热稳定性疫苗组合物及其制备方法

热稳定性疫苗组合物及其制备方法【专利摘要】本公开提供涉及热稳定性疫苗的组合物和其制备方法。具体而言，本公开提供制备热稳定性疫苗的方法，其基于重组蓖麻蛋白神经毒素蛋白质并且使用辅佐剂开发能够在对象中诱发免疫应答的组合物。【专利说明】热稳定性疫苗组合物及其制备方法[0001]政府支持声明[0002]本发明在国立健康研究所U01-A1-08-2210授权下由政府支持作出。政府具有本发明的某些权利。【
技术领域：
】[0003]本发明一般涉及干燥疫苗组合物的领域。更具体而言，涉及生产结合至佐剂并且包含免疫刺激分子的干燥疫苗组合物的方法。【
背景技术：
】[0004]包含重组蛋白的疫苗受益于或绝对需要佐剂，以诱发免疫应答。(Callahan等,1991,Theimportanceofsurfacechargeintheoptimizationofantigen-adjuvantinteractions,Pharm.Res.8(7):851-858;Singh和0'Haganl999,Advancesinvaccineadjuvants,NatBiotechnol17(II):1075-81;以及0’Hagan等,2001,Recentdevelopmentsinadjuvantsforvaccinesagainstinfectiousdiseases,BiomolEngl8(3):69-85)。招盐佐剂是目前最广泛使用的一般用于人的佐剂，这是因为在施用至儿童和成人的疫苗中安全使用的长久历史。FDA批准的疫苗中目前出现的唯一佐剂是铝盐佐剂、氢氧化铝和磷酸铝。铝盐佐剂提高疫苗的免疫原性并且通过减少疫苗中蛋白质剂量水平引起接种结果的显著提高，提高了保护性抗体的滴度，并且减少了在已经完成主要系列接种之后的每年接种需要。但是，在基于重组蛋白、肽和化学合成疫苗的许多亚单位疫苗中铝盐佐剂的使用存在明显的限制。这些限制包括疫苗存储和稳定性的一般方面，因为包含铝佐剂的疫苗仅仅在窄温度范围内可存储，并且不能冷冻。进一步限制包括普遍接受的观点:铝佐剂相对弱，不促进细胞免疫的发展，并且在中和抗体需要用于阻断病毒感染或阻止生物毒素活性的情况下可利于开发非中和的抗体。[0005]在铝佐剂的情况下，已经建议，为了提供足够的免疫原性，抗原必须被吸附在佐剂的表面上°(Gupta等，1995，AdjuvantPropertiesofAluminumandCalciumCompounds.PharmaceuticalBiotechnology.6:229-248;以及White和Hem,2000,Characterizationofaluminium-containingadjuvants,DevBiol(Basel)103:217-28)。通常通过抗原和佐剂之间的静电相互作用促进该吸附，并且通常选择配制PH以使抗原和佐剂带相反的电荷(Callahan等1991)。也可通过与缓冲盐如磷酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐的表面交换反应，改变佐剂上的表面电荷(Hem和White,1984，Characterizationofaluminumhydroxideforuseasanadjuvantinparenteralvaccines.JParenterSciTechnol,38(I):p.2-10;Chang等,1997,Roleoftheelectrostaticattractiveforceintheadsorptionofproteinsbyaluminumhydroxideadjuvant.PDAJPharmSciTechnol,51(1):p.25-9;以及Rinella等，1996，Treatmentofaluminiumhydroxideadjuvanttooptimizetheadsorptionofbasicproteins.Vaccine,14(4):p.298-300)。对铝盐佐剂的作用机制了解不多，但是可能是由于数个不同的机制°(Lindblad2004."Aluminiumcompoundsforuseinvaccines^Immuno1.Cell.Biol.82(5):497-505;Gupta和Siber,1995，AdjuvantsforHumanVaccines—CurrentStatus,ProblemsandFuture-Prospects.Vaccinel3(14):1263-1276;Gupta和Rost,2000,AluminumCompoundsasVaccineAdjuvants,In0’HaganD,editorVaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols,ed.,Totowa,N.J.:HumanaPressInc.p65~89;Cox和Coulter,1997，Adjuvants—aclassificationandreviewoftheirmodesofaction,Vaccinel5(3):248-256)。通常提出的机制是佐剂用作在注入部位的储库，其中抗原在施用后缓慢释放。(Cox和Coulter,1997)。另一提出的机制是佐剂帮助递送抗原至抗原呈递细胞(Lindblad2004)。进一步提出的机制是佐剂用作免疫刺激剂并且诱发Th2细胞因子(Grun和Maurerl989,DifferentThelpercellsubsetselicitedinmiceutilizingtwodifferentadjuvantvehicles:theroleofendogenousinterleukinlinproliferativeresponses.CellImmunol121(I):134-145)。仍另一提出的机制是佐剂使得佐剂表面上的蛋白质抗原不稳定，造成它们更容易遭受蛋白水解降解(Jones等，2005，Effectsofadsorptiontoaluminumsaltadjuvantsonthestructureandstabilityofmodelproteinantigens.JBiolChem280(14):13406-13414;以及That等，2004."Antigenstabilitycontrolsantigenpresentation"】.Biol.Chem.279(48):50257-50266)。[0006]尽管未充分理解作用机制，但可能表面积、表面电荷和佐剂的形态是决定对吸附在这些佐剂上的抗原免疫应答的重要因素(Hem和Whitel984)。通常的理论是疫苗佐剂的颗粒大小越小，疫苗制剂免疫原性越大，尤其当颗粒大小是大约I微米时-最适于摄取专职抗原呈递细胞的尺寸(Maa等，2003.Stabilizationofalum-adjuvantedvaccinedrypowderformulations:mechanismandapplication.JPharmSci92(2):319-332,Diminsky等,1999.Physical,chemicalandimmunologicalstabilityofCHO-derivedhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)particles.Vaccinel8(l-2):3-17)。[0007]冻干(冷冻干燥)是经常用于提高各种蛋白制剂长期稳定性的方法。但是，当用铝盐佐剂配制的疫苗被处理以试图通过冷冻和冻干提高稳定性时，出现效价损失，其中效价是通过一系列试验可测量的疫苗数量质量之和，其可包括动物中的免疫原性、蛋白质抗原的化学降解、蛋白质抗原的变性或取代免疫原性表位的损失。效价的损失与人中效力的损失相关。之前的研究已经提示，由于佐剂颗粒的聚集，不能生产包含佐剂的冷冻干燥疫苗产品。(Diminsky等，1999;Maa等,2003)。已经提出许多理论以解释用招盐佐剂配制的疫苗冻干之后效价损失的可能机制。颗粒聚集可能解释显著损失。例如，冷冻和融化之后碳酸羟铝和氢氧化镁凝胶的聚集已经归因于使颗粒在一起的冰晶形成，这导致不可逆的聚集°(Zapata等，1984，Mechanismoffreeze-thawinstabilityofaluminumhydroxycarbonateandmagnesiumhydroxidegels.JPharmSci73(I):3-8)。该角军释已经由Maa等，2003提出，进一步提示更快的冷却速度导致更大的冰成核速度并且形成更小的冰晶，这将不使铝颗粒形成聚集体。颗粒聚集可因此解释效价的损失，而不是其他因素，比如蛋白质构造(三级结构)的损失、蛋白质二级结构的损失和通过氨基酸侧链脱酰胺或氧化的一级结构修饰。[0008]通过颗粒数量和表面积，而不是由颗粒质量，预测颗粒增加变应性致敏的能力。Moorefield等显示佐剂颗粒的抗原内化程度与佐剂聚集体的颗粒大小逆相关(Moorefield等,2005.〃Roleofaluminum-containingadjuvantsinantigeninternalizationbydendriticcellsinvitro〃Vaccine23(13):1588-1595)。Nygaard等显不颗粒直径并且因此表面积和颗粒数量而不是质量或体积在聚苯乙烯颗粒在小鼠中免疫应答中是主要特性(Nygaard等，2004)。尽管可能颗粒大小是免疫原性的重要特征参数，但仍需全面的研究考察作为所生产产物的配制和冷却速度以及其他物理性质的函数的颗粒大小分布(PSD)。[0009]存在一些一致的观察:更有效的具有铝佐剂的疫苗是其中抗原结合至铝表面的那些，而不是游离在溶液中的那些(Lindblad,2004，Aluminiumadjuvants—inretrospectandprospect,Vaccine,22:3658-68)。为了制剂的再现性和稳定性，期望限定抗原最佳结合晶体表面的条件，和其中抗原在一段时间内或在升高应力条件下不被脱附的条件。为了构建铝疫苗，有必要进行研究以优化结合和脱附。铝佐剂在某些溶液PH下具有零电荷点(PZC)，但是在高于或低于该值的pH下带电(White和Hem,2000,Characterizationofaluminium-containingadjuvants,DevBiol(Basel)，103:217-28)。对于通常需要结合铝盐佐剂以获得期望免疫应答的重组蛋白疫苗，选择最佳配制PH进一步复杂化(Mclnerney,Brennan等，1999，AnalysisoftheabilityoffiveadjuvantstoenhanceimmuneresponsestoachimericplantvirusdisplayinganHIV-lpeptide,Vaccine，17:1359-68)。为了促进蛋白质结合佐剂，选择其中蛋白质和佐剂具有相反电荷的溶液pH。但是，提供最佳蛋白质稳定性的溶液pH可能不允许疫苗适当结合佐剂。在这种情形下，疫苗蛋白质可能不得不在对于稳定性次优的PH下制备并且与适当的稳定赋形剂冻干，以使得长期存储期间的降解最小化。[0010]冻干蛋白质以稳定结构和活性以便存储和重构通常已经应用于重组蛋白治疗性蛋白质。这已经通常通过在二糖比如海藻糖和促进加工和存储期间玻璃态的其他赋形剂的存在下实现。蛋白质可长期存储，只要产物在其玻璃化转变温度(Tg)以下存储，高于Tg材料转化成橡胶样态。认为赋形剂通过稳定剂与具体位点的相互作用而在干燥期间取代水并且通过同时抑制蛋白质分子U-松弛)或分子部分((6-松弛)的平移和旋转运动，稳定无定形状态的蛋白质。干燥技术已经较少应用于疫苗的长期存储，尤其在吸附至磷酸铝或氢氧化铝佐剂的疫苗的情况下。可用的关于在升高温度条件下存储干燥疫苗的数据非常少，因为产生干燥疫苗的大部分尝试是为了获得能够在中等温度幅度下存活的可吸入粉末或制剂。例如，因为黄热病疫苗主要用于热带气候，在稳定剂(乳糖、山梨糖醇)存在下的冻干已经用于保持活病毒疫苗的活力(Monath,1996，Stabilityofyellowfevervaccine,DevBiolStand,87:219-25)。冻干和存储期间没有赋形剂，在_20°C以上活性快速丧失，但是被稳定的疫苗可在37°C下经受多于两周。也已经开发了用于牛疾病牛疫的冻干的干燥疫苗并且可在离开冷链(coldchain)之后在非洲地域条件下使用多达一个月(House和Mariner,1996，Stabilizationofrinderpestvaccinebymodificationofthelyophilizationprocess,DevBiolStand,87:235-44)。使用方法和干燥变型的类似尝试最经已经用于麻疫疫苗开发(Burger,Cape等，2008，StabilizingformulationsforinhalablepowdersofIive-attenuatedmeaslesvirusvaccine,JAerosolMedPulmDrugDeliv,21:25-34;Burger,Cape等，2008，StabilizingFormulationsforInhalablePowdersofLive-AttenuatedMeaslesVirusVaccine,JAerosolMed)和用于流感的干燥疫苗粉末，其中设计允许保持免疫原结构的条件可能非常重要(Amorij,Meulenaar等,2007,Rationaldesignofaninfluenzasubunitvaccinepowderwithsugarglasstechnology:preventingconformationalchangesofhaemagglutininduringfreezingandfreeze-drying,Vaccine,25:6447-57;Amorij,Huckriede等，2008，DevelopmentofStableInfluenzaVaccinePowderFormulations:ChallengesandPossibilities,PharmRes)。作为稳定剂,少量的甲醒偶尔添加至疫苗,包括当前的AVA炭疽疫苗(Biothraxig),并且可通过交联蛋白质起作用，在招晶体表面上形成更多免疫原性蛋白质聚集体(Little,Ivins等，2007，EffectofaluminumhydroxideadjuvantandformaldehydeintheformulationofrPAanthraxvaccine,Vaccine,25:2771-7)。历史上，甲醛已经用作衍生自培养物上清液比如破伤风类毒素、肉毒杆菌类毒素和其他的较老疫苗中的选择的稳定剂。当前的AVA疫苗标记为3年稳定性，其中稳定性是许多生物化学评估和效价的函数。尽管用液体悬浮疫苗可实现适合量的稳定性，但是在疫苗库存和分发所需的更长存储期不可能满足所有稳定性参数。[0011]治疗性蛋白质的成功干燥，同时保持结构和功能，取决于溶液中发生的降解途径的理解，所述降解途径可能被适当的干燥和用于稳定的赋形剂延迟或消除。对于疫苗，主要通过免疫原性和保护研究，而不是酶活性来确定功能。在吸附至铝佐剂晶体的蛋白质免疫原的情况下，功能和其他体外参数的测量相应地更困难，因为蛋白质可被截留并且难以去除用于分析。因此，可仅仅通过免疫原性和保护研究测试功能。蛋白质三级构象可明显影响酶功能一如果存在，但是取决于构象，也可影响B细胞表位的免疫原性。其中包含的线性B和T细胞表位也可受(甲硫氨酸和半胱氨酸残基的)氧化和(尤其天冬酰胺残基的)脱酰胺的影响。PH是控制治疗性蛋白质稳定性的最关键配制变量之一(Carpenter,Chang等,2002,Rationaldesignofstablelyophilizedproteinformulations:theoryandpractice,PharmBiotechnol,13:109-33;Chi,Krishnan等，2003，PhysicalstabilityofproteinsinaqueoussoIution:mechanismanddrivingforcesinnonnativeproteinaggregation,PharmRes,20:1325-36)。通过影响溶液中蛋白质的构象和胶状稳定性，pH可显著调节它们的聚集速度(Chi,Krishnan等,2003,Physicalstabilityof`proteinsinaqueoussolution:mechanismanddrivingforcesinnonnativeproteinaggregation,PharmRes,20:1325-36)。另外，脱酰胺速度强烈依赖于pH(Manning，Patel等，1989，Stabilityofproteinpharmaceuticals，PharmRes,6:903-18)。对于给定蛋白质的物理和化学稳定性可有不同的最佳pH值(Kolvenbach,Narhi等，1997，Granulocyte-co1nystimulatingfactormaintainsathermallystable,compact,partiallyfoldedstructureatpH2，JPeptRes,50:310-8)o例如，物理稳定性在脱酰胺快得不可接受的pH下可能是最佳的(Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes，13:243-9)。在这种情况下，开发使这些反应的速度最小化的冻干制剂可提供可行的策略，以获得稳定的产品。考察预冻干溶液PH对治疗性蛋白质在冻干和以干燥制剂存储期间稳定性的影响的较少公开的研究表明了该参数的重要性(Prestrelski，Pikal等，1995，Optimizationoflyophilizationconditionsforrecombinanthumaninterleukin_2bydried-stateconformationalanalysisusingFourier-transforminfraredspectroscopy,PharmRes,12:1250-9;Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes,13:243-9;Katayama，Kirchhoff等，2004，RetrospectivestatisticalanalysisoflyophilizedproteinformulationsofprogenipoietinusingPLS:determinationofthecriticalparametersforlong-termstoragestability，JPharmSci，93:2609-23)。这些研究表明难以鉴定赋予研究的蛋白质冻干和存储期间足够的物理和化学稳定性的预冻干溶液pH。但是，如果足够量的稳定赋形剂包括在制剂中，蛋白质的降解可被最小化。例如，当配制重组人白介素-1-受体拮抗剂(rhlL-lra)然后在包含亚最佳蔗糖以小于0.3的蔗糖/蛋白质的质量比和小于6.5的pH的溶液中冻干时，冻干之后在存储和重构期间出现严重的蛋白质聚集(Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes,13:243-9)。尽管在从大于6的pH溶液冻干之后蛋白质聚集被最小化，但是以不可接受的高速度发生了脱酰胺。从包含大于0.3的蔗糖/蛋白质质量比的蔗糖量、PH6.5的溶液冻干之后，可抑制两种去稳定化途径。在另一实例中，在pH7下冷冻干燥期间，白介素-2(IL-2)具有显著更大的结构扰动，其比从pH5的溶液冻干的样品在存储和再水合之后产生更高水平的聚集(Prestrelski,Pikal等，1995，Optimizationoflyophilizationconditionsforrecombinanthumaninterleukin_2bydried-stateconformationalanalysisusingFourier-transforminfraredspectroscopy,PharmRes,12:1250-9)。向pH7的预冻干溶液制剂添加蔗糖提高冻干之后存储期间IL-2的稳定性。最近，为炭疽rPA采用该预配制方法，以产生用于鼻施用的干燥粉末疫苗候选物(Jiang,Joshi等,2006,Anthraxvaccinepowderformulationsfornasalmucosaldelivery,JPharmSci,95:80-96)。在该情况下,为溶液中的rPA确立最优化pH和赋形剂稳定剂，然后冻干。因为海藻糖是确定用于使可溶性rPA对热应力稳定的赋形剂之一，就总量的rPA而言，与其中rPA快速消失的液体样品相比，有证据表明在40°C下干燥的含海藻糖的疫苗稳定性至少30天。在使用气体驱动注入设备获得表皮递送的干燥粉末组合物的尝试中，发现铝吸附的肝炎B疫苗(HBsAg)在存在甘露醇、甘氨酸和葡聚糖(不大于总赋形剂的~6%w/v)的混合物的情况下的快速冷冻产生了这样的疫苗，其在快速冷冻(喷雾冷冻干燥)之后保持颗粒大小和小鼠中相对免疫原性，所述快速冷冻涉及将喷雾疫苗注入液氮然后干燥(Maa,Zhao等，2003，Stabilizationofalum-adjuvantedvaccinedrypowderformulations:mechanismandapplication,JPharmSci，92:319-32)。尽管通常在加工之后冻干的疫苗聚集并且免疫原性最小，但是未确定在热应力条件下喷雾冷冻干燥疫苗的行为。重构之后，降低的免疫原性与铝颗粒聚集相关。[0012]最近，Roser等已经提出将防止招颗粒聚集的冻干方法。Roser等的美国专利号6，890，512公开了通过向氢氧化铝颗粒悬液添加超过15%(w/v)的海藻糖防止悬液中颗粒脱水和再水合期间显著聚集的方法。海藻糖，a-D-吡喃葡萄糖基-a-D-吡喃葡萄糖苷，是负责避免植物细胞干燥的天然存在的二糖。海藻糖已经显示通过形成固定蛋白质结构的糖玻璃在干燥期间防止蛋白质的变性。但是，Roser等，尽管公开了防止显著的颗粒聚集，但未公开颗粒悬液的冷冻速度或对于控制和保持预冻干颗粒大小和在海藻糖存在下包含疫苗的铝盐中蛋白质结构关键的其他因素的重要性。保持颗粒大小是控制蛋白质免疫原吸附至铝颗粒表面的程度的关键参数，并且除了海藻糖或其他玻璃覆盖赋形剂的含量，在冻干循环期间其还受数个因素影响。这些因素影响免疫原性和保护性免疫应答的产生。[0013]铝盐佐剂提供了提高蛋白质或肽亚单位疫苗的免疫原性的深入研究的手段。但是，已经开发了各种增强疫苗的研究性制剂，作为铝盐佐剂更有力的备选，但是目前在FDA-许可的人疫苗中不可用。设计来提高免疫应答的制剂包括基于下述的各种组合物:油包水乳剂、水包油乳剂、自装配大结构、细胞因子、皂苷、toll样受体激动剂(TLR-4、TLR-5和TLR-9)、免疫刺激双链RNA种类、未甲基化的DNA寡核苷酸以及聚合微粒和纳米结构。这些组合物中的许多涉及改善注入的疫苗的免疫原性，并且可应用一些变型以改变用于鼻内或口服接种的递送路径。作为可用于提高疫苗免疫原性的一类免疫刺激分子的例子，可使用细菌DNA，而不是脊椎动物DNA，因为激活淋巴细胞的直接免疫刺激作用。这是由于未甲基化的CpG二核苷酸以期望的频率出现在细菌DNA中，但是在脊椎动物DNA中不足并且被甲基化(Krieg等，1995)。也可通过在具体的序列背景下添加包含未甲基化的CpG二核苷酸的合成寡脱氧核苷酸(ODN)激发活化。CpGDNA诱导几乎所有(>95%)B细胞的增殖并且增加免疫球蛋白(Ig)分泌。通过CpGDNA的这种B细胞活化是非T细胞依赖性的和非抗原特异性的。但是，通过低浓度的CpGDNA的B细胞活化与通过B细胞抗原受体输送的信号对于B细胞增殖和Ig分泌二者具有强的协同作用(Krieg等，1995)。通过B细胞抗原受体和通过CpGDNA激发的B细胞信号传导途径之间这种强的协同作用促进抗原特异性免疫应答。除了其对B细胞的直接作用，CpGDNA也直接活化单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，以分泌各种细胞因子，包括高水平的IL-12(Klinman等，1996；Halpern等，1996；Cowdery等，1996)。这些细胞因子刺激天然杀伤(NK)细胞分泌Y-干扰素(IFN-.y.-)并且具有增加的溶解活性(Klinman等，1996,如上；Cowdery等，1996,如上；Yamamoto等，1992；Ballas等，1996)。总体上，CpGDNA诱导受IL-12和IFN-y控制的Thl样模式的细胞因子生产，较少分泌Th2细胞因子(Klinman等，1996)。其他分子刺激toll样受体。一个例子是鞭毛蛋白——包括许多细菌鞭毛的蛋白质亚单位。鞭毛蛋白是TLR-5配体并且在这种结合后激发抗原呈递细胞的至少一种生物学功能。鞭毛出现在包括下列属的成员的杆菌和螺旋形细菌的表面:埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、变形杆菌(Proteus)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽抱杆菌(Bacillus)、弯曲杆菌(Campylobacter)、弧菌(Vibrio)、螺旋体(Treponema)、军团菌(Legionella)、梭菌(Clostridia)和柄杆菌(Caulobacter)。鞭毛蛋白的保守区对于TLR5结合是重要的，而多态中心区可缺失而不影响与TLR5结合。本领域可利用来自许多细菌的鞭毛蛋白序列，比如Genbank获取号D13689、YP.sub.—275549、YP.sub.—275550、AAU18718、AAU18717、ZP.sub.—00743095、EA052626、YP.sub.—315348、AAT28337、AAT28336、AAT28335、AAT28334、AAT28333、AAZ36356、AAZ33167、AAZ94424、AAZ91670、NP.sub.—414908、BAD18052和BAD18051。作为纯化的佐剂免疫刺激剂的第三个例子，非毒性的化学合成或酶修饰的革兰氏阴性菌脂多糖衍生物是强有力的佐剂并且通过TLR-4结合和活化刺激淋巴细胞而起作用。例如，单磷酰脂A(MPL)是脂多糖的脂质A组分的衍生物并且是促炎细胞因子的强有力活化剂。尽管天然脂质A和其母体LPS具有强的发热性质并且在人中诱导发热应答(Greisman和Homick,JImmunol,109:1210-1215(1972);Greisman和Homick,JInfectDis,128:257-263(1973);Abemathy和Spink,JClinInvest,37:219-225(1958);Rietschel等，如上;以及Raetz,如上(1993))，但MPL和其化学合成的类似物没有毒性但是诱导一系列宿主促炎细胞因子，包括IL-1、IL-6和TNF-a。[0014]另外，为了提高对吸附至铝盐的亚单位的免疫应答，可能需要辅佐剂以便在人中在一个或两个剂量之后产生有效的抗体应答。最近几年，许多与铝盐相容的佐剂化合物已经作为佐剂被评估。这些佐剂主要包括单磷酰脂A(MPL)和QS-21以及CpG序列。人研究中炭疽疫苗最近的数据表明，就总抗-rPA抗体和炭疽毒素中和抗体而言，在非人灵长类和人类中通过添加CpG7909至佐剂制剂，AlOH吸附的疫苗AVA可被显著增强，尽管没有描述含CpG疫苗的长期热稳定性的数据(Klinman,2006，CpGoligonucleotidesaccelerateandboosttheimmuneresponseelicitedbyAVA,thelicensedanthraxvaccine,ExpertRevVaccines,5:365-9)。MPL和QS-21也已经与招盐一起使用以及在GlaxoSmithKlineBiologies开发的专利油乳剂制剂中使用。在人和动物模型中，QS-21已经在AlOH疫苗中评估，良好显示耐受性和全身性安全性。认为QS-21通过离子和疏水相互作用结合铝盐，以及其一些部分以微团形式保持在溶液中(含水疫苗中)。QS-21是从树皮纯化的皂苷，具有诱导抗体和细胞介导的免疫二者的广谱佐剂作用。虽然不了解机制，但结合人疫苗已经评估了有效的剂量水平。已经在临床研究中评估了QS-21与铝并且已经研究了与抗原配制的QS-21的独立安全性研究。QS-21已经与在注射部位(其溶解)的刺痛(stinging)相关联，非常少的证据表明全身性副作用(Waite,Jacobson等，2001,Threedouble-blind,randomizedtrialsevaluatingthesafetyandtoleranceofdifferentformulationsofthesaponinadjuvantQS-21,Vaccine,19:3957-67)。人中数个研究已经显示QS-21提高了对吸附至铝的抗原的应答。这些包括在下述中的数个试验:疟疾疫苗候选物(Nardin,Oliveira等，2000，SyntheticmalariapeptidevaccineelicitshighlevelsofantibodiesinvaccineesofdefinedHLAgenotypes,JInfectDis,182:1486-96;Kashala,Amador等，2002，Safety,tolerabilityandimmunogenicityofnewformulationsofthe恶性痕原虫malariapeptidevaccineSPf66combinedwiththeimmunologicaladjuvantQS-21,Vaccine,20:2263-77)>HIVgpl20(Evans,McElrath等，2001，QS_21promotesanadjuvanteffectallowingforreducedantigendoseduringHIV-1envelopesubunitimmunizationinhumans,Vaccine,19:2080-91)和更近的登革热病毒亚单位的恒河猴(Rhesusmacaque)试验，其中QS-21增强了中和滴度和保护(Putnak,Coller等，2005，Anevaluationofdenguetype-2inactivated,recombinantsubunit,andIive-attenuatedvaccinecandidatesintherhesusmacaquemodel,Vaccine,23:4442-52)。已经在长期稳定性研究中较好研究了QS-21的溶液稳定性，并且已经显示佐剂活性QS-21(其实际上由两个异构形式组成)在微酸缓冲液中高度稳定超过4年，而在40°C下小于10天(Kensil和Kammer,1998,QS-21:awater-solubletriterpeneglycosideadjuvant,ExpertOpinInvestigDrugs,7:1475-82)。QS-21存储为干燥粉末并且以该形式稳定性是不确定的。[0015]蓖麻蛋白毒素是蓖麻子(蓖麻)产生的64kDa蛋白质(DoanLG.Ricinimechanismoftoxicity,clinicalmanifestations,andvaccinedevelopment.Areview.JournalofToxicology-ClinicalToxicology2004;42(2):201-8;AudiJ,BelsonM,PatelM,SchierJ，OsterlohJ.Ricinpoisoning:acomprehensivereview.JAMA2005;294(18):2342-51)。全毒素由通过二硫键连接的两个多肽链(A和B)组成。A链(RTA)是核糖体失活蛋白(RIP)，其在哺乳动物细胞中抑制蛋白质合成。B链(RTB)是凝集素，其结合细胞表面上的半乳糖残基。一旦被细胞内化，RTA移动进入细胞溶质，在那里，其酶学地使60S核糖体失活(Smallshaw,JE和Vitetta,ES,AlyophilizedformulationofRiVax,arecombinantricinsubunitvaccine,retainsimmunogenicity.Vaccine2010Marchll;28(12):2428-2435)。细胞的细胞质中单个分子的RTA完全抑制蛋白质合成。报道的评估的人中当吸入、注入或摄入时，致死剂量的蓖麻蛋白是l-25i!g/kg(AUdi等)。因为其广泛的可用性和特别的毒性，蓖麻蛋白代表用于生物恐怖的潜在试剂并且所以被AtlantaGA疾控中心(OTC)归类为B类生物威胁。在实验动物中可通过用类毒素或或去糖基化的蓖麻蛋白A链(dgRTA)，或用抗-蓖麻蛋白抗体的被动免疫，预防蓖麻蛋白中毒。但是认为类毒素对于人的常规使用太毒，并且dgRTA的生产困难并且昂贵，而且也保留两种活性位点以及可在人中诱导毒性副作用。仅仅如果蓖麻蛋白剂量相对低并且抗体在暴露后的数小时内施用，用抗-蓖麻蛋白抗体的被动免疫是有效的(HewetsonJF,RiveraVR,CreasiaDA,LemleyPV,RippyMK,PoliMA.Protectionofmicefrominhaledricinbyvaccinationwithricinorbypassivetreatmentwithheterologousantibody.Vaccinel993;ll(7):743-6)0[0016]为了避免这些限制，开发了重组体RTA疫苗(RiVax)(Smallshaw等)。RiVax并入两个点突变，Y80A和V76M，以大大降低或消除其已知的毒性，即核毒性(ribotoxicity)和血管渗漏诱导能力二者。在没有佐剂的情况下，RiVax在小鼠、兔子和人中是非毒性和免疫原性的(SmallshawJE,FiranA,FulmerJR,RubackSL,GhetieV,VitettaES.Anovelrecombinantvaccinewhichprotectsmiceagainstricinintoxication.Vaccine2002;20(27-28):3422-7)。这种模型已经显示产生积极的结果而没有其他疫苗模型涉及的太多毒性。[0017]目前，蓖麻蛋白被NIAID和疾病控制和预防中心(⑶C)列为B级生物威胁试剂(Rotz,Khan等，2002，Publichealthassessmentofpotentialbiologicalterrorismagents,EmergingInfectiousDiseases,8:225-30.)。疫苗候选物基于抗蓖麻蛋白毒素的重组体亚单位疫苗，所述蓖麻蛋白毒素通过基因失活参与良好表征的分子活性的蓖麻蛋白毒素A链(RTA)中的残基获得。该修饰的分子在小鼠、兔子和人中是免疫原性的，并且诱导中和毒素或参与在每个物种中全身性或粘膜清除毒素的抗体。在天花或炭疽的情况下，在有证据表明爆发之后，可能通过大规模接种、选择性接种或环接种控制恐怖分子引起的流行病(Halloran,Longini等,2002,Containingbioterroristsmallpox,Science,298:1428-32;Kaplan,Craft等,2002,Emergencyresponsetoasmallpoxattack:thecaseformassvaccination,ProcNatlAcadSciUSA,99:10935-40;Bozzette,Boer等，2003，Amodelforasmallpox-vaccinationpolicy,NEnglJMed,348:416-25;Kretzschmar,vandenHof等,2004,Ringvaccinationandsmallpoxcontrol,EmergInfectDis,10:832-41)。另一方面，因为该试剂不能复制，所以抗暴露于生物毒素的生物恐怖分子的接种很可能用于选择的人群，比如军队或第一响应者，而不是大规模接种。可在大肠杆菌和其他重组体宿主中生产蓖麻蛋白的分离的A和B亚单位。B链也是疫苗中内含物的候选物，但认为比A链具有更少的免疫原性和更弱的保护性(Maddaloni，Cooke等，2004，Immunologicalcharacteristicsassociatedwiththeprotectiveefficacyofantibodiestoricin，JournalofImmunology，172:6221-8)。尽管蓖麻蛋白A链的毒性比天然蓖麻蛋白少至少1000倍，但是当用作疫苗时其仍保持可导致毒性的酶活性(Thorpe，Detre等，1985，Modificationofthecarbohydrateinricinwithmetaperiodate-cyanoborohydridemixtures.Effectsontoxicityandinvivodistribution,EuropeanJournalofBiochemistry，147:197-206.)。蓖麻蛋白A链中数个关键的氨基酸残基Y80、Y123、E177、R180、N209和W211构成其酶活性位点(Olson,1997,RicinA-chainstructuraldeterminantforbindingsubstrateanalogues:amoleculardynamicssimulationanalysis,Proteins,27:80-95.;LebedaandOlson,1999,Predictionofaconserved,neutralizingepitopeinribosome-1nactivatingproteins,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,24:19-26)。这些氨基酸残基的一些突变已经产生了具有可忽略不计的毒性的菌麻蛋白A链，如通过抑制蛋白质合成测定的(Kim和Robertus，1992，AnalysisofseveralkeyactivesiteresiduesofricinAchainbymutagenesisandX-raycrystallography,ProteinEngineering，5:775-9.)。也已经鉴定了参与RTA结合内皮细胞的另外位点和残基，其出现在JMh并且不需要毒素进入宿主细胞(Baluna和Vitetta，1999，Aninvivomodeltostudyimmunotoxin-1nducedvascularleakinhumantissue,JImmunother，22:41-7;Baluna，Coleman等，2000，TheeffectofamonoclonalantibodycoupledtoricinAchain-derivedpeptidesonendothelialcellsinvitro:1nsightsintotoxin-mediatedvasculardamage,ExpCelIRes，258:417-24;Smallshaw，Ghetie等，2003，Geneticengineeringofanimmunotoxintoeliminatepulmonaryvascularleakinmice,NatureBiotechnology，21:387-91)。RTA上的内皮结合位点涉及对分离的HUVEC细胞的损伤和诱导血管渗漏综合症(VLS)，其已经在使用包含RTA的免疫毒素中确定为剂量限制毒性(Smallshaw，Ghetie等，2003，Geneticengineeringofanimmunotoxintoeliminatepulmonaryvascularleakinmice,NatureBiotechnology，21:387-91)。参与肺部血管渗漏、SCID小鼠的人皮肤异源移植物中血管渗漏和HUVEC细胞的RTA部分显示出包括氨基酸残基L74、D75和V76(Baluna，Rizo等，1999，Evidenceforastructuralmotifintoxinsandinterleukin-2thatmayberesponsibleforbindingtoendothelialcellsand启动vascularleaksyndrome,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，96:3957-62.)。所以，已经构建了考虑那些毒性位点的A链疫苗并且其包括蓖麻蛋白A链的双突变。酶位点中酪氨酸80突变为丙氨酸，血管渗漏位点中缬氨酸76突变为甲硫氨酸，以使对内皮细胞损伤的任何可能最小化。基于晶体结构数据现在已知该蛋白质的结构与天然蓖麻蛋白A链(RTA)相同，表明分子中包含的点突变不破坏任何可能的三级结构(或可能的构象依赖性表位)。当在没有佐剂的情况下肌肉内(1.m.)施用至小鼠时，突变体A链诱发识别蓖麻蛋白的抗体，并且由IOxLD5。剂量的蓖麻蛋白保护动物(Smallshaw，Firan等，2002，Anovelrecombinantvaccinewhichprotectsmiceagainstricinintoxication，Vaccine，20:3422-7)。[0018]天然PA是AVA(吸附的炭疽疫苗)中的主要免疫原和作为单组分疫苗用于暴露前和暴露后预防的保护性免疫的目标。基于天然PA在无毒炭疽芽孢杆菌中的表达，已经开发了数个铝吸附的重组体PA疫苗(二代)并且在最近的I期试验中测试，并且已经显示与AVA关系是免疫原性的(Gorse,Keitel等，2006，Immunogenicityandtoleranceofascendingdosesofarecombinantprotectiveantigen(rPA102)anthraxvaccine:arandomized,double-blinded,controlled,multicentertrial,Vaccine,24:5950-9;Campbell,Clement等,2007,Safety,reactogenicityandimmunogenicityofarecombinantprotectiveantigenanthraxvaccinegiventohealthyadults,HumVaccin，3:205-11)。在兔子气溶胶孢子挑战研究(总的ELISA-反应性抗体和毒素中和活性(TNA))中已经良好表征了免疫的主要关系(Little,Ivins等，2004，Definingaserologicalcorrelateofprotectioninrabbitsforarecombinantanthraxvaccine,Vaccine,22:422-30)。熟知炭疽毒素是由炭疽芽孢杆菌表达的一组3个质粒编码的蛋白质构成的三重毒素(tripartitetoxin):保护性抗原(PA;83kDa)、致死因子(LF;90kDa)和浮肿因子(EF;89kDa)。LF和EF从胞外表面通过七聚物PA转移进入细胞质，其中它们受哺乳动物细胞的酶修饰分子靶标的作用。LF是金属蛋白酶，其切割并且活化数个促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK激酶)，EF是钙调节蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其引起细胞内的cAMP水平快速增加。(YoungCollier,2007,Anthraxtoxin:receptorbinding,internalization,poreformation,andtranslocation,AnnuRevBiochem,76:243-65)。这些蛋白质单个是无毒的,但是当一起施用时是强的毒素，引起细胞快速死亡。[0019]AVA疫苗仍是炭疽的唯一疫苗并且改善它的主要动力基于数个认识到的缺点:需要6-剂量方案以便实现牢固免疫和认识到其不安全并且是反应原性的，并且AVA的制备性加工是粗糙的和缺少一致性。尽管PA是AVA中的主要免疫原，不清楚可能在一些批次中存在的少量的LF和EF是否有利于疫苗有效性。炭疽rPA免疫原性丧失的主要因素包括佐剂表面上的加速脱酰胺。这可通过存在少量的磷酸盐以降低表面PH阻止。存在正在开发的其他具体的rPA疫苗候选物。AVA或基于PA的疫苗通常诱导毒素中和抗体(Pitt,Little等,1999,Invitroc`orrelateofimmunityinananimalmodelofinhalationalanthrax,JApplMicrobiol,87:304;Reuveny,White等,2001,Searchforcorrelatesofprotectiveimmunityconferredbyanthraxvaccine,InfectImmun,69:2888-93;Little,Ivins等,2004,Definingaserologicalcorrelateofprotectioninrabbitsforarecombinantanthraxvaccine,Vaccine,22:422-30)。基于PA的疫苗的保护性作用的机制可归因于抗-PA抗体，其保护宿主避免中毒并且因此允许免疫系统处理生物，尽管PA疫苗未设计为限制感染的发作。[0020]目前有72种疫苗被美国FDA(美国食品和药品管理局)批准(US.FDA中批准用于免疫和分配的疫苗的完整目录6/3/2010)。这72种疫苗中，36%包含铝佐剂和30%是冷冻干燥的。72种疫苗中没有一种包含铝佐剂和冷冻干燥组分二者。[0021]本领域需要开发生产热稳定性、免疫学活性冷冻干燥疫苗制剂的方法，其结合重组抗原以促进快速启动保护性免疫。【
发明内容】[0022]本公开提供生产包含热稳定性的冷冻干燥疫苗佐剂的制剂的方法。本公开进一步提供生产热稳定性的冷冻干燥疫苗的制剂的方法，其中疫苗抗原是重组抗原。[0023]在一种实施方式中，本公开提供制备结合免疫学活性佐剂的干燥疫苗组合物的方法，该方法包括:组合至少一种铝盐佐剂、包含至少一种挥发性盐的至少一种缓冲系统、至少一种玻璃形成剂、至少一种免疫活性辅佐剂和至少一种抗原，以形成液体疫苗制剂；冷冻该液体疫苗制剂，以形成冷冻的疫苗制剂；和冻干冷冻的疫苗制剂，以形成干燥疫苗组合物，其中该组合物能够在对象中诱发免疫应答。对象产生的免疫应答可以是体液免疫和/或对抗原特异性的细胞介导的免疫。一个方面，至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。另一方面，铝盐佐剂是氢氧化铝。在进一步的方面中，至少一种缓冲系统选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐缓冲系统。在仍另一方面中，至少一种缓冲系统选自醋酸铵、甲酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、三乙基醋酸铵、三乙基甲酸铵、三乙基碳酸铵、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡唳(pyridinal)和甲酸吡唳。在另一方面中，至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、鹿糖、菲可(ficoll)、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精和聚维酮。在进一步的方面中，玻璃形成剂是海藻糖。一方面，冷冻干燥之前，液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约5%至约15%。另一方面，液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约8%至约20%。在另一实施方式中，至少一种免疫学活性辅佐剂被添加至方法步骤。在该方面中，至少一种免疫学活性辅佐剂选自脂质A、脂质A衍生物、单磷酰脂A、单磷酰脂A的化学类似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的类似物、QS-21、纯化的皂苷馏分、ISC0MS、皂苷与甾醇和脂质的组合。在进一步的方面中，辅佐剂化合物是QS-21。在进一步的方面中，冷冻步骤包括下述之一:托盘冷冻、货架冷冻、喷雾冷冻和壳体冷冻(shell-freezing)。在优选的实施方式中，冷冻步骤包括使用预先冷却的托盘启动冷冻步骤。[0024]在另一方面中，抗原选自或衍生自:轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、HlNUH2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、I型猪疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢杆菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、温热病病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤病毒、犬细小病毒、乳头瘤病毒、森林脑炎病毒、牛痕病毒、人鼻病毒种、肠道病毒种、门戈病毒(Mengovirus)、副粘病毒、鸡传染性支气管炎病毒、I型人T细胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、细小病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌、支气管败血波氏杆菌、副百日咳博德特氏囷、流广布鲁氏囷病、羊种布鲁氏囷、猪布鲁氏囷、羊布鲁氏囷、布鲁氏囷种、大肠杆囷、沙门氏菌种、伤寒沙门氏菌、链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌、肺结核、鸟分支杆菌(avium)、卡介菌、麻风分支杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、肠杆菌种、汉氏罗卡利马氏体、溶血巴斯德氏菌、放血败血性巴斯德氏菌、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、嗜血菌种、牛生殖道支原体、肺支原体、支原体种、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肉毒梭菌、白喉棒状杆菌、耶尔森氏菌、立氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、普氏立克次体、恰菲埃里希氏体、嗜吞噬细胞无形体、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、血吸虫、锥体虫、利士曼原虫种、血丝虫、滴虫、肉孢子虫、牛肉绦虫、猪肉绦虫、利士曼原虫、弓形虫、旋毛虫、球虫、柔嫩艾美耳球虫、新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、疟原虫环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥体虫表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白质、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、产气荚膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假单胞菌外毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑和尘螨。[0025]在另一实施方式中，本公开提供了疫苗组合物，包括:至少一种铝盐佐剂；至少一种缓冲剂，其中至少一种缓冲剂包括挥发性盐；至少一种玻璃形成剂；和至少一种抗原，其中该组合物被冻干以形成干燥疫苗组合物和进一步其中干燥疫苗组合物能够在对象中诱发免疫应答。一个方面中，至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。在另一方面中，至少一种缓冲剂选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐。在可选的方面中，至少一种缓冲剂选自醋酸铵、甲酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、三乙基醋酸铵、三乙基甲酸铵、三乙基碳酸铵、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。在仍另一方面中，至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精和聚维酮。在进一步的方面中，抗原选自或衍生自:轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、I型猪疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢杆菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、温热病病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤病毒、犬细小病毒、乳头瘤病毒、森林脑炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒种、肠道病毒种、门戈病毒、副粘病毒、鸡传染性支气管炎病毒、I型人T细胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、细小病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌、支气管败血波氏杆菌、副百日咳博德特氏菌、流产布鲁氏菌病、羊种布鲁氏囷、猪布鲁氏囷、羊布鲁氏囷、布鲁氏囷种、大肠杆囷、沙门氏囷种、伤寒沙门氏囷、链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌、肺结核、鸟分支杆菌、卡介菌、麻风分支杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、肠杆菌种、汉氏罗卡利马氏体、溶血巴斯德氏菌、放血败血性巴斯德氏菌、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、嗜血菌种、牛生殖道支原体、肺支原体、支原体种、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肉毒梭菌、白喉棒状杆菌、耶尔森氏菌、立氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、普氏立克次体、恰菲埃里希氏体、嗜吞噬细胞无形体、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、血吸虫、锥体虫、利士曼原虫种、血丝虫、滴虫、肉孢子虫、牛肉绦虫、猪肉绦虫、利士曼原虫、弓形虫、旋毛虫、球虫、柔嫩艾美耳球虫、新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、疟原虫环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥体虫表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白质、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、产气荚膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假单胞菌外毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑和尘螨。[0026]在可选的实施方式中，疫苗组合物进一步包括至少一种免疫学活性辅佐剂。一个方面中，至少一种免疫学活性辅佐剂选自脂质A、脂质A衍生物、单磷酰脂A、单磷酰脂A的化学类似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的类似物、QS-21、纯化的皂苷馏分、ISCOMS和皂苷与留醇和脂质的组合。[0027]在仍另一实施方式中，本公开提供控制结合佐剂的干燥疫苗组合物中颗粒大小的方法，该方法包括:组合至少一种铝盐佐剂、至少一种缓冲系统、至少一种玻璃形成剂和至少一种抗原，以形成液体疫苗制剂；冷冻液体疫苗制剂以形成冷冻的疫苗制剂；和冻干冷冻的疫苗制剂，以形成干燥疫苗组合物，其中用水性稀释剂稀释干燥疫苗组合物以形成重构的疫苗组合物之后，重构的疫苗组合物的平均颗粒直径小于100微米。在另一方面，至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。在进一步的方面，铝盐佐剂是氢氧化铝。在另一方面，至少一种缓冲系统选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐缓冲系统。在进一步的方面，至少一种缓冲系统选自琥珀酸盐和磷酸盐缓冲系统。一个方面，至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精、聚维酮和钾盐。在具体的方面，玻璃形成剂是海藻糖。在进一步具体的方面，在液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约5%至约20%。在另一方面，液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约7%至约15%。一个方面，冷冻步骤包括下述之一:托盘冷冻、货架冷冻、喷雾冷冻和壳体冷冻。在另一方面，冷冻步骤包括喷雾冷冻。在进一步的方面，重构的疫苗组合物的平均颗粒直径小于6微米。一个方面，选择步骤中玻璃形成剂的浓度随着冷却步骤中将液体疫苗制剂冷却成冷冻状态的速度提高而下降。[0028]在可选的实施方式中，本公开提供了干燥疫苗组合物中使用的佐剂组合物，该佐剂组合物包括:铝盐佐剂、玻璃形成剂和缓冲盐。一个方面，铝盐佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝。在另一方面，玻璃形成剂是海藻糖。在进一步的方面，缓冲盐选自下述一种或多种:琥珀酸钠、琥珀酸钾、磷酸钠和磷酸钾。[0029]在仍另一实施方式中，本公开提供了具有有限平均颗粒直径的结合佐剂的干燥疫苗组合物，该组合物通过包括下述的方法生产:在缓冲系统中掺混至少一种佐剂、至少一种玻璃形成剂和至少一种抗原，以形成液体疫苗制剂；快速冷却液体疫苗制剂至冷冻状态以形成冷冻的疫苗制剂；和冻干冷冻的疫苗制剂，以形成干燥疫苗组合物，其中用水性稀释剂稀释干燥疫苗组合物以形成重构的疫苗组合物之后，重构的疫苗组合物的平均颗粒直径小于100微米。[0030]在另一实施方式中，本公开提供控制冷冻疫苗制剂中颗粒大小的方法，该方法包括:组合至少一种铝盐佐剂、至少一种缓冲系统、至少一种玻璃形成剂和至少一种抗原，以形成液体疫苗制剂；冷冻液体疫苗制剂以形成冷冻的疫苗制剂；和冻干冷冻的疫苗制剂，以形成干燥疫苗组合物，其中融化和用水性稀释剂稀释干燥疫苗组合物以形成重构的疫苗组合物之后，重构的疫苗组合物的平均颗粒直径小于100微米。一个方面，至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。在另一方面，铝盐佐剂是氢氧化铝。在进一步的方面，至少一种缓冲系统选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐缓冲系统。一个方面，至少一种缓冲系统选自琥珀酸盐和磷酸盐缓冲系统。在另一方面，至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精、聚维酮和钾盐。在具体的方面，玻璃形成剂是海藻糖。在进一步具体的方面，在液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约5%至约20%。在另一具体的方面，在液体疫苗制剂中存在的玻璃形成剂海藻糖的重量比体积浓度为从约7%至约15%。一个方面，冷冻步骤包括下述之一:托盘冷冻、货架冷冻、喷雾冷冻和壳体冷冻。在另一方面，冷冻步骤包括喷雾冷冻。在进一步的方面中，重构的疫苗组合物的平均颗粒直径小于6微米。[0031]在另一方面，液体疫苗制剂被制备为高渗混合物，然后冷冻，其中当用水性稀释剂稀释干燥疫苗组合物以形成重构的疫苗组合物时，重构的疫苗组合物的张度被调整至等渗水平。在仍另一方面，制备制剂，其中通过冻干去除挥发性盐，重构后产生这样的疫苗制剂，其张度相对于起始制剂下降，同时保持相同浓度的抗原和佐剂。【专利附图】【附图说明】[0032]图1描绘基于％表面积的冷冻干燥和重构之前和之后颗粒大小分布。[0033]图2描绘冷冻干燥之前和之后基于％表面积的组氨酸制剂的颗粒大小分布。[0034]图3描绘冷冻干燥之前和之后基于％表面积的精氨酸制剂的颗粒大小分布。[0035]图4描绘冷冻干燥之前和之后基于％表面积的甘氨酸制剂的颗粒大小分布。[0036]图5显示pH6的IOmM组氨酸缓冲液中Alhydrogel颗粒随着时间的沉降。(a)没有沉降;(b)沉降30分钟之后；和(C)沉降3小时之后。[0037]图6描绘在使颗粒在用-10°C预冷却的货架冷冻干燥之前沉降不同时间量之后基于表面积的颗粒大小分布。样品在PH6的IOmM组氨酸缓冲液中包含lmg/mLAl。[0038]图7描绘在使颗粒在用-10°C预冷却的货架冷冻干燥之前沉降不同时间量之后基于表面积的颗粒大小分布。样品在pH6的IOmM组氨酸缓冲液中包含lmg/mLAl和8w/v%海藻糖。[0039]图8显示有或没有海藻糖、同时改变冷冻干燥之前沉降时间的在IOmM组氨酸中lmg/mLAl的制剂之间平均颗粒大小的比较。[0040]图9说明冻干期间的步骤，其中处理包含在3ml玻璃小瓶中的Iml疫苗样品，用FTS系统LyoStar冷冻干燥系统在初次和二次冷冻之前改变冷冻速度。在冷冻干燥后，用氮气吹扫小瓶，密封并且存储在_80°C，然后进一步分析。[0041]图10显示在4个条件和增加海藻糖的浓度下在冷冻干燥循环之前和之后的颗粒大小分布。初次和二次干燥之前更快速度的冷冻和更高浓度的海藻糖产生冷冻干燥之后非常类似于初始颗粒分布的颗粒大小分布。从最慢至最快为:室温托盘A(A)、-10°C预先冷却的托盘(B)、液氮浸溃(C)、液氮喷雾冷冻干燥(D)。制剂由lmg/mlAlhydrogel>pH6.0的IOmM组氨酸以及0-12%海藻糖组成。[0042]图11显示冷冻干燥之后颗粒大小分布的室温冷冻干燥的依赖性。如图10中进行室温冷冻干燥。在托盘上室温温育然后是冷冻循环，颗粒大小分布从〈I微米移动至>20微米，并且8%的海藻糖的存在降低颗粒大小移动程度。[0043]图12显示用50%w/v甘油溶解在pH6.0的IOmM组氨酸，144mMNaCl中的RTA的SDSPAGE,与透析、浓缩和在_20°C存储的RTA比较。(上图-银染色、下图-考马斯染色。相同组的样品用于进行两种研究)。[0044]图13显示RTA吸附至Alhydrogel然后冻干。改变RTA的浓度，保持Al的浓度为lmg/mL。至少95%的RTA蛋白质被吸附至pH6.0的Alhydrogel的表面。[0045]图14显示接种吸附至Alhydrogel的液体RTA疫苗的结果，其中各种剂量的RTA用于接种8个SwissWebster小鼠的组。当疫苗在40°C存储I个月然后接种时,暴露于蓖麻蛋白毒素的动物没有一个存活并且观察到显著的免疫原性丧失。在4°C存储I个月的疫苗以最高剂量诱导完全保护和以更低的剂量在小鼠中诱导部分保护。[0046]图15显示每个疫苗一次注入后(3周)和两次注入后(5周)，没有温育、在40°C下温育I周和I个月之后rRTA的抗体滴度。平均滴度显示为仅仅对应那些小鼠标准偏差的小鼠的平均。[0047]图16显示来自免疫小鼠的终点滴度数据。终点滴度=倒数(reciprocal)终点抗-RTA滴度。中和IC50滴度=保护孔中50%的细胞避免这里未显示的蓖麻蛋白细胞毒性所需的血清的稀释度，但是假(sham)免疫小鼠(1-10号(5号除外)没有一个在它们的血清中具有任何抗-RTA滴度。也测试I号假免疫小鼠血清的体外中和能力，并且其不保护细胞。[0048]图17显示从用冻干之前吸附液体疫苗第二次接种SwissWebster小鼠后的各自血清获得的总滴度以及中和滴度。[0049]发明详述[0050]定义[0051]脱水海藻糖(高纯度、低内毒素)获得自FerroPfanstiehl(Cleveland,0H)。精氨酸、甘氨酸、组氨酸、柠檬酸钠和醋酸铵购买自SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)。通过E.M.SergeantPulp&ChemicalCo,Inc(Clifton,NJ)购买由BrenntagBiosector制造的Alhydrogel?2.0%(氧氧化招佐剂)。3_ml和5_ml冻干瓶和盖获得自WestPharmaceuticalServices。[0052]样品制备[0053]制备包含不同浓度海藻糖(0_15w/v%)的水溶液。除非另外指出，在pH6并且包含lmg/mlAl(以Alhydrogel?的形式)的IOmM缓冲液(如所示)中制备样品。将样品处理为Iml等分试样。除了佐剂，配制之前所有水溶液经过0.2ym过滤器。[0054]表面电荷^电位[0055]测量各制剂中氢氧化铝(Alhydrogel)悬液的4电位，以探究静电相互作用。然后制备没有抗原的制剂，以确定在冷冻干燥期间颗粒是否发生聚集。将浓度为ImgAl/mL的Alhydrogel在pH6的IOmM缓冲液(甘氨酸、精氨酸、组氨酸、醋酸铵、柠檬酸钠)中与范围为0-12w/v%的稳定剂海藻糖结合。为了确定冷冻速度是否影响颗粒聚集，使用四种冷冻方法冷冻干燥制剂:室温托盘冷冻、_10°C预冷却的托盘冷冻、液氮浸溃冷冻和液氮喷雾冷冻，然后是初次和二次干燥。也添加蛋白质至制剂以观察其在冷冻干燥和重构之后对颗粒大小的影响。范围为0.04-2000um的颗粒大小分布由每种制剂的激光衍射表征。[0056]冻干[0057]FTS系统Lyostar冷冻干燥机用于样品的冷冻干燥。如下以从最慢至最快的各种冷却速度冷冻样品:(i)将在室温下准备的瓶放置在冷冻干燥机托盘上并且在室温保持I小时然后启动(ii)通过将样品放置在冷冻干燥机中冷冻，在-10°C的货架温度下平衡lhr，然后以0.5°C/min的速度冷却货架至-40°C(“_10预先冷却的托盘-冷冻”)；(ii)通过将瓶底浸入液体N2冷冻(LN2浸溃冷冻干燥)；和(iii)通过滴~20uI小滴入液体N2喷雾冷冻(LN2喷雾冷冻干燥)。在3-ml冻干瓶中处理托盘冷冻和液体N2浸入的样品，同时在5-ml冻干瓶中处理喷雾冷冻的样品。包含使用液体N2冷冻的样品的瓶被快速转移至放置在冷冻干燥机货架上的预冷却至-40V的冷冻干燥机。在冷冻干燥机中将样品间隔开，从而它们每个彼此分开并且被一排含水的瓶子环绕。[0058]通过将货架温度设置至_20°C并且施加60mTorr的真空20小时实现样品的初次干燥，并且随后进行二次干燥，其中货架温度以0.2V/min从-20°C攀升至(TC，以0.5°C/min攀升至30°C并且最终在30°C保持5小时。在真空下密封样品并且用DI水重构，然后分析。冷冻和干燥循环的变化描绘在(图10)中。[0059]颗粒大小分布[0060]使用Beckman-CoulterLS230激光衍射颗粒大小分析仪测量颗粒大小分布(PSD)。每个测试需要3个Iml样品，并且每个制剂的每个测试重复3次。报告的PSD是表面积加权的并且是3次测试的综合。实施例[0061]1.不同颗粒沉降时间的-10°C预冷却的托盘冷冻干燥[0062]在4°C下，结合pH6.0的IOmM组氨酸缓冲液,来自Alhydrogel的lmg/mLAl和O、4、8或12w/v%的海藻糖并且翻转旋转30分钟。将ImL的溶液放置在每个3mL玻璃冷冻干燥瓶中。将制剂放置在冷冻干燥器中-`1o°c预冷却的货架上并且根据下表冷冻干燥。冷冻干燥之后，将腔回填干燥氮气并且将瓶密封。[0063]表1[0064]【权利要求】1.一种制备结合免疫学活性佐剂的干燥疫苗组合物的方法，所述方法包括:(a)提供至少一种铝盐佐剂、包含至少一种挥发性盐的至少一种缓冲系统、至少一种玻璃形成剂和至少一种抗原；(b)将(a)组合在一起，形成液体疫苗制剂；(C)冷冻(b)中的所述液体疫苗制剂，形成冷冻的疫苗制剂；和(d)冻干(C)中所述冷冻的疫苗制剂，形成干燥疫苗组合物，进一步其中所述干燥疫苗组合物能够在对象中诱发免疫应答。2.权利要求1所述的方法，其中所述对象产生的所述免疫应答可以是体液免疫和/或对抗原特异的细胞介导的免疫。3.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸招。4.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缓冲系统选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐。5.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种缓冲系统选自醋酸铵、甲酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、三乙基醋酸铵、三乙基甲酸铵、三乙基碳酸铵、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。6.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精和聚维酮。7.权利要求1所述的方法，其`中所述至少一种玻璃形成剂是海藻糖并且在冷冻干燥之前在所述液体疫苗制剂中存在的所述海藻糖的重量比体积浓度为从约5%至约15%。8.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种玻璃形成剂是海藻糖并且在所述液体疫苗制剂中所述海藻糖的重量比体积浓度为从约8%至约20%。9.权利要求1所述的方法，其中至少一种免疫学活性辅佐剂在步骤(a)中添加。10.权利要求9所述的方法，其中所述至少一种免疫学活性辅佐剂选自脂质A、脂质A衍生物、单磷酰脂A、单磷酰脂A的化学类似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的类似物、QS-21、纯化的皂苷馏分、ISCOMS和皂苷与甾醇和脂质的组合。11.权利要求1所述的方法，其中所述冷冻步骤包括下述之一:托盘冷冻、货架冷冻、喷雾冷冻和壳体冷冻。12.权利要求1所述的方法，其中所述冷冻步骤包括使用预先冷却的托盘启动所述冷冻步骤。13.权利要求1所述的方法，其中所述抗原选自或衍生自:轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、I型猪疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢杆菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、温热病病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤病毒、犬细小病毒、乳头瘤病毒、森林脑炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒种、肠道病毒种、门戈病毒、副粘病毒、鸡传染性支气管炎病毒、I型人T细胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、细小病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌、支气管败血波氏杆菌、副百日咳博德特氏囷、流广布鲁氏囷病、羊种布鲁氏囷、猪布鲁氏囷、羊布鲁氏囷、布鲁氏囷种、大肠杆囷、沙门氏菌种、伤寒沙门氏菌、链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌、肺结核、鸟分支杆菌、卡介菌、麻风分支杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、肠杆菌种、汉氏罗卡利马氏体、溶血巴斯德氏菌、放血败血性巴斯德氏菌、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、嗜血菌种、牛生殖道支原体、肺支原体、支原体种、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肉毒梭菌、白喉棒状杆菌、耶尔森氏菌、立氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、普氏立克次体、恰菲埃里希氏体、嗜吞噬细胞无形体、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、血吸虫、锥体虫、利士曼原虫种、血丝虫、滴虫、肉孢子虫、牛肉绦虫、猪肉绦虫、利士曼原虫、弓形虫、旋毛虫、球虫、柔嫩艾美耳球虫、新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、疟原虫环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥体虫表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白质、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、产气荚膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假单胞菌外毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑和尘螨。14.权利要求1所述的方法，其中干燥疫苗组合物用水性稀释剂重构以形成重构的疫苗组合物。15.权利要求13所述的方法，其中所述重构的疫苗组合物包含小于100微米的平均颗粒直径。16.权利要求1所述的方法，其中所述液体疫苗制剂首先被制备为高渗混合物，然后冷冻，并且然后在用水性稀释剂稀释所述干燥疫苗组合物之后被调节至等渗水平。17.疫苗组合物，其包括:(a)至少一种铝盐佐剂；(b)至少一种缓冲剂，其中所述至少一种缓冲剂包括挥发性盐；(C)至少一种玻璃形成剂；和(d)至少一种抗原，其中所述组合物被冻干以形成干燥疫苗组合物并且进一步其中所述干燥疫苗组合物能够在对象中诱发免疫应答。18.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述至少一种铝盐佐剂选自氢氧化铝、磷酸招和硫酸招。19.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述至少一种缓冲剂选自醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、硼酸盐、碳酸盐和磷酸盐。20.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述至少一种缓冲剂选自醋酸铵、甲酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、三乙基醋酸铵、三乙基甲酸铵、三乙基碳酸铵、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。21.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述至少一种玻璃形成剂选自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麦芽三糖、乳糖、甘露醇、羟乙基淀粉、甘氨酸、环糊精和聚维酮。22.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述组合物包括至少一种免疫学活性辅佐剂。23.权利要求22所述的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫学活性辅佐剂选自脂质A、脂质A衍生物、单磷酰脂A、单磷酰脂A的化学类似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激动剂、鞭毛蛋白、衍生自革兰氏阴性细菌的鞭毛蛋白、TLR-5激动剂、能够结合TLR-5受体的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的类似物、QS-21、纯化的皂苷馏分、ISCOMS和皂苷与留醇和脂质的组合。24.权利要求17所述的疫苗组合物，其中所述抗原选自或衍生自:轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、HlNl、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、I型猪疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢杆菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、温热病病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤病毒、犬细小病毒、乳头瘤病毒、森林脑炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒种、肠道病毒种、门戈病毒、副粘病毒、鸡传染性支气管炎病毒、I型人T细胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、细小病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌、支气管败血波氏杆菌、副百日咳博德特氏菌、流产布鲁氏菌病、羊种布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、布鲁氏菌种、大肠杆菌、沙门氏菌种、伤寒沙门氏菌、链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌、肺结核、鸟分支杆菌、卡介菌、麻风分支杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、肠杆菌种、汉氏罗卡利马氏体、溶血巴斯德氏菌、放血败血性巴斯德氏菌、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、嗜血菌种、牛生殖道支原体、肺支原体、支原体种、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肉毒梭菌、白喉棒状杆菌、耶尔森氏菌、立氏立克次体、斑疹伤寒立克次体、普氏立克次体、恰菲埃里希氏体、嗜吞噬细胞无形体、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、血吸虫、锥体虫、利士曼原虫种、血丝虫、滴虫、肉孢子虫、牛肉绦虫、猪肉绦虫、利士曼原虫、弓形虫、旋毛虫、球虫、柔嫩艾美耳球虫、新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、疟原虫环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥体虫表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白质、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、`产气荚膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假单胞菌外毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑和尘螨。【文档编号】A61K39/38GK103781491SQ201280035108【公开日】2014年5月7日申请日期:2012年5月17日优先权日:2011年5月17日【发明者】K·哈西特,P·南迪,R·布雷,J·卡彭特,T·伦道夫申请人:索利吉尼克斯公司,科罗拉多大学评议会公司