专利名称：半胱氨酸改造的抗体和偶联物的制作方法
半胱氨酸改造的抗体和偶联物
对相关申请的引用
本申请是在37CFR§1. 53(b)规定下提交的非临时申请，依照35USC § 119 (e)的规定要求2010年6月8日提交的流水号为61/352，728的美国临时申请的权益，将其引入本文作为参考。发明领域
本发明一般涉及用反应性半胱氨酸残基改造的抗体，且更具体地说，本发明涉及具有治疗或诊断应用的抗体。可以使半胱氨酸改造的抗体与化疗药；毒素；亲和配体，诸如生物素和检测标记，诸如荧光团偶联。本发明还涉及使用抗体和抗体-药物偶联物化合物在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。
发明背景
抗体药物偶联物(ADC)是有吸引力的靶向化疗分子，因为它们组合抗体和细胞毒性药物二者的理想特性，即通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞，由此增强它们的抗肿瘤活性。针对给定靶抗原的成功ADC开发取决于抗体选择、接头稳定性、细胞毒性药物效力和接头-药物偶联抗体的方式的优化。
常规附着方式，即通过共价键连接，药物部分与抗体一般产生不均一的 (heterogeneous)分子混合物,其中药物部分结合在抗体上的许多位点上。例如，细胞毒性药物一般与抗体通过抗体的通常大量的赖氨酸残基偶联，从而产生不均一的抗体-药物偶联物混合物。根据反应条件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗体和O —约8或8以上附着的药物部分的分布。此外，在具有特定整数比的药物部分与抗体的偶联物各亚组内可能是不均一的混合物，其中药物部分结合在抗体上的不同位点上。分析和制备方法不足以分离和表征由偶联反应产生的不均一混合物中的抗体-药物偶联物类分子。抗体为较大的复杂的并且结构多样的生物分子，通常带有许多反应性官能基。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如下因素诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂。此外，多步骤偶联过程因控制反应条件和表征反应剂和中间体方面的困难而可能不可再现。
半胱氨酸硫醇在中性pH具有反应性，这与在接近pH7时质子化和亲核性降低的大部分胺类不同。由于游离硫醇(RSH，硫氢基)具有相对的反应性，所以带有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其作为二硫化物-连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。抗体半胱氨酸硫醇一般对亲电子偶联反应剂比对抗体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。通过使蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇上的设计可能存在问题，特别是就未配对的(游离Cys)残基或那些相对易于进行反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓溶液中，无论是在大肠杆菌(E. coli)的周质中，还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中，蛋白质表面上的未配对的Cys残基可以配对并且氧化成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys 无法与药物、配体或其它标记发生偶联反应。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造的C ys 和已存在的Cys残基之间形成分子内二硫键，那么两种Cys基团对活性位点的参与和相互作用而言均无法利用。此外，可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质失活或赋予其非特异性(Zhang 等(2002) Anal. Biochem. 311:1-9)。
在改造的半胱氨酸可供偶联但不扰乱免疫球蛋白折叠和装配或改变抗原结合和效应器功能的位点处具有半胱氨酸替代的抗体(ThioMab) (Junutula, et al. , 2008b Nature Biotech. , 26 (8):925-932 ；Dornan et al(2009)Bloodl14(13):2721-2729 ; US7521541 ；US7723485 ；W02009/052249)。然后，这些ThioMab可以经由改造的半胱氨酸硫醇基偶联细胞毒性药物以获得具有统一化学计量(约2个药物每个抗体)的ThioMab药物偶联物(TDC)。针对不同抗原的多种抗体的研究显示了 TDC在异种移植物模型中像常规 ADC —样有效，而且在有关临床前模型中在更高的剂量得到耐受。ThioMab药物偶联物改造成在抗体的不同部分(轻链-Fab、重链-Fab和重链-Fe)附着药物。由于它们的同质性和位点特异性偶联细胞毒性药物，TDC的体外和体内稳定性、功效和PK特性提供胜过常规ADC 的独特优势。
概述
本发明包括分离的半胱氨酸改造的抗体，其在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸。
本发明的一个方面是制备分离的半胱氨酸改造的抗体的方法，即通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列，以便编码半胱氨酸改造的抗体；表达半胱氨酸改造的抗体；并分离半胱氨酸改造的抗体。
本发明的另一个方面是分离的半胱氨酸改造的抗体的偶联物，其中抗体共价附着于捕捉标记、检测标记、药物部分、或固相支持物。
附图简述
附
图1A表示通过X射线晶体坐标衍生的hu4D5Fabv7抗体片段的三维代表图。对重链和轻链的例示性改造的Cys残基的结构位置进行了编号(按照序列编号系统)。
附图1B表示4D5v7fabH的与Kabat编号方案(下排)对比在N-末端开始的序列编号方案(上排)。Kabat编号插入由a、b、c标注。
附图2A和2B表示通过与BSA (空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)或链霉抗生物素 (实心条柱)相互作用的PHESELECT0R测定法，使 用在450nm处吸光度检测的hu4D5Fabv8 和hu4D5Fabv8Cys突变体(ThioFab)噬菌体变体的结合测定值(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8 和(B)生物素化噬菌体 _hu4D5Fabv8 (B)。
附图3A和3B表示通过与BSA(空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)和链霉抗生物素(实心条柱)相互作用的PHESELECT0R测定法，使用在450nm处吸光度检测的 hu4D5Fabv8 (左)和hu4D5Fabv8Cys突变体(ThioFab)的结合测定值(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8和(B)生物素化噬菌体_hu4D5Fabv8。轻链变体位于左侧，而重链变体位于右侧。硫醇反应性=链霉抗生物素结合的0D45Qnm+HER2 (抗体)结合的0D45Qnm。
附图4A表示野生型hu4D5Fabv8上残基的表面可接近分数值(Fractional Surface Accessibility Value)。轻链位点位于左侧,而重链位点位于右侧。
附图4B表示通过在450nm处检测吸光度测定的与HER2 (第2天)、链霉抗生物素 (SA)(第2天)、HER2 (第4天)和SA (第4天)的相互作用的生物素化的hu4D5Fabv8和 hu4D5Fabv8Cys变体(ThioFab)的结合测定值。分离卩遼菌体-hu4D5Fabv8Cys变体并且储存在4° C。在第2天或第4天时进行生物素偶联，随后进行PHESELECT0R分析以便如实施例2中所述监测其与Her2和链霉抗生物素的相互作用并且探测改造的ThioFab变体上反应性硫醇的稳定性。
附图5表示通过在450nm处检测吸光度测定的生物素-马来酰亚胺偶联的-hu4D5Fabv8(A121C)和未生物素化的野生型hu4D5Fabv8在结合链霉抗生物素和HER2 中的结合测定值。在2ng和20ng测试每种Fab。
附图6表示通过在450nm处检测生物素化的ABP_hu4D5Fabv8野生型(wt)和 ABP-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体VllOC和A121C在结合兔清蛋白、链霉抗生物素(SA)和 HER2中的吸光度的ELISA分析。
附图7表示通过在450nm处检测吸光度对生物素化的ABP_hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体(ThioFab变体):(左至右)单Cys变体ABP-VlIOC, ABP-Al2IC和双Cys变体 ABP-Vl 10C-A88C和ABP-VlIOC-Al2IC的在结合兔清蛋白、HER2和链霉抗生物素(SA)并且使用Fab-HRP或SA-HRP探测的ELISA分析。
附图8表示生物素化的ThioFab噬菌体和抗-噬菌体HRP抗体与HER2 (上)和链霉抗生物素(下)的结合。
附图9A表示结合固定的HER2的生物素化抗体在结合用于吸光度检测的HRP标记的二抗(second antibody)的卡通画描绘。
附图9B表示在450nm处检测吸光度测定的生物素-马来酰亚胺偶联的硫代_曲妥单抗变体(thio-trastuzumab variant)和未-生物素化的野生型曲妥单抗结合固定的 HER2 的结合测定。从左至右V110C(单 cys)，A121C(单 cys)，V110C/A121C(双 cys)和曲妥单抗。以1、10和IOOng测试了各thio IgG变体和曲妥单抗。
附图1OA表示结合固定的HER2的生物素化抗体和用于吸光度检测的生物素与抗-1gG-HRP结合的卡通图描绘。
附图1OB表示在450nm下检测吸光度的生物素-马来酰亚胺偶联的-硫代曲妥单抗变体和未-生物素化的野生型曲妥单抗在结合固定的链霉抗生物素中的结合测定值。从左至右V110C(单 cys)，A121C(单 cys)，V110C/A121C(双 cys)和曲妥单抗。以 1、10 和 IOOng测试了各thio IgG变体和曲妥单抗。
附图11表示制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造的抗体 (ThioMab)的一般方法。
典型实施方案的详细描述
详细内容参照本发明的某些实施方案，其实施例在附带的结构和通式中例示。尽管结合列举的实施方案描述了本发明，但是应理解它们并非指定用于将本发明限定到那些实施方案。相反，本发明覆盖所有的备选、变型和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。
本领域技术人员知道可以用于实施本发明的与本文所述的那些相似或等同的许多方法和物质。本发明决不限于所述的方法和物质。
除非另做陈述，否则，本 文所用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同的含义并且与如下文献中所述一致=Singleton等(1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed. , J. Wiley&Sons, NewYork, NY ；和 Janeway, C. , Travers, P. , Walport, M. , Shlomchik(2001)Immonobiology, 5th Ed. , Garland Publishing, New York。
定义
除非另做陈述，否则，本文所用的下列术语和措词具有如下含义
当本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括产品的商品名产品制剂、仿制药和商品名产品的活性药物组分。
本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller 等(2003) Jour, of Immunologyl70:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(Janeway, C. , Travers, P. , ffalport, Μ. , Shlomchik(2001) Tmmuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York).革巴抗原一般具有由多种抗体的⑶Rs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
〃抗体片段〃包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab，)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody) (Olafsen 等(2004) Protein Eng. Design&Sel. 17 (4) :315-323) ;Fab 表达文库制备的片段；抗-独特型(抗-1d)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单-链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除可能少量存在的天然发生的可能突变之外，包含在该群体中的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的靶向单个抗原位点的抗体。而且，与典型地包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体只靶向抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以以不被其它抗体污染的方式合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群的抗体特性，并非解释为需要由任何特定方法生产抗体。例如，可以通过首先由Kohler等(1975)Nature256:495描述的杂交瘤方法制备用于本发明的单克隆抗体或可以通过重组DNA方法制备(例如，参见US4816567 ;US5807715)。例如，还可以使用 Clackson 等(1991) Nature, 352:624-628 ；Marks 等(1991) J. Mol. Biol.，222:581-597 所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
本文的单克隆抗体特 别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源， 本文还包括嵌合抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(US4816567 JPMorrison等(1984)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 81:6851-6855)。本文关注的嵌合抗体包括“灵长化 (primatized) ”抗体,其包含来源于非人的灵长类(例如Old World Monkey、Ape等)的可变区抗原-结合序列和人恒定区序列。
本文的“完整抗体”为包含VL和VH结构域以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域 CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，意旨归因于抗体的Fe恒定区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒作用 (ADCC);胞吞作用；和细胞表面受体，诸如B细胞受体和BCR的减量调节。
根据其重链恒定域的氨基酸序列的不同，可以将完整抗体指定为不同“类别”。存在5种主要类别的完整免疫球蛋白抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且可以将其中的几种进一步分成“亚类”(亚型)，例如IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl,和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型为众所周知的。Ig型包括铰链-修饰型或无铰链型(Roux 等(1998)J.1mmunol. 161:4083-4090 ;Lund 等(2000)Eur.J. Biochem. 267:7246-7256 ； US2005/0048572 ；US2004/0229310)。
“ErbB受体”为属于受体ErbB受体家族的蛋白酪氨酸激酶，其成员为细胞生长、分化和存活的重要介导物。ErbB受体家族包括4种不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbBU HER1)、HER2 (ErbB2 或 pl85neu)、HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4 或 tyro2)。已经使用人乳腺肿瘤细胞系SKBR3表征了一组抗_ErbB2抗体(Hudziak等 (1989)Mol. Cell. Biol. 9(3) : 1165-1172。使用称作4D5的抑制细胞增殖达56%的抗体获得最大抑制作用。在本试验的一组抗体中的其它抗体降低细胞增殖的程度较弱。进一步发现抗体4D5可以使过表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性效应敏感 (US5677171)。Hudziak等讨论的抗_ErbB2抗体进一步在下列文献中得到表征Fendly 等(1990)Cancer Research50:1550-1558 ;Kotts 等(1990)In Vitro26(3) :59A ;Sarup 等 (1991)Growth Regulationl:72-82 ；Shepard 等 J. (1991)Clin. Tmmunol. 11(3):117-127 ； Kumar 等(1991)Mol. Cell. Biol. 11 (2) :979-986 ;Lewis 等(1993) Cancer Tmmunol.免疫 ther. 37:255-263 ；Pietras 等(1994)0ncogene9:1829-1838 ;Vitetta 等(1994)Cancer Research54:5301-5309 ；Sliwkowski 等(1994)J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 ； Scott 等(1991) J. Biol. Chem. 266 : 14300-5 ;D，souza 等 Proc. Natl. Acad. Sc1. (I994)9L72O2-72O6 ;Lewis 等(I996)Cancer Research56:1457-1465 ；和 Schaefer 等 (1997) Oncogene15:1385-1394。
ErbB受体通常包含胞外结 构域,其可以结合ErbB配体；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和包含几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号传导结构域。ErbB受体可以为“天然序列”ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。优选ErbB受体为天然序列人ErbB受体。因此，“ErbB受体家族的成员”包括EGFR(ErbBl)、ErbB2、ErbB3、 ErbB40
术语“氨基酸序列变体”意旨在一定程度上具有不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。氨基酸序列变体一般与天然ErbB配体的至少一种受体结合结构域或与天然ErbB受体的至少一种配体结合结构域具有至少约70%的序列同一性，并且优选它们至少约 80%，更优选至少约90%的序列与这类受体或配体结合结构域同源。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置上具有替代、缺失和/或插入。按照常规的名称，即一字母密码和三字母密码命名氨基酸。
将“序列同一性”定义为对序列进行序列对比排列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后氨基酸序列变体中相同的残基的百分率。用于进行序列对比的方法和计算机程序为本领域众所周知的。一种这类计算机程序为Genentech，Inc. 创建的 “Align2”，其中归档为 1991 年 12 月 10 日在 United States Copyright Office, Washington, DC20559 的用户文件。
“天然抗体”通常为由两种相同的轻(L)链和两种相同的重⑶链组成的约 150，000道尔顿的异四聚化糖蛋白。每一轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型中可变。每一重链和轻链还具有有规则间隔的链间二硫键。 每一重链在一端上带有可变域(Vh)，随后是大量恒定域。每一轻链在一端上带有可变(')， 而在另一端上带有恒定域。将轻链的恒定域与重链的第一恒定域进行序列对比并且将轻链的可变域与重链的可变域进行序列对比。认为特定的氨基酸残基在轻链域重链可变域之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β_折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见 Kabat 等人，1991,《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重链可变区中的残基 31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)； Kabat等人，见上文)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基 26-32 (LI)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及重链可变区中的残基 26-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia andLesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。“框架区”或“FR”残基指可变区中除了本文中所定义的高变区残基以外的那些残基。
用木瓜蛋白酶消 化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F (ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(ChI)。Fab’片段因在重链ChI 结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的 Fab’的称谓。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在Vh和\结构域之间还包含多肽接头，使得scFv 能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述参见Pliickthun,《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol. 113, Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315，1994。抗 ErbB2 抗体 scFv 片段描述于 W093/16185 ;美国专利 5，571，894 ;和 5，587，458。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。人源化是将鼠抗原结合信息转移至非免疫原性人抗体受体的方法， 并且已经产生了许多治疗上有用的药物。人源化方法一般通过将所有6个鼠互补决定区 (CDR)转移至人抗体框架开始(Jones等，(1986) Nature321:522-525)。这些CDR移植的抗体一般不会保持其对抗原结合的最初亲和力，并且事实上，亲和力通常严重受损。除CDR 外，还必须引入选定的非人抗体框架残基以便维持正确的⑶R构象(Chothia等(1989) Nature342:877)。已经证实，将关键的小鼠框架残基转移至人受体以便支持所移植⑶R的结构构象恢复抗原结合和亲和力(Riechmann等(1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499 ；Foote 和 Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499 ;Presta等(1993)J.1mmunol. 151, 2623-2632 ； Werther 等(1996)J.1mmunol. Methodsl57:4986-4995 ；和 Presta 等(2001)Thromb. Haemost. 85:379-389)。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见 US6, 407，213;Jones et al. (1986) Nature321:522-525;Riechmann et al. (1988) Nature332:323-329;Presta (1992)Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596。
“游离半胱氨酸氨基酸”指已经改造到亲本抗体中，带有硫醇官能基(-SH)，并且未作为分子内或分子间二硫键配对的半胱氨酸氨基酸残基。
术语“硫醇反应性值”为游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值为半胱氨酸改造的抗体中与硫醇反应性试剂起反应的游离半胱氨酸氨基酸 的百分比，并且换算成最大值I。例如，半胱氨酸改造的抗体上以100%产率与硫醇反应性试剂诸如生物素-马来酰亚胺试剂起反应而形成生物素标记的抗体的游离半胱氨酸氨基酸具有1. O的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以80%产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约O. 8的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的完全无法与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有O的硫醇反应性值。可以通过 ELISA测定法、质谱法、液相层析法、放射自显影法或其它定量分析试验测定特定半胱氨酸的硫醇反应性值。
"亲本抗体"为所含氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基将用一个或多个半胱氨酸残基替代的抗体。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。亲本抗体可以具有相对于其它天然、野生型或修饰形式的抗体而言预先存在的氨基酸序列修饰(诸如添加、缺失和/或替代)。亲本抗体可以针对所关注的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还关注针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US5，091，178)的抗体。
例示性亲本抗体包括对细胞表面和跨膜受体和肿瘤相关抗原(TAA)具有亲和力和选择性的抗体。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(I)根据 Lowry方法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“结合”分子靶标或所关注抗原例如ErbB2抗原的抗体为能够以足够亲和力结合抗原，使得该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。如果抗体为结合ErbB2的抗体，那么它通常优先结合ErbB2胜过其它ErbB受体，并且可以为不会与其它蛋白质，诸如EGFR、 ErbB3或ErbB4发生显著交叉反应的抗体。在这类实施方案中，抗体与这些非ErbB2蛋白质结合(例如对内源受体的细胞表面结合)的程度将低于10%，正如通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射性免疫沉淀(RIA)测定的。有时，抗ErbB2抗体不会与大鼠neu 蛋白发生显著的交叉反应，例如如Schecter等(1984)Nature312:513和Drebin等(1984) Nature312:545-548 中所述。
本发明所涵盖的抗体的分子靶标包括⑶蛋白及其配体，诸如，但不限于(i)⑶3、 CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79a (CD79a)和 CD79 β (CD79b) ;(ii)ErbB 受体家族的成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞粘附分子，诸如LFA_l、Macl、 pl50，95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和α ν/β 3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CDlla、 抗CD18或抗CDllb抗体)；(iv)生长因子，诸如VEGF;Ig E;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4 ;蛋白C、BR3、c-met、组织因子、β 7等；和(ν)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)。
除非另做陈述，术语“单克隆抗体4D5 ”指具有或衍生自鼠4D5抗体(ATCC CRL10463)的抗原结合残基的抗体。例如，单克隆抗体4D5可以为鼠单克隆抗体4D5或其变体，诸如人源化4D5。例示性人源化4D5抗体包括如US5，821，337中所述的huMAb4D5_l、 huMAb4D5-2、huMAb4D5_3、huMAb4D5_4、huMAb4D5_5、huMAb4D5_6、huMAb4D5_7 和 huMAb4D5-8 (曲妥单抗(trastuzumab)，HERCEPTIN )。
术语“治疗”和“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)不想要的生理学变化或紊乱，诸如癌症的形成或传播。为了本发明，有利或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、削弱疾病的程度、疾病状态稳定(即不恶化)、 延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括早就患有状况或紊乱的受试者以及倾向于患上状况或紊乱的受试者或者要预防状况或紊乱的受试者。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或紊乱的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。 在药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、 肉瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤 (h印atoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴莖癌、以及头和颈癌。
“表达ErbB的癌”指包含在其细胞表面上存在ErbB蛋白质的细胞的癌。“表达 ErbB2的癌”指在其细胞表面上生成足够水平的ErbB2，使得抗ErbB2抗体可与其结合并对癌产生治疗效果的癌。
“过表达”抗原性受体的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的受体诸如ErbB2的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)来确定受体过表达。或者/另外，可测量细胞中受体编码核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH ;参见W098/45479)、Southern印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、 I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、 C60和Lu的放射性同位素；化疗剂；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其合成类似物和衍生物。
“噬菌体展示”是将变异多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体例如丝状噬菌体颗粒的表面上的技术。噬菌体展示的一种效用在于可对随机化蛋白质变体的大型文库快速且有效的分选那些以高亲和力结合靶分子的序列的事实。在噬菌体上展示肽和蛋白质文库已经用于对数以百万计的多肽筛选具有特定结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经用于展示肽和小蛋白质的小型文库，通常通过与丝状噬菌体的PlII或PVIII融合 (Wells and Lowman, (1992)Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362及其引用的参考文献)。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与噬菌体外壳蛋白或其部分融合，且在存在野生型蛋白质时以低水平表达。亲合力效果与多价噬菌体相比降低，使得分选基于内在配体亲和力，并使用简化DNA操作的卩遼菌粒载体。Lowman and Wells, (1991)Methods:A companion to Methods in Enzymology3:205-0216。卩遼菌体展示包括用于生成抗体样分子的技术(J aneway, C. , Travers, P. , ffalport, Μ. , Shlomchik, (2001) Immunobiology, 5th Ed. , Garland Publishing, New York, p627-628;Lee et al.)。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点例如ColEl和一个拷贝的噬菌体基因区间的噬菌体载体。噬菌粒可用于任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ形噬菌体。质粒通常还将包含抗生素抗性的选择标志。克隆到这些载体中的DNA区段可以像质粒一样增殖。当包含这些载体的细胞中配有生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制方式改变成滚环复制以生成质粒DNA的一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括包含噬菌体外壳蛋白基因或其片段且其与异源多肽基因连接成基因融合物，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒表面上的噬菌粒。
“接头”、“接头单元”或“连接物”指包含使抗体与药物模块共价连接的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，将接头指定为L。接头包括二价基，诸如亚烃基 (alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基，诸如-(CR2)n0(CR2)n-、烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine )等模块；及二酸酯和酰胺类，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
术语“标记”指可以共价附着于抗体并发挥如下功能的任何模块(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以改变由第一或第二标记提供的可检测信号，例如FRET (荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提供与之结合的亲和力；(iv) 通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性；或(V) 提供捕捉模块，以调节配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。
本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S. P. Parker, Ed.，McGrawHi 11 Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hi11 Book Company, New York;Eliel, E. and ffilen, S. , Stereochemistry of Organic Compunds(1994)John ffiley&Sons, Inc. , New York。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和I 或(+)和(_)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(_)或I指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可称作对映体，此类异构体的混合物通常 称作对映混合物。对映体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或方法中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映体等摩尔混合从而丧失旋光性的混合物。
短语“药学可接受盐”在用于本文时指ADC的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、 硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1，Γ-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。
“药学可接受溶剂化物”指一个或多个溶剂分子和ADC的结合。形成药学可接受溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
半胱氨酸改造的抗体
本发明的化合物包括半胱氨酸改造的抗体，其中野生型或亲代抗体中的一种或多种氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。由此可以改造任意形式的抗体，即使其突变。例如，可以将亲代Fab抗体片段改造成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称作“ThioFab”。类似地，可以将亲代单克隆抗体改造成“ThioMab”。应注意单一位点突变在ThioFab中产生单一改造的半胱氨酸残基(single engineered cysteine residue),而单一位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，这是因IgG抗体的二聚化特性所致。评价被半胱氨酸(Cys)残基替代的(“改造的”)突变体的新引入的改造的半胱氨酸硫醇反应性。硫醇反应值为O —1.O范围内的相对数值范围并且可以测定任意半胱氨酸改造的抗体的该值。本发明半胱氨酸改造的抗体的硫醇反应值在O. 6 —1. O ;0. 7 —1. O ;或O. 8 —1. O的范围。
本发明的设计、选择和制备方法能够使半胱氨酸改造的抗体能够与亲电子官能基(functionability)反应。这些方法进一步能够使抗体偶联物化合物，诸如抗体-药物偶联物(ADC)化合物与药物分子在指定、设计、选择的位点上反应。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基能够通过硫醇反应基，诸如马来酰亚胺或齒代乙酰基特异性地偶联药物部分。Cys残基的硫醇官能基与马来酰亚胺基的亲核反应性约高于蛋白质中任意其它氨基酸官能基，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙酰试剂和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能基可以与胺基反应，但需要更高的pH(>9. O)和更长的反应时间(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach, Academic Press, London)。
本发明半胱氨酸改造的抗体优选保持其野生型亲代抗体对应物的抗原结合能力。 因此，半胱氨酸改造的抗体能够结合，优选特异性结合抗原。这类抗原包括例如肿 瘤-相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如，已知或怀疑在功能上相关) 的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如，已知或怀疑在功能上相关)的分子。肿瘤-相关抗原可以为分化簇因子(即 CD蛋白)。能够结合半胱氨酸改造的抗体的抗原可以为上述类型之一的亚组中的成员，其中所述类型中另一亚组包含具有不同特性的其它分子/抗原(就所关注的抗原而言)。
亲代抗体还可以为选自如上所述的US5821337的表3中所述的huMAb4D5_l、 huMAb4D5-2、huMAb4D5_3、huMAb4D5_4、huMAb4D5_5、huMAb4D5_6、huMAb4D5_7 和 huMAb4D5-8(曲妥单抗，HERCEPTIN )的人源化抗体，特别将该文献引入本文作为参考；人源化520C9(W093/21319)和如本文所述的人源化2C4抗体。
本发明的半胱氨酸改造的抗体可以位点-特异性和有效地与硫醇-反应试剂偶联。硫醇-反应试剂可以为多官能接头试剂(multifunctional linker reagent);捕捉物，即亲和、标记试剂(例如生物素-接头试剂)；检测试剂(例如荧光团试剂)；固相固定 化试剂(例如SEPHAR0SE 、聚苯乙烯或玻璃)或药物-接头中间体(drug-1 inker intermediate)。硫醇-反应试剂的一个实例为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个典型的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂反应得到生物素化的ThioFab，通过这种方式可以检测和测定改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多官能接头试剂反应得到带有可以与药物部分试剂或其它标记进一步反应的官能化接头的ThioFab。ThioFab与药物-接头中间体反应得到ThioFab药物偶联物。
本文所述的典型方法一般可以应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过使用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。
这类手段可以应用于偶联其它硫醇反应试剂，其中反应基为例如马来酰亚胺、 碘乙酰胺、卩比唳基二硫化物或其它硫醇反应偶联配偶体(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes,Inc. ；Brinkley, 1992，Bioconjugate Chem. 3:2 ；Garman, 1997，Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press, London ；Means (1990)Bioconjugate Chem. 1:2 ;Hermanson，G.1n Bioconjugate Techniques(1996) Academic Press, San Diego，pp. 40-55，643-671)。所述的配偶体可以为细胞毒性剂(例如毒素，诸如多柔比星(doxorubicin)或百日咳毒素)；荧光团，诸如荧光染料类荧光素或若丹明；用于成像的螯合剂或放射性治疗金属；肽基或非-肽基标记或检测标记；或清除-改进剂 (clearance-modifying agent),诸如聚乙二醇的不同异构体；结合第三种成分的肽或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。
在本文典型抗体片段hu4D5Fabv8上鉴定的位点主要位于抗体的恒定域中，其在所有抗体种类之间为充分保守的。这些位点可广泛适用于其它抗体，而无需进一步进行结构设计或有关特异性抗体结构的知识，并且不会干扰对抗体可变域而言固有的抗原结合特性。
可以用于治疗癌症的半胱氨酸改造的抗体包括，但不限于针对细胞表面受体和肿瘤-相关抗原(TAA)的抗体。这类抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记部分偶联)或用作式I抗体-药物偶联物(ADC)。肿瘤-相关抗原为本领域中公知的并且可以制备它们以便用于使用本领域众所周知的方法和信息生产抗体。在发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的跨膜多肽，或肿瘤相关多肽。与非癌细胞相比，通常这类肿瘤-相关多肽更大量地在癌细胞表面上表达。对这类肿瘤-相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经使人们能够特异性靶向癌细胞，通过基于抗体的疗法对其进行破坏。
TAA的实例包括，但不限于下述TAA(1)_(36)。为方便起见，均为本领域公知的有关这些抗原的信息如下所列，并且按照National Center for Biotechnology Information (NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定规定,包括名称,可选择的名称，Genbank登记号和主要参考文献。相当于ΤΑΑ(1)-(36)的核酸和蛋白质序列可以在公共数据库，诸如 GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤-相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同种型，它们与引述的参考文献中鉴定的序列相比具有至少约70%，80%，85%，90%或95%序列同一性，或表现出基本上与具有引述参考文献中发现的序列的TAA相同的生物特性或特征。例如，具有变体序列的TAA —般能够特异性结合文献中所示相应序列TAA特异性结合的抗体。特别将本文特别引述的参考文献中的序列和披露内容引入作为参考。
肿瘤相关抗原(1)-(36):
(I) BMPRlB (骨形态发生蛋白受体-1B 型(bone morphogenetic receptor-type IB),Genbank 登记号 NM_001203)ten Dijke1P.,等 Science264 (5155):101-104 (1994) ，0ncogenel4(11):1377-1382(1997)) ；W02004063362(权利要求 2) ；W02003042661(权利要求 12) ；US2003134790-A1 (38-39 页)；W02002102235 (权利要求 13 ;页 296)； W02003055443 (91-92 页)；W0200299122 (实施例 2 ;528_530 页)；W02003029421 (权利要求 6) ;W02003024392(权利要求 2 ;附图 112) ;W0200298358 (权利要求1 ;183 页)； W0200254940(100-101 页)；W0200259377(349-350 页)；W0200230268 (权利要求 27 ; 376页)；W0200148204(实施例；附图4) ；NP_001194骨形态发生蛋白受体，IB型/ pid=NP_001194.1.交叉参考:MM: 603248 ；NP_001194.1 ；AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank 登记号 NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun 255(2)，283-288(1999)，Nature395(6699):288-291(1998)，Gaugitsch, H. ff.,等(1992) J. Biol. Chem. 267(16):11267-11273) ；W02004048938(实施例 2) ；W02004032842(实施例 IV) ;W02003042661(权利要求 12) ;W02003016475 (权利要求1) ;W0200278524 (实施例 2) ；W0200299074(权利要求 19 ;页 127-129) ；W0200286443 (权利要求 27 ;222，393 页);W02003003906(权利要求 10 ；293 页);W0200264798 (权利要求 33 ;页 93_%)； W0200014228(权利要求 5 ; 133-136 页);US2003224454 (附图 3) ;TO2003025138 (权利要求 12;150页);NP_003477溶质载体家族7 (solutecarrier family7)(阳离子氨基酸转运蛋白(cationic amino acid transporter)，y+系统)，成员 5/pid=NP_003477. 3 -人类；交叉参考M頂600182 ；NP_003477. 3 ；NM_015923 ；NM_003486_1
(3)STEAP1 (前列腺的六跨膜上皮细胞抗原(six transmembrane epithelial antigen of prostate), Genbank 登记号 NM_0 12449) ；Cancer Res. 61(15)，5857-5860(2001), Hubert, R. S.,等(1999)Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 96(25) : 14523-14528)； W02004065577(权利要求 6) ；W02004027049 (附图 1L) ；EP1394274(实施例 11); W02004016225(权利要求 2) ;TO2003042661 (权利要求 12) ;US2003157089 (实施例 5)； US2003185830(实施例 5) ；US2003064397 (附图 2) ;TO200289747 (实施例 5 ;页 618-619)； W02003022995(实施例9 ;附图13A,实施例53 ; 173页，实施例2 ;附图2A) ；NP_036581前列腺的六跨膜上皮抗原；交叉参考MM:604415 ；NP_036581.1 ；NM_012449_1
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(5)MPF(MPF, MSLN, SMR,巨核细胞强化因子(megakaryocyte potentiating factor), mesothelin, Genbank 登记号 NM_005823)Yamaguchi, N., 等 Biol. Chem. 269 (2)，805-808 (1994)，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 96 (20) :11 531-11536 (1999)，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 93 (I) : 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270(37) :21984-21990(1995)) ;W02003101283 (权利要求 14) ； (W02002102235 (权利要求 13 ；287-288 页)；W02002101075 (权利要求 4 ;页 308-309) ；W0200271928 (320-321 页)；W09410312 (52-57 页);交叉参考:MIM:601051 ；NP_005814. 2 ；NM_005823_1
(6)Napi3b(NAP1-3B, NPTIIb, SLC34A2,溶质载体家族(solute carrier family) 34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b, Genbank登记号NM_006424) J.Biol.Chem. 277(22):19665-19672(2002)，Genomics62(2):281-284(1999)，Feild, J. A.,等(1999)Biochem. Biophys. Res. Commun. 258(3):578-582) ;W02004022778(权利要求 2) ;EP1394274(实施例 11) ;W02002102235 (权利要求 13 ;326 页)；EP875569 ( U 利要求 I ; 17-19 页);W0200157188(权利要求 20 ；329 页);W02004032842 (实施例1V) ；W0200175177(权利要求 24 ； 139-140 页)；交叉参考:MIM:604217 ；NP_006415.1 ； NM_006424_1
(7)Sema5b(FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG,脑信号蛋白 (Semaphorin) 5b Hlog, sema 结构域，七血小板反应蛋白重复(seven thrombospondin repeats) (I型(typel)和类I型(typel-like))，跨膜结构域(TM)和短胞质域，(脑信号蛋白)5B, Genbank 登记号 AB040878) ；Nagase T.，等(2000)DNA Res. 7 (2) : 143-150)； W02004000997 (权利要求1) ；W02003003984 (权利要求1) ；W0200206339 (权利要求1 ; 50 页)；W0200188133(权利要求1 ;页 41-43，48-58) ；W02003054152 (权利要求 20); W02003101400(权利要求 11);登记号:Q9P283 ；EMBL ；AB040878 ；BAA95969.1. Genew ； HGNC:10737
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA2700050C12,RIKEN cDNA2700050C12 基因，Genbank 登记号 AY358628) ；Ross 等(2002)Cancer Res. 62:2546-2553 ；US2003129192 (权利要求 2) ；US2004044180 (权利要求 12); US2004044179(权利要求 11) ；US2003096961 (权利要求 11) ；US2003232056 (实施例 5) ;W02003105758(权利要求 12) ;US2003206918 (实施例 5) ;EP1347046 (权利要求1)； W02003025148(权利要求 20);交叉参考:G1:37182378 ；AAQ88991.1 ；AY358628_1
(9)ETBR(内皮缩血管妝 B 型受体(Endothelin type B receptor), Genbank 登记号 AY275463) ；Nakamuta Μ.,等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39，1991 ； Ogawa Y.,等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255 ，1991 ；Arai H.,等 Jpn. Circ. J. 56，1303-1307，1992 ；Arai H.,等 J. Biol. Chem. 268，3463-3470，1993 ； Sakamoto A. , Yanagisawa M.,等 Biochem.Biophys. Res. Commun. 178,656-663, 1991 ； Elshourbagy N.A.,等 J.Biol.Chem.268，3873-3879，1993 ;Haendler B.,等 J.Cardiovasc.Pharmacol. 20, sl_S4, 1992 ；Tsutsumi M.,等 Gene228, 43-49，1999 ； Strausberg R. L.,等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 99，16899-16903，2002 ;BourgeoisC.,等 J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997 ；0kamoto Y.,等 Biol. Chem. 272，21589-21596，1997 ；Verheij J. B.，等 Am. J. Med. Genet. 108，223-225，2002 ； Hofstra R. M. ff.,等 Eur. J. Hum. Genet. 5，180-185，1997 ;Puffenberger E. G.,等 Cell79, 1257-1266, 1994 ；Attie T. , et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409，1995 ；Auricchio A.,等 Hum. Mol. Genet. 5:351-354，1996 ;Amiel J.,等 Hum. Mol. Genet. 5，355-357，1996 ; Hofstra R. M. ff.,等 Nat. Genet. 12，445-447，1996 ;Svensson P. J.,等 Hum. Genet. 103，145-148，1998 ;Fuchs S.,等 Mol. Med. 7，115-124，2001 ;Pingault V.,等 (2002)Hum. Genet. 111，198-206 ;W02004045516(权利要求1) ;W02004048938(实施例 2) ;W02004040000 (权利要求 151) ;W02003087768 (权利要求1) ;W02003016475 (权利要求 I) ；W02003016475(权利要求1) ；W0200261087 (附图1) ；W02003016494 (附图 6) ;W02003025138(权利要求 12 ;144 页)；W0200198351 (权利要求1 ;页 124-125)； EP522868(权利要求 8 ;附图 2) ;W0200177172 (权利要求1 ;页 297-299) ；US2003109676 ； US6518404(附图 3) ;US5773223 (权利要求 la ;Col31_34) ；W02004001004
(10)MSG783 (RNF124,推定蛋白(hypothetical protein) FLJ20315, Genbank 登记号 NM_017763) ;W02003104275 (权利要求1) ;TO2004046342 (实施例 2) ;TO2003042661 (权利要求 12) ；W02003083074(权利要求 14 ;页 61) ；W02003018621 (权利要求1); W02003024392(权利要求 2 ;附图 93) ;W0200166689 (实施例 6);交叉参考LocusID:54894 ； NP_060233. 2 ；NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮细胞抗原2，六跨膜前列腺蛋白,Genbank 登记号 AF455138) ；Lab.1nvest. 82 (11) : 1573-1582 (2002)) ；W02003087306 ； US2003064397(权利要求1 ;附图1) ；W0200272596 (权利要求 13 ;页 54-55)； W0200172962(权利要求1 ;附图 4B) ;W02003104270 (权利要求 11) ;W02003104270 (权利要求 16) ;US2004005598(权利要求 22) ;W02003042661 (权利要求 12) ;US2003060612 (权利要求12;附图10) ;W0200226822(权利要求23 ;附图2) ;W0200216429 (权利要求12 ;附图10);交叉参考:G1:22655488 ；AAN04080.1 ；AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B,瞬时型受体电位阳离子通道 (transient receptor potential cation channel),亚方矣 M,成员 4，Genbank 登记号 NM_017636) ；Xu, X. Z.,等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 98 (19) : 10692-10697 (2001)，Cell 109 (3):397-407 (2002)，J. Biol. Chem. 278(33):30813-30820(2003)) ；US2003143557(权利要求 4) ;W0200040614(权利要求 14 ;页 100-103) ;W0200210382 (权利要求1 ;附图 9A)； W02003042661(权利要求 12) ;TO200230268 (权利要求 27 ；391 页);US2003219806 (权利要求 4) ;W0200162794(权利要求 14 ;附图 1A-D);交叉参考:MIM:606936 ；NP_060106. 2 ； NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CRl, CRGF, CRIPTO, TDGF1,畸胎瘤-衍生的生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor),Genbank 登记号 NP_003203 或丽_003212) ；Ciccodicola, A.,等 EMBO J. 8 (7) : 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49(3) :555-565(1991)) ;US2003224411 (权利要求1) ;W02003083041 (实施例1)； W02003034984(权利要求 12) ;W0200288170 (权利要求 2 ;页 52-53) ;W02003024392 (权利要求 2 ;附图 58) ;W0200216413(权利要求1 ;页 94-95，105) ;W0200222808 (权利要求 2 ； 附图1) ;US5854399(实施例 2 ;Coll7-18) ;US5792616 (附图 2);交叉参考:MIM: 187395 ； NP_003203.1 ；NM_003212_1
(14)CD21(CR2(补体受体 2)或 C3DR(C3d/EB 病毒受体(Epstein Barr virus receptor))或 Hs. 73792Genbank 登记号 M26004) ；Fujisaku 等(1989) J. Biol. Chem. 264(4) :2118-2125) ；ffeis J. J.,等 J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988 ； Moore M.,等 Proc. Nat I · Acad. Sc i · U. S. A. 84，9 194-9 198，1987 ;Bare I M., 等 Mo I · Immuno1. 35，1025-1031，1998 ;Weis J. J.,等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 83, 5639-5643, 1986 ；Sinha S. K.,等(1993) J.1mmunol. 150，531卜5320 ; W02004045520(实施例 4) ；US2004005538 (实施例1) ；W02003062401 (权利要求 9); W02004045520(实施例 4) ;W09102536 (附图 9. 1-9.9) ;W02004020595 (权利要求1);登记号:P20023 ；Q13866 ；Q14212 ；EMBL ；M26004 ；AAA35786.1
(15)CD79b(CD79B，CD79P，IGb (免疫球蛋白-相关 β (immunoglobulin-associated beta), B29, Genbank 登记号 NM_000626 或 11038674)； Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. (2003) 100(7) :4126-4131, Blood(2002) 100(9) :3068-3 O76，Muller 等(I992)Eur. J.1mmunol. 22 (6) :1621-1625);冊2004016225(权利要求 2，附图 140) ；W02003087768, US2004101874 (权利要求 1，页 102) ；W02003062401 (权利要求 9) ；W0200278524(实施例 2) ;US2002150573 (权利要求 5，页 15) ；US5644033 ； W02003048202(权利要求1, 306 和 309 页)；W099/558658, US6534482 (权利要求 13，附图 17A/B) ;W0200055351(权利要求 11，1145-1146 页)；交叉参考:MIM: 147245 ；NP_000617.1 ； NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAPlA (含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白 la(SH2domain containing phosphatase anchor proteinla), SPAP1B, SPAP1C, Genbank 登记号 NM_030764, AY358130) ；Genome Res. 13(10) :2265-2270(2003), Immunogenetics5 4 (2) : 87-95 (2002)，Blood99 (8) : 2662-2669 (2002)，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 98 (17): 9772-9777 (2001)，Xu, M. J.,等(2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3) : 768-775 ； W02004016225(权利要求 2) ;W02003077836 ;W0200138490 (权利要求 5;附图 18D-1-18D-2) ；W02003097803(权利要求 12) ；W02003089624 (权利要求 25);交叉参考M頂606509 ；NP_110391. 2 ；NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2, Genbank 登记号 M11730) ；Coussens L.,等 Science(198 5) 230 (4730):1132-1139) ；Yamamoto Τ·，等 Nature319, 230-234，1986 ;Semba K., 等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 82，6497-6501，1985 ;Swiercz J. M.,等 J.Cell Biol. 165, 869-880, 2004 ；Kuhns J. J.,等 J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 19 99 ；Cho H. -S.,等 Nature421, 756-760，2003 ;Ehsani A.,等(1993)Genomicsl5, 426-429 ; W02004048938(实施例 2) ；W02004027049(附图1I) ；W02004009622 ；W02003081210 ； W02003089904(权利要求 9) ;W02003016475(权利要求1) ;US2003118592 ; W02003008537(权利要求1) ;W02003055439 (权利要求 29 ;附图 1A-B) ;W02003025228 (权利要求 37 ;附图 5C) ;W0200222636(实施例 13 ;95_107 页)；W0200212341 (权利要求 68 ； 附图 7) ;W0200213847 (71-74 页)；W0200214503 (页 114-117) ;W0200153463 (权利要求 2 ;41-46 页);W0200141787(15 页)；W0200044899 (权利要求 52 ;附图 7) ;W0200020579 (权利要求 3;附图 2) ;US5869445(权利要求 3 ;Col31-38) ;TO9630514(权利要求 2 ;页 56-61)； EP1439393(权利要求 7) ；W02004043361 (权利要求 7) ；W02004022709 ;TO200100244 (实施例 3 ;附图 4);登记号:P04626 ；EMBL ；M11767 ；AAA35808.1. EMBL ；M11761 ；AAA35808.1
(18) NCA (CEACAM6, Genbank 登记号 M18728) ；Barnett T., 等 Genomics3, 59-66，1988 ;Tawaragi Y.,等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 15 0, 89-96，1988 ； Strausberg R. L.,等 Proc. Natl.Acad. Sc1. U. S. A. 99:16899-16903, 2002 ；W02004063709 ；EP1439393 (权利要求 7) ；W02004044178 (实施例 4) ；W02004031238 ；W02003042661 (权利要求 12) ；W0200278524 (实施例 2)； W0200286443(权利要求 27 ;页 427) ;W0200260317 (权利要求 2);登记号:P40199 ；Q14920 ； EMBL ；M29541 ；AAA59915.1. EMBL ；M18728
(19)MDP(DPEP1, Genbank 登记号 BC017023) ;Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 99 (26) : 16899-16903 (2002)) ;W02003016475 (权利要求1) ;W0200264798 (权利要求 33;85-87 页);JP05003790(附图 6-8) ;W09946284 (附图 9);交叉参考MM: 179780 ; AAH17023.1 ；BC017023_1
(20) IL20R a (IL20Ra，ZCYT0R7, Genbank 登记号 AF184971) ;Clark H. F.,等 Genome Res.13,2265-2270，2003 ；Mungall A. J.,等 Nature425, 805-811，2003 ；BlumbergH.,等 Celll04, 9-19，2001 ;Dumoutier L.,等 J.1mmunol. 167，3545-3549，2001 ; Parrish-Novak J.,等 J.Biol. Chem. 277，47517-47523，2002 ;Pletnev S.,等(2003) Biochemistry42:12617-12624 ；Sheikh F.,等(2004)J.1mmunol. 172，2006-2010 ; EP1394274(实施例 11) ；US2004005320 (实施例 5) ；W02003029262 (74-75 页); W02003002717(权利要求 2 ;63 页)；W0200222153 (45-47 页)；US2002042366 (20-21 页)； W0200146261 (57-59 页);W0200146232 (63-65 页);W09837193 (权利要求1 ;55_59 页);登记号Q9UHF4 ；Q6UWA9 ；Q96SH8 ；EMBL ；AF184971 ；AAF01320.1
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, Genbank 登记号 AF229053) ;Gary S. C.,等 Gene256,139-147，2000 ；Clark H. F.,等 Genome Res.13,2265-2270, 2003 ；Strausberg R. L.,等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 99，16899-16903，2002 ；US2003186372 (权利要求11);US2003186373(权利要求 11) ;US2003119131 (权利要求1 ;附图 52) ;US2003119122 (权利要求I;附图52) ;US2003119126(权利要求1) ;US2003119121 (权利要求1 ;附图52)； US2003119129(权利要求1) ;US2003119130 (权利要求1) ;US2003119128 (权利要求1 ;附图 52) ;US2003119125(权利要求1) ;W02003016475 (权利要 求1) ;W0200202634 (权利要求1)
(22) EphB2R(DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Genbank 登记号 NM_004442); Chan,J.和 Watt, V. Μ.，0ncogene6(6)，1057-1061 (1991)OncogenelO(5):897-905(19 95)，Annu. Rev. Neurosc1. 21:309-345(1998)，Int.Rev.Cytol. 196:177-244 (2000))； W02003042661 (权利要求 12) ；W0200053216 (权利要求1 ;页 41) ；W02004065576 (权利要求1);TO2004020583(权利要求 9) ;W02003004529 (128-132 页)；W0200053216 (权利要求1 ; 42 页);交叉参考:MIM:600997 ；NP_004433. 2 ；NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h, Genbank 登记号 AX092328) ；US20040101899 (权利要求 2);W02003104399(权利要求 11) ；W02004000221 (附图 3) ;US2003165504 (权利要求1); US2003124140 (实施例 2) ；US2003065143 (附图 60) ；W02002102235 (权利要求 13 ；299 页)；US2003091580(实施例 2) ;W0200210187 (权利要求 6 ;附图 10) ;W0200194641 (权利要求12;附图7b) ;W0200202624(权利要求13 ;附图1A-1B) ;US2002034749 (权利要求 54 ；45-46 页);W0200206317(实施例 2 ；320-321 页，权利要求 34 ；321~322 页); W0200271928 (468-469 页)；W0200202587 (实施例1 ;附图1) ；W0200140269 (实施例 3 ；页 190-192) ；W0200036107(实施例 2 ；205-207 页)；W02004053079 (权利要求 12); W02003004989(权利要求1) ;W0200271928 (233-234，452-453 页)；W00116318
(24) PSCA (前列腺干细胞抗原前体(prostate stem cell precursor), Genbank 登记号 AJ297436) ；Reiter R. E.,等 Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 95，1735-1740，1998 ； Gu Z.,等 Oncogene 19, 1288-1296，2000 ；Biochem.Biophys. Res. Commun. (2000)275(3) :783-788 ；W02004022709 ;EP1394274 (实施例 11) ;US2004018553 (权利要求 17) ;W02003008537(权利要求1) ;W0200281646 (权利要求1 ;页 164) ;W02003003906 (权利要求 10 ;页 288) ;W0200140309(实施例1 ;附图 17) ;US2001055751 (实施例1 ;附图1b)； W0200032752(权利要求 18 ;附图1) ;W09851805 (权利要求 17 ;页 97) ;W09851824 (权利要求 10 ;94 页)；W09840403 (权利要求 2 ;附图1B);登记号:043653 ；EMBL ；AF043498 ； AAC39607.1
(25) GEDA (Genbank 登记号 AY260763) ；AAP14954 脂肪瘤 HMGIC 融合-配偶体-类蛋白(lipoma HMGIC fusion-partner-like protein)/pid=AAP14954.1-人类(人)； W02003054152(权利要求 20) ;W02003000842 (权利要求1) ;W02003023013 (实施例 3，权利要求 20) ;US2003194704(权利要求 45);交叉参考:G1:30102449 ；AAP14954.1 ；AY260763_1
(26) BAFF-R (B细胞-活化因子受体，BLyS受体3，BR3, Genbank登记号 AFl 16456) ；BAFF 受体 /pid=NP_443177.1-人类:Thompson, J. S.,等 Science293 (5537),2108-2111(2001) ；W02004058309 ；W02004011611 ；W02003045422(实施例;32_33 页)； W02003014294(权利要求 35 ;附图 6B) ；W02003035846 (权利要求 70 ;615_616 页); W0200294852 (Col 136-137) ;W0200238766 (权利要求 3 ; 133 页);W0200224909 (实施例 3 ； 附图 3);交叉参考:MIM:606269 ；NP_443177.1 ；NM_052945_1 ；AF132600
(27) CD22 (B_ 细胞受体 CD22-B 同种型，BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank 登记号 AK026467) ;Wilson 等(1991) J. Exp. Med. 173:137-146 ;TO2003072036 (权利要求 I ;附图1);交叉参考:MIM: 107266 ；NP_001762.1 ；NM_001771_ 1
(28)CD79a(CD79A，CD79 α，免疫球蛋白-相关α，一种B细胞-特异性蛋白，其与IgP (⑶79Β)共价相互作用并且在表面上与Ig M分子形成复合物，转导涉及 B-细胞分化的信号)，p1:4. 84，MW:25028ΤΜ:2[P]GeneChromosome:19ql3. 2，Genbank 登记号 NP_001774. 10) ；W02003088808, US20030228319 ；W02003062401 (权利要求 9); US2002150573(权利要求 4，13-14 页);W09958658 (权利要求 13，附图 16) ;W09207574(附图1) ；US5644033 ；Ha 等(1992)J.1mmunol. 148(5):1526-1531 ;Mueller 等(1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625 ；Hashimoto 等(1994)Immunogenetics40(4):287-295 ； PreucThomme 等(1992)Clin.Exp.1mmunol.90(l):141_146;Yu 等(1992) J.1mmunol. 148(2)633-637 ；Sakaguchi 等(1988)EMBO J. 7(11):3457-3464
(29) CXCR5 (伯基特淋巴瘤受体 l(Burkitt’ s lymphoma receptorl), 一种G蛋白偶联受体，由CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在HIV-2感染中起作用和可能在AIDS、淋巴瘤、黑素瘤和白血病发生中起作用)；372aa, pl:8. 54MW:41959TM:7[P]Gene Chromosome:1lq23. 3，Genbank 登记号 NP_001707.1) ；W02004040000 ；W02004015426 ；US2003105292(实施例 2) ；US6555339(实施例 2) ;W0200261087(附图1) ;W0200157188 (权利要求 20，页 269) ；W0200172830 (12-13 页);W0200022129(实施例1, 152-153 页，实施例 2，254-256 页);W09928468 (权利要求1,页 38) ；US5440021 (实施例 2，col49_52) ；W09428931 (56-58 页);W09217497 (权利要求 7,附图 5) ；Dobner 等(1992)Eur. J.1mmunol. 22:2795-2799 ；Barella 等(1995)Biochem. J. 309:773-779
(30)HLA-DOB (MHC II类分子的β亚单位(Ia抗原)，其与肽结合并且将其呈递给 CD4+T 淋巴细胞);273aa，pl:6. 56, MW: 30820. TM:1 [P] GeneChromosome: 6p21. 3，Genbank 登记号 ΝΡ_002111· I) ;Tonnelle 等(1985)EMBO J. 4(11) :2839-2847 Jonsson 等(1989) Immunogenetics29(6) :411-413 ;Beck 等(1992)J. Mol. Biol. 228:433-441 ；Strausberg 等(2002)Proc.Natl. Acad. Sci USA99:16899-16903 ;Servenius 等(1987)J.Biol. Chem. 262:8759-8766 ；Beck 等(1996)J. Mol. Biol. 255:1-13 ；Naruse 等(2002)Tissue Antigens59:512-519 ;W09958658(权利要求 13，附图 15) ;US6153408(Col35_38)； US597655 1 (col 168-170) ；US601 1 146 (col 145-146) ；Kasahara 等(1989) Immunogenetics30 (I) : 66-68 ；Larhammar 等(1985) J. Biol. Chem. 260 (26) : 14111-14119
(31)P2X5 (嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel5),即由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，其缺陷可以促使特发性逼尿肌不稳定病理生理学情况)； 422aa), p1:7. 63, Mff:47206TM:1[P]Gene Chromosome:17pl3. 3, Genbank 登记号 NP_002552. 2) ；Le 等(1997)FEBS Lett.418 (1-2):195-199 ；W02004047749 ； W02003072035(权利要求 10) ；Touchman 等(2000)Genome Res. 10:165-173 ； W0200222660(权利要求 20) ;W02003093444 (权利要求1) ;W02003087768 (权利要求1)； W02003029277(82 页)；
(32)CD72(B-细胞分化抗原 CD72, Lyb-2 ；359aa), p1: 8. 66, MW: 40225TM:1 [P] Gene Chromosome:9pl3. 3，Genbank 登记号 ΝΡ_001773· I) ;W02004042346(权利要求 6δ) ；W02003026493(51-52, 57-58 页)!TO2OOO75655 (IO5-1O6 页);Von Hoegen 等 (1990)J.1mmunol. 144(12) :4870-4877 ;Strausberg 等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA99:16899-16903
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，即富含亮氨酸重复(LRR)家族I型膜蛋白(type I memberane protein of the leucine rich repeat family),调节 B_ 细胞细胞活化和程序性细胞死亡，其功能缺失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活动增加有关)；661aa, p1:6. 20, Mff:74147TM:1[P]Gene Chromosome:5ql2, Genbank g 记号 NP_005573.1) ；US2002193567 ；W09707198(权利要求 11,39-42 页)；Miura 等 (1996)Genomics38(3):299-304 ；Miura 等(1998)Blood92:2815-2822 ；W02003083047 ； W09744452 (权利要求 8，57—61 页)；W0200012130 (24-26 页)
(34)FcRHl (Fe 受体-样蛋白 1 (Fe receptor-like proteinl),即含有 C2 型 Ig-样结构域和ITAM结构域的免疫球蛋白Fe结构域的推定受体，可能在B-淋巴细胞分化中起作用)；429aa, p1:5. 28，MW:46925TM:1[P]GeneChromosome:1q21-1q22, Genbank 登记号 NP_443170.1) ；W02003077836 ;W0200138490 (权利要求 6，附图 18E-1-18-E-2)； Davis 等(2001)Proc. Natl. Acad. Sci USA98(17) :9772-9777 ;W02003089624 (权利要求 8)； EP1347046 (权利要求1) ；W02003089624 (权利要求 7)
(35) IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2，即在B细胞发育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受体；由于易位所导致的基因失调在某些B细胞恶性肿瘤中发生)；977aa, p1:6. 88, MW: 106468, TM:1 [P]Gene Chromosome: lq21, Genbank 登记号人AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL 834187, AY358085 ;小鼠:AK089756, AY158090, AY506558 ；NP_112571.1 ;TO2003024392 (权利要求 2，附图97) ; Nakayama 等(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277 (1) : 124-127 ； W02003077836 ;W0200138490(权利要求 3，附图 18B-1-18B-2)
(36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulin, TPEF, HPP1, TR,与 EGF/调蛋白(heregulin)家族生长因子和卵泡抑素(follistatin)有关的推定的跨膜蛋白聚糖)；374aa，NCBI登记号 AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq:NP_057276 ；NCBI 基因23671 ；0ΜΙΜ:605734 ； SwissProt Q9UIK5 ;Genbank 登记号 AF179274 ;AY358907, CAF85723, CQ782436 ; W02004074320 JP2004113151 ；W02003042661 ；W02003009814 ；EP1295944(69-70 页); W0200230268(329 页);W0200190304;US2004249130 ；US2004022727 ；W02004063355 ； US2004197325 ；US2003232350 ；US2004005563 ；US2003124579 ；Horie 等(2000) Genomics67:146-152 ；Uchida 等(1999)Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602 ； Liang 等(2000)Cancer Res. 60:4907-12 ;Glynne_Jones 等(2001)Int J Cancer. Oct15 ; 94(2) : 178-84。
亲代抗体还可以为包含清蛋白-结合肽(ABP)序列的融合蛋白(Dennis等(2002)“Albumin Binding As A General Strategy For Improving ThePharmacokinetics Of Proteins^J Biol Chem. 277:35035-35043 ;W001/45746)。本发明的抗体包括具有下列文献中教导的 ABP 序列的融合蛋白:a)Dennis 等(2002) J Biol Chem. 277:35035-35043， 表 III 和 IV，35038 页；(ii)US20040001827，在
;和(iii)W001/45746，在 12-13 页， 并且将所有这些文献弓I入本文作为参考。
诱变
可通过本领域中公知的多种方法制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括，但不限于通过位点-定向(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和对编码所述多肽的较早制备的DNA的盒式诱变制备。还可以通过限制片段操作或通过使用合成寡核苷酸的重叠延伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替代物。标准诱变技术可以用于产生编码这类突变的半胱氨酸改造的抗体的DNA。一般指导原则可以在下列文献中找到:Sambrook等Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 ;和 Ausubel 等 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 和 Wiley-1nterscience, New York, N. Y.，1993。
位点-定向诱变为一种制备替代变体，即突变蛋白的方法。这项技术为本领域众所周知(例如，参见，Carter (1985)等 Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 ;Ho 等(1989) 基因(Amst. )77:51-59 ;和 Kunkel 等(1987)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA82:488)。简言之， 在进行DNA位点-定向诱变过程中，通过首先使编码所需突变的寡核苷酸与这类起始DNA 的单链杂交来改变起始DNA。在杂交后，将DNA聚合酶用于使用杂交的寡核苷酸作为引物并且使用起始DNA单链作为模板合成完整的第二链。因此，将编码所需突变的寡核苷酸掺入所得双链DNA。位点-定向诱变可以在表达质粒中表达预进行诱变的蛋白质的基因中进行，并且可以对所得质粒测序以便证实引入了所需的半胱氨酸替代突变(Liu等(1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260)。位点-定向方案和方式，包括那些商购的方案和方式，例如 QliikChange ⑧ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)。
PCR诱变还适合于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi，(1990): PCR Protocols, pp. 177-183, Academic Press ；Ito 等(1991)基因 102:67-70; Bernhard 等(1994)Bioconjugate Chem. 5:126-132 ;和 Vallette 等(1989)Nuc. Acids Res. 17:723-733。简言之，当将少量模板DNA用作PCR中的起始物时，在序列方面稍不同于模板DNA中相应区的引物可以用于产生相对大量的特异性DNA片段，这些片段仅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。
用于制备变体的另一种方法，即盒式诱变基于Wells等(1985)基因34:315-323 所述的技术。起始物为包含预突变的起始多肽DNA的质粒(或其它载体)。鉴定预突变的起始DNA中的密码子。在鉴定的突变位点的每侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。 如果不存在这类限制位点，那么可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法产生它们，以便将其引入起始多肽DNA的适当位置上。在这些位点上切割质粒DNA以使其线性化。使用标准操作步骤合成编码在限制位点之间但含有所需突变的DNA序列的双链寡核苷酸。其中分别合成寡核苷酸的两条链然后使用标准技术彼此杂交。通过亚磷酰胺合成法(phosphoramidite synthesis method)制备寡核昔酸(US4415732 ；US4458066 ；Beaucage, S.和 Iyer, R. (1992)"Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite ap proach〃, Tetrahedron48:2223-2311).这种双链寡核苷酸称作盒(cassette)。将这种盒设计成具有与线性化质粒末端相容的5’和3’末端，使得它可以直接连接质粒。这种质粒目前含有突变的DNA序列。可以通过DNA测序证实含有编码的半胱氨酸替代物的突变DNA。
还通过寡核苷酸定向诱变，使用经PCR的诱变的双链质粒DNA作为模板产生单突变(Sambrook和 Russel, (2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition ； Zoller 等(1983)Methods Enzymo1. 100:468-500 ；Zoller, M. J.和 Smith, M. (1982)Nucl. Acids Res. 10:6487-6500)。
在本发明中，在M13卩遼菌体上展不的hu4D5Fabv8 (Gerstner等(2002) “Sequence Plasticity In The Antigen-Binding Site Of A Therapeutic Anti_HER2Antibody，，，J Mol Biol. 321:851-62)作为模型系统用于实验。将半胱氨酸突变引 入hu4D5Fabv8-噬菌体、hu4D5Fabv8和ABP_hu4D5Fabv8构建体。如上所述使用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行 hu4D5-ThioFab-嗤菌体制备(Lowman, Henry B. (1998)Methods in Molecular Biology(Totowa, New Jersey) 87(Combinatorial peptide Library Protocols)249-264)。
PHESELECTORjl^
PHESELECT0R(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA)测定法能够以ELISA噬菌体方式检测抗体中反应性半胱氨酸基团。实施例2中详细描述了在孔表面上包被所关注的蛋白质(例如抗体)，随后与噬菌粒一起温育且然后使用吸光度检测HRP标记的二抗的过程。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用从抗体或其它蛋白的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反应位点相同的手段生产半胱氨酸改造的抗体的文库并且进行结合筛选。这项技术包括使噬菌体上展示的半胱氨酸突变体与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。附图8通过描绘Fab或ThioFab与 HER2 (上)和生物素化的ThioFab与链霉抗生物素(下)结合的示意图例示了 PHESELECT0R 测定。
蛋白质表汰和纯仆.
易于使用常规操作步骤(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离编码半胱氨酸改造的抗体的DNA并且对其进行测序。杂交瘤细胞用作这类DNA的来源。一旦分离，就可以将DNA放入表达载体,然后将其转染入宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其它不额外产生抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞，诸如骨髓瘤细胞(US5807715 ；US2005/0048572 ； US2004/0229310)，以便获得重组宿主中合成的单克隆抗体。hu4D5Fabv8半胱氨酸改造的抗体的产率与野生型hu4D5Fabv8相似。有关细菌中编码抗体的DNA的重组表达的综述文章包括 Skerra等(1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 和 Pliickthun (1992) Immumol. Revs.130:151-188。
在设计和选择后，可以通过下列方式生产具有高度反应性的未配对的Cys残基的半胱氨酸改造的抗体，例如ThioFab :(i)在细菌，例如大肠杆菌系统或哺乳动物细胞培养系统中表达(W001/00245)，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO);和(ii)使用常用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman 等(1991) J. Biol. Chem. 266 (17) : 10982-10988)。
在34B8，即非-阻抑性大肠杆菌菌株中诱导时表达ThioFab(Baca等(1997) Journal Biological Chemistry272 (16) : 10678-84)。参见实施例 3a。将收集的细胞沉淀重新悬浮于PBS (磷酸缓冲盐水)中，通过经过微流化仪(microf Iuidizer)进行总细胞裂解并且通过使用蛋白质G SEPHAR0SE (Amersham)的亲和层析法纯化ThioFab。如上所述使ThioFab与生物素-PEO-马来酰亚胺偶联并且通过Superdex-200 (Amersham)凝胶过滤层析法进一步纯化生物素化-ThioFab，从而消除了游离的生物素-PEO-马来酰亚胺和 ThioFab的寡聚化级分。
质谱分析
使用液相层析电喷射离子化质谱(LC-ES1-MS)分析对生物素偶联的Fab进行精确分子量测定(Cole, R. B. Electro Spray Ionization Mass Spectrometry:Fundamentals, I nstrumentation and Applications. (1997)Wiley, New York)。通过膜蛋白酶消化，随后通过LC-ES1-串联MS分析测定生物素化的hu4D5Fabv8(A121C)的氨基酸序列(表4，实施例 3b)。
抗体Fab片段hu4D5Fabv8含有约445个氨基酸残基，包括10个Cys残基(5个在轻链上，且5个在重链上)。已经确立了人源化4D5可变片段(Fv4D 5)的高分辨结构， 参见Eigenbrot 等 “X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variant Of Humanized Ant1-P185her2Antibody4D5 和 Comparison With MolecularModeling”(1993) J Mol Biol. 229:969-995)。所有的Cys残基均以二硫键形式存在，由此这些残基不具有任何与药物-马来酰亚胺偶联的反应性硫醇(reactive-thiol group)(除非用还原剂处理)。因此，新改造的Cys残基可以保持不配对并且能够与亲电子接头试剂或药物_接头中间体(drug-linker intermediate),诸如药物-马来酰亚胺反应，即与之偶联。附图1A表示X-射线晶体坐标衍生的hu4D5Fabv8抗体片段的三维示意图。按照顺序标号系统给重链和轻链的改造的Cys残基的结构位置编号。这种顺序编号系统(sequential numbering system)与 Kabat 编号系统相关(Kabat 等，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD),而Kabat编号系统用于附图1B的曲妥单抗(trastuzumab)的 4d5v7fabH变体,该附图表不从N-末端开始的顺序编号方案(上行),它不同于Kabat编号方案(下行)的方面在于a、b、c标注的插入。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有相当于可变域的FR或CDR的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。通过下表中的顺序编号和Kabat编号方案鉴定半胱氨酸改造的重链变体位点
权利要求
1.一种分离的半胱氨酸改造的抗体，其包含游离半胱氨酸氨基酸和重链中选自SEQ ID NO:50-98的序列或轻链中选自SEQ ID N0:99_147的序列，其中所述序列中的半胱氨酸是游离半胱氨酸氨基酸。
2.权利要求1的分离的半胱氨酸改造的抗体，其通过包括以下步骤的方法制备(i)通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列，以便编码半胱氨酸改造的抗体；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；并(iii)分离半胱氨酸改造的抗体。
3.权利要求2的半胱氨酸改造的抗体，其中诱变包括位点定向诱变。
4.权利要求2的半胱氨酸改造的抗体，其中在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造的抗体。
5.权利要求2的半胱氨酸改造的抗体，进一步包括(i)使半胱氨酸改造的抗体与硫醇-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；并( )测量亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与捕捉介质的结合。
6.权利要求5的半胱氨酸改造的抗体，其中所述硫醇-反应性亲和试剂包含生物素部分。
7.权利要求5的半胱氨酸改造的抗体，其中所述硫醇-反应试剂包含马来酰亚胺部分。
8.权利要求5的半胱氨酸改造的抗体，其中所述捕捉介质包含链霉抗生物素。
9.权利要求1的半胱氨酸改造的抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗体为包含清蛋白结合肽(ABP)的融合蛋白。
10.权利要求9的半胱氨酸改造的抗体，其中所述ABP包含选自SEQIDNO: K SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 JPSEQ ID NO: 5 的序列。
11.权利要求1的半胱氨酸改造的抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗体选自单克隆抗体、抗体片段、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、和人源化抗体。
12.权利要求11的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体片段为Fab片段。
13.权利要求11的半胱氨酸改造的抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗体为抗HER2抗体。
14.权利要求1的半胱氨酸改造的抗体，其中所述半胱氨酸改造的抗体结合受体 (1)-(36)中的一种或多种(1)BMPRlB (骨形态发生蛋白受体-1B型)；(2)E16(LAT1,SLC7A5)；(3)STEAPl (前列腺的六跨膜上皮细胞抗原)；(4)0772P(CA125，MUC16)；(5)MPF(MPF,MSLN, SMR,巨核细胞强化因子，mesothelin)；(6)Napi3b (NAP1-3B, NPTIIb, SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；(7)Sema5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG,脑信号蛋白 5b Hlog, sema 结构域，七血小板反应蛋白重复(I型和类I型)，跨膜结构域(TM)和短胞质域，(脑信号蛋白)5B)；(8)PSCAhlg(2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA2700050C12, RIKEN cDNA2700050C12 基因)；(9)ETBR (内皮缩血管肽B型受体)；(10)MSG783(RNF124,推定蛋白FLJ20315)；(11)STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP I, STAMP I, STEAP2, STMP,前列腺癌相关基因 1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮细胞抗原2，六跨膜前列腺蛋白)；(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041, TRPM4, TRPM4B,瞬时型受体电位阳离子通道，亚家族 M,成员4)；(13)CRIPTO (CR, CRl, CRGF, CRIPTO, TDGF1,畸胎瘤-衍生的生长因子)；(14)CD21(CR2(补体受体2)或 C3DR(C3d/EB 病毒受体)或 Hs. 73792)；(15)CD79b (CD79B, CD79 β，IGb (免疫球蛋白-相关 β ), Β29)；(16)FcRH2 (IFGP4，IRTA4，SPAPlA (含有磷酸酶锚定蛋白Ia的SH2结构域)，SPAP1B, SPAP1C)；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Ra；(21)Brevican；(22)EphB2R；(23)ASLG659； 24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R(B细胞-活化因子受体，BLyS受体3，BR3)；`(27)CD22 (B-细胞受体CD22-B同种型);(28)⑶79a(⑶79A，⑶79 α，免疫球蛋白-相关α，B细胞-特异性蛋白);(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，G蛋白-偶联受体)；(30)HLA-DOB(MHC II类分子β亚单位(Ia抗原))；(31)Ρ2Χ5(嘌呤能受体Ρ2Χ配体门控性离子通道5)；(32)CD72 (B-细胞分化抗原 CD72，Lyb-2)；(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白);(34)FcRHl (Fe 受体-样蛋白 I)；(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关蛋白2);和(36)TENB2(推定的跨膜`蛋白聚糖)。
15.权利要求1的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价附着于捕捉标记、检测标记、药物部分、或固相支持物。
16.权利要求15的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价附着于生物素捕捉标记。
17.权利要求15的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价附着于荧光染料检测标记。
18.权利要求17的半胱氨酸改造的抗体，其中所述荧光染料选自荧光素类、若丹明类、 丹酰、丽丝胺、花菁、藻红蛋白、德克萨斯红及其类似物。
19.权利要求15的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价附着于选自3H、nC、14C、18F、 32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、89Zr、99TC、mIn、1231、1241、1251、1311、133Xe、177Lu、211At、和 213Bi 的放射性核素检测标记。
20.权利要求15的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体通过螯合配体共价附着于检测T 己 O
21.权利要求20的半胱氨酸改造的抗体，其中所述螯合配体选自DOTA、DOTP,DOTMA, DTPA 和 TETA。
22.权利要求15的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体共价附着于选自美登木素生物碱、auristatin、多拉司他汀、单端孢霉烯、CC1065、加利车霉素、烯二炔类抗生素、紫杉烷、 和蒽环类抗生素的药物部分以形成具有式I的抗体-药物偶联物Ab-(L-D) P I其中Ab为抗体，L为接头，D为药物部分,且P为1、2、3、或4。
23.权利要求22的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体-药物偶联物具有以下结构
24.权利要求22的半胱氨酸改造的抗体，其中D为具有以卜结构的美登木素生物碱
25.权利要求24的半胱氨酸改造的抗体,其中D选自以下结构
26.权利要求25的半胱氨酸改造的抗体，其具有以下结构
27.权利要求22的半胱氨酸改造的抗体，其中D为具有以下结构的单甲基auristatin 药物部分MMAE或MMAF
28.权利要求27的半胱氨酸改造的抗体，其中所述抗体-药物偶联物选自以下结构
全文摘要
制备在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造抗体，即诱变亲本抗体的核酸序列及将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换，以便编码半胱氨酸改造抗体；表达半胱氨酸改造抗体；并分离半胱氨酸改造抗体。通过PHESELECTOR测定法鉴定出某些高度反应性半胱氨酸改造抗体。分离的半胱氨酸改造抗体可共价附着于捕捉标记、检测标记、药物部分、或固相支持物。
文档编号A61K47/48GK103068406SQ201180039258
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月7日 优先权日2010年6月8日
发明者S.巴克塔, J.R.朱纳图拉 申请人:基因泰克公司