%。因此，获得本发明组合物中Y-PGA纳米粒子上CD40抗体的吸附或联合。实施例3 :不同纳米粒子的比较
材料和方法将人CD19+B细胞与100 μ g/ml y -PGA纳米粒子或空白聚交酯纳米粒子(250nm规格，Corpuscular Inc. , Cold Spring, NY, USA),具有或不具有抗 CD40 抗体(4· 3 μ g/ml) —起培养。未处理的细胞用作对照，并在72小时至后分析增殖。从基于不同供体的四个单独实验中获得数据，并根据计算的归一化因子来测定数值。益果
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纳米粒子比较研究的结果如图7所示。对于包含具有抗⑶40抗体的空白聚交酯纳米粒子(使用以上实施例I中描述的混合方案)的纳米粒子组合物，没有观察到在实施例I中所证明的本发明示例性的Y PGA纳米粒子组合物对于B细胞刺激的意想不到的协同作用。PLGA和PLA微粒(乳酸羟基乙酸共聚物和聚乳酸)是在纳米粒子制剂中通常使用的另外类型的生物可降解材料。然而，关于基于这些材料的纳米粒子制剂已经报道了一些·问题。例如，亲水性蛋白质的低的包封效率，以及在制备、储存和冻干过程中蛋白质和纳米粒子组合物的稳定性36，44。另外，使用PLGA材料的纳米粒子的生产典型地涉及有机溶剂，其可以影响所述组合物的蛋白质成分的稳定性、完整性和功能。本发明的基于Y PGA纳米粒子的组合物并未受到这样的限制。实施例4 :施用YPGA纳米粒子中抗CD40抗体之后体内细胞因子释放的减少_3] 材料和方法在第O天将3x105MB9细胞(膀胱癌)皮下(s. c)接种于雌性C57BL/6小鼠(TaconicDenmark)的腿部。根据混合方案来混合和制备抗CD40抗体、FGK-45 (BioXCell BEOO16_2)、Rat-IgG2a 或同型对照 2A3 (BioXcell BE0089)和 Y-PGA 纳米粒子。在第8、15和22天，采用吸附至Y-PGA纳米粒子的同型对照对组I (10只小鼠)进行瘤周施用(菱形)。在第8、15和22天，采用10 μ gFGK-45对组2( 10只小鼠)进行瘤周施用(正方形)。在第8、15和22天，采用吸附至Y -PGA纳米粒子的10 μ g FGK-45对组3 (10只小鼠)进行瘤周施用(三角形)。在每一次处理之后的4小时采集血清样本，使用细胞因子珠试验(cytokinebeads assay) (BD CBA Mouse inflammation kit instruction manual^Cat No 552364.BD Biosciences)来分析细胞因子水平。理论检测限IL_65pg/ml、IL-1017. 5pg/ml、TNF
7.3pg/ml。结果该研究的结果如图8所示。用混合物抗⑶40抗体和Y -PGA纳米粒子处理的荷瘤小鼠与用抗⑶40抗体处理的荷瘤小鼠相比具有降低的血清中IL6、ILlO和TNFa的细胞因子浓度。用系统⑶40激动剂的处理与细胞因子释放综合症有关33’34，因此其特征在于细胞因子，例如TNFa和IL-6的释放48。细胞因子水平的提升和生物标记，例如丙氨酸转氨酶(ALAT)和天冬氨酸转氨酶(ASAT)的提升与肝损伤有关33，34，49。本文显示的结果证明本发明的组合物和方法产生降低的IL-6、IL-10和TNF- α的血清水平，表明最小化与⑶40激动剂抗体的系统释放有关的毒副作用(例如肝损伤)的潜力。此外，在用本发明组合物处理后，与用抗⑶40抗体处理相比较，细胞因子IL-12、IFN-Y和MCP-I的血清水平也降低，Mrk因此，本文显示的数据证明本发明的纳米粒子组合物不仅能够协同地增强由抗CD40抗体定位于施用位点(例如在肿瘤中和肿瘤周围)诱导的免疫刺激作用，还有助于最小化典型的与这种抗体有关的不利的系统免疫刺激(其能够导致肝毒性)。实施例5 :用于癌症治疗的体内实验设计在第O天，将2. 5x10s肿瘤细胞(例如Panc02细胞)或3xl05 MB49细胞皮下(s. c)接种于雌性C57BL/6小鼠的右后腿。与Y -PGA纳米粒子混合和/或吸附在Y -PGA纳米粒子上的100 μ I抗⑶40抗体(FGK-45)储备溶液/ 一剂进行肿瘤内和/或瘤周施用三或六 次，每隔三天一次。对于Panc02模型而言，在肿瘤注射后的第5天开始治疗，并且对于MB49模型而言，在肿瘤注射后的第8天开始治疗。在整个实验中监视肿瘤的生长和存活。采用测径尺来测量肿瘤体积，并通过椭球体体积公式来计算肿瘤体积=4/3* π *a(长)*b(宽)*c(高)。然后在小鼠中检测抗体、用于免疫激活的已知生物标记物(例如IL-6、TNF-α、IFN- Y )以及用于肝毒性的标记物(ASAT和ALAT )的药代动力学。检测小鼠长达70天。参考文献I. Schonbeck U, Libby P. The CD40/CD 154 receptor/ligand dyad. Cell MolLife Sci 2001;58(I):4-432. van Kooten C, Banchereau J. CD40-CD40 ligand. J Leukoc Biol2000;67(I):2-17.3.Quezada SA, Jarvinen LZ, Lind EF, Noelle RJ. CD40/CD154 interactions atthe interface of tolerance and immunity. Annu Rev Tmmunol 2004;22:307-28.4. Bajorath J, Marken JS, Chalupny NJ et al. Analysis of gp39/CD40interactions using molecular models and site-directed mutagenesis. Biochemistry1995;34(31):9884-92.5. Bajorath J. Detailed comparison of two molecular models of the humanCD40 ligand with an χ-ray structure and critical assessment of model-basedmutagenesis and residue mapping studies. J Biol Chem 1998;273 (38):24603-9.6. Bajorath J, Chalupny NJ, Marken JS et al. Identification of residues onCD40 and its ligand which are critical for the receptor-1igand interaction.Biochemistry 1995;4 (6):1833-44.7.Singh J, Garber E, Van Vlijmen H et al. The role of polar interactionsin the molecular recognition of CD40L with its receptor CD40. Protein Sci1998;7 (5):1124-35.8. Costello RT, Gastaut JA, Olive D. What is the real role of CD40 incancer immunotherapy Immunol Today 1999;20 (II):488-93.
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权利要求
1.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的 Ca)免疫刺激性多肽；和 (b)纳米粒子； 其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。
2.根据权利要求I所述的组合物，其中所述免疫刺激性多肽和纳米粒子作为混合物提供。
3.根据权利要求I或2所述的组合物，其中所述免疫刺激性多肽非共价结合至所述纳米粒子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够展现出协同的免疫刺激作用。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物选自抗癌组合物、疫苗组合物和抗病毒组合物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽能够激活专职性抗原提呈细胞(APC)，如树突细胞(DC)。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述多肽能够激活CD40。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽能够刺激淋巴细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽是抗体，或所述抗体的抗原结合片段。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽是完整的抗体。
11.根据权利要求I至9中任一项所述的组合物，其中所述多肽是抗体的抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗原结合片段选自Fv片段(例如单链Fv、二硫键键合的Fv和结构域抗体)和Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的组合物，其中所述抗体是重组抗体。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的组合物，其中所述抗体是人的或人源化的。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的组合物，其中所述抗体能够特异性结合至抗原，所述抗原选自⑶40、⑶137、0X-40及其受体。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述抗体能够特异性结合至CD40。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗体能够特异性结合至CD40的结构域I的模块B2，或者包含所述模块的表位。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽是CD40激动剂。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述⑶40激动剂选自⑶40L、抗⑶40抗体及其抗原结合片段和变体以及SGN-40[Seattle Genetics/Genentech]。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽能够通过CD40激活T细胞和/或能够对表达CD40的肿瘤细胞产生直接凋亡作用。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PGA选自Y-PGA、a-PGA、PGA的水溶性盐和PGA的金属盐。
23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子包含YPGA或由Y PGA组成。
24.根据权利要求22和23所述的组合物，其中所述纳米粒子进一步包含疏水性氨基酸或其酯。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述疏水性氨基酸是苯丙氨酸。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子包含轭合至YPGA链上的苯丙氨酸乙酯或由轭合至Y PGA链上的苯丙氨酸乙酯组成。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子是生物可降解的。
28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子具有50至500nm，例如IOOnm至300nm的平均粒径。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述纳米粒子具有200nm的平均粒径。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子具有负性表面电荷。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述负性表面电荷在-IOmV与-35mV之间。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子能够结合至toll样受体(TLR)。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述toll样受体选自TLR-2和TLR-4。
34.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含以下物质的混合物 (a)CD40激动剂;和 (b)Y PGA纳米粒子。
35.根据权利要求34所述的组合物，其包含 (a)抗⑶40抗体或其抗原结合片段；和 (b)包含轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯或由轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯组成的纳米粒子。
36.根据权利要求34或35所述的组合物，其中所述纳米粒子具有200+/-50nm的平均粒径。
37.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包含抗原。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述抗原是癌细胞抗原。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(例如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用。
40.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于药物。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于刺激患者的免疫系统。
42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗癌症。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述癌症选自淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和白血病。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其用于与一种或多种常规抗癌疗法联合，如化学疗法、放射疗法和/或外科手术。
45.根据权利要求I至41中任一项所述的组合物，其用于治疗病毒感染。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述病毒感染是HIV。
47.根据权利要求I至41中任一项所述的组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
48.根据权利要求I至39中任一项所述的组合物在制备用于刺激患者免疫系统的药物中的用途。
49.根据权利要求I至39中任一项所述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述癌症选自淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、骨肉瘤、肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和白血病。
51.根据权利要求49或50所述的用途，其中所述药物用于与一种或多种常规抗癌疗法联合，如化学疗法、放射疗法和/或外科手术。
52.根据权利要求I至39中任一项所述的组合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。
53.根据权利要求52所述的用途，其中所述病毒感染是HIV。
54.根据权利要求I至39中任一项所述的组合物在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
55.一种刺激受试者免疫系统的方法，其包含向受试者施用根据权利要求I至39中任一项所述的组合物。
56.一种治疗受试者癌症的方法，其包含向受试者施用根据权利要求I至39中任一项所述的组合物。
57.一种治疗受试者病毒感染的方法，其包含向受试者施用根据权利要求I至39中任一项所述的组合物。
58.一种治疗受试者自身免疫性疾病的方法，其包含向受试者施用根据权利要求I至39中任一项所述的组合物。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其包含向受试者非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(例如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用所述组合物。
60.—种各部分的试剂盒,其包含 Ca)免疫刺激性多肽；和 (b)纳米粒子。
61.根据权利要求60所述的各部分的试剂盒，其中在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中分别配制组分(a)和(b)。
62.根据权利要求60或61所述的各部分的试剂盒，其中以适合于与其它组分共同施用的形式提供每一个组分(a)和(b )。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的各部分的试剂盒，其中将组分(a)和(b)冷冻干燥。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的各部分的试剂盒，其中在密封的、无菌的容器中提供每一个组分(a)和(b)。
65.根据权利要求60至64中任一项所述的各部分的试剂盒，其中组分(a)如权利要求6至21中任一项所定义。
66.根据权利要求60至65中任一项所述的各部分的试剂盒，其中组分(b)如权利要求22至36中任一项所定义。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的各部分的试剂盒，其进一步包含用于实施根据权利要求56至59中任一项所述的方法的说明。
68.一种免疫刺激性多肽，其与纳米粒子联合用于药物，其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。
69.根据权利要求68所述的多肽，其中所述免疫刺激性多肽如权利要求6至21中任一项所定义。
70.根据权利要求69所述的多肽，其中所述免疫刺激性多肽是CD40激动剂。
71.根据权利要求70所述的多肽，其中所述CD40激动剂是抗CD40抗体或其抗原结合片段。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的多肽，其中所述纳米粒子包含YPGA或由YPGA组成。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的多肽，其用于治疗癌症。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的多肽，其用于非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(例如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用。
75.—种纳米粒子，其与免疫刺激性多肽联合用于药物，其中所述纳米粒子包含多聚谷氨酸(PGA)或由多聚谷氨酸组成。
76.根据权利要求75所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子如权利要求22至36中任一项所定义。
77.根据权利要求76所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含YPGA或由Y PGA组成。
78.根据权利要求77所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯或由轭合至YPGA的苯丙氨酸乙酯组成。
79.根据权利要求75至78中任一项所述的纳米粒子，其中所述免疫刺激性多肽是CD40激动剂。
80.根据权利要求75至79中任一项所述的纳米粒子，其中所述CD40激动剂是抗CD40抗体或其抗原结合片段。
81.根据权利要求75至80中任一项所述的纳米粒子，其用于治疗癌症。
82.根据权利要求75至81中任一项所述的纳米粒子，其用于非肠道地，例如于肿瘤中或在肿瘤附近局部地(例如肿瘤内地、瘤周内地、瘤周地、结节内地)、静脉内地、肌肉内地、皮下地、鞘内地、颅内地和/或脑室内地施用。
83.—种制备根据权利要求I至39中任一项所述的药物组合物的方法，其包含将免疫刺激性多肽和纳米粒子一起与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合。
84.参考说明书的、实质上如本文所描述的组合物。
85.参考说明书的、实质上如本文所描述的组合物的用途。
86.参考说明书的、实质上如本文所描述的治疗方法。
87.参考说明书的、实质上如本文所描述的各部分的试剂盒。
88.参考说明书的、实质上如本文所描述的免疫刺激性多肽。
89.参考说明书的、实质上如本文所描述的纳米粒子。
90.一种制备药物组合物的方法。
全文摘要
本发明提供药物组合物，其包含在药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中配制的免疫刺激性多肽和多聚谷氨酸(PGA)纳米粒子。这种组合物在刺激受试者的免疫系统方面具有实用性，其组分能够协同地相互作用。本发明进一步提供本发明组合物的用途，例如在治疗癌症中的用途，以及用于所述用途的试剂盒和组分。
文档编号A61K39/395GK102946867SQ201180018652
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者C·A·K·伯莱拜克, S·R·L·布罗斯, P·B·J·埃尔马克, M·M·林德斯泰特 申请人:鳄鱼生物科学公司