基于shk的医药组合物以及其制备和使用方法
【专利摘要】本发明揭示具有序列Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys(SEQ?ID?NO：1)的医药组合物。所揭示的组合物可以在SEQ?ID?NO：1的C端包括酸或酰胺，且多肽可以连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体。所述多肽可以可检测的方式加以标记以用于诊断目的。本发明还揭示了制备和使用所述医药化合物的方法。
【专利说明】基于SHK的医药组合物以及其制备和使用方法
[0001]相关申请案的交叉参考
[0002]本申请案主张在2011年6月6日申请的美国临时申请案第61/493，868号及在2012年4月17日申请的美国临时申请案第61/625，578号的优先权，所述两篇申请案均以全文引用的方式并入本文中。
【技术领域】[0003]文中揭示的组合物及方法大体上是关于以ShK为主的医药组合物治疗、预防和/或缓解与其中记忆T细胞发挥作用的疾病和失调(包括自身免疫疾病及代谢失调)有关的症状的用途。
[0004]政府权益的声明
[0005]依据过敏及传染病健康国家研究所(National Institutes of Health NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases)授权R43A1085691 及NIH R01NS48252,美国政府拥有本发明中的权利。
【背景技术】
【发明内容】
[0006]许多免疫相关的人类疾病及代谢失调是由记忆T细胞的作用所引起的。此类免疫相关疾病包括自身免疫疾病，例如多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎以及牛皮癣等。代谢失调的实例包括肥胖、2型糖尿病、高胆固醇血症、冠状动脉病、代谢综合症、代谢综合症X、胰岛素抗性、高脂血症、脂质营养不良、血脂异常、高三酸甘油酯血症、葡萄糖耐受不良以及高血压。
[0007]已知两类记忆T细胞:中枢记忆T细胞(Tcm)和效应记忆T细胞(Tem)。一经活化，Tem细胞向上调节Kvl.3K+离子通道。抗原驱动的Tem细胞增殖对Kvl.3K+离子通道阻断剂敏感(伍尔夫(Wulff)等人，《临床研究杂志(J.Clin.1nvest.)))111:1703-1713，2003)，且最初从加勒比海海葵(Stichodactyla helianthus)分离的多肽ShK可以充当此类阻断剂。通过阻断Kvl.3通道，ShK在皮莫耳浓度下抑制Tem细胞的增殖。
[0008]文中揭示的一个实施例包括一种医药组合物,其包含具有序列Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO:1，其中 Xaa 为 Met 或Nle)的ShK多肽。
[0009]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 的 ShK 多肽。
[0010]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式对磷酸基-Tyi'-AEEA-Ai'g-Sei'-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Ly s-Tyr-Ar g-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 (ShK-186)的 ShK 多妝。
[0011]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式L-半胱氨酰胺、4-膦酰基-L-苯基丙氨酰基-2-[2-(2_氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-L-精氨酰基-L-丝氨酰基_L_半胱氨酰基-L-异売氨酰基-L- α -天冬氨酰基-L-苏氨酰基-L-异売氨酰基-L-脯氨酰基~L_尚氨酰基-L-丝氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-L-苏氨酰基-L-丙氨酰基-L-苯基丙氨酰基-L-谷酰氨酰基-L-半胱氨酰基-L-尚氨酰基-L-组氨酰基-L-丝氨酰基-L-正亮氨酰基-L-离氨酰基-L-酪氨酰基-L-精氨酰基-L-亮氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯基丙氨酰基-L-半胱氨酰基-L-精氨酰基-L-尚氨酰基-L-苏氨酰基-L-半胱氨酰基甘氨酰基-L-苏氨酰基_，环状(5 — 37)，(14 — 30)，(19 — 34)-三(二硫化物)(文中称为ShK-192，CAS登记号1159528-26-3)的ShK多肽，其中所述ShK_192多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，且C端为酸或酰胺。
[0012]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式PpA-Phe-AEEA-Arg-Ser-Cys-1Ie-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 (ShK-198)的 ShK 多妝。
[0013]在另一个实施例中，ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体。在另一个实施例中，C端为酸或酰胺。在另一个实施例中，ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，且C端为酸或酰胺。
[0014]在另一个实施例中，一种或一种以上化学实体连接到ShK多肽的N端。在另一个实施例中，所述化学实体可以通过连接分子或连接基团连接到ShK多肽的N端。在另一个实施例中，所述化学实体是通过氨基乙氧基乙氧基-乙酰基连接子连接到ShK多肽的N端。
[0015]在另一个实施例中，化学实体是选自由以下组成的群组:L-Pmp (OH2)；D-Pmp (OH2) ;D_Pmp (OHEt) ；L-Pmp (Et2) ；D-Pmp (Et2) ；L-Tyr ；L-Tyr (PO3H2) ；L-Phe (p-NH2)；L-Phe (P-CO2H) ；L-天冬氨酸盐；D_天冬氨酸盐；L_谷氨酸盐以及D-谷氨酸盐。
[0016]在另一个实施例中，化学实体/连接子组合是选自由以下组成的群组:AEEAc-L-Pmp (OH2) ;AEEAc-D_Pmp (OH2) ;AEEAc-D_Pmp (OHEt) ;AEEAc-L_Pmp (Et2)；AEEAc-D-Pmp (Et2) ;AEEAc-L-Tyr ;AEEAc-L-Tyr (PO3H2) ;AEEAc-L_Phe (p_NH2)；AEEAc-L-Phe(P-CO2H) ;AEEAc_L-天冬氨酸盐；AEEAc_D-天冬氨酸盐；AEEAc_L-谷氨酸盐以及AEEAc-D-谷氨酸盐。
[0017]在另一个实施例中，所述ShK多肽在医药组合物中以其医药上可接受的盐提供。在另一个实施例中，所述医药上可接受的盐为乙酸盐。在另一个实施例中，所述医药上可接受的盐为乙酸钾或乙酸钠。
[0018]在另一个实施例中，所述医药组合物提供在水性载剂中。
[0019]在另一个实施例中，所述医药组合物的pH介于5与7之间。在另一个实施例中，所述医药组合物的pH为6.0。
[0020]在另一个实施例中，所述医药组合物进一步包含在水性载剂中有效溶解ShK多肽的量的表面活性剂。在另一个实施例中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。在另一个实施例中，所述表面活性剂为0.05w/v%的聚山梨醇酯20。
[0021]在另一个实施例中，所述医药组合物进一步包含IOmM磷酸钠。在另一个实施例中，所述医药组合物进一步包含150mM NaCl。[0022]在另一个实施例中，所述ShK多肽以0.01mg/ml到500mg/ml的量存在。在其它实施例中，所述 ShK 多肽可以 0.01,0.1,0.5,0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、150、200、250、300、350、400、450 或 500mg/ml 的量提供。
[0023]在另一个实施例中，所述ShK多肽是从天然来源获得的。在另一个实施例中，所述ShK多肽是合成的。在另 一个实施例中，所述ShK多肽包括天然与合成ShK多肽的混合物。
[0024]文中描述的实施例还包括以文中所述组合物开始制造的冻干医药组合物。在一个实施例中，所述冻干医药组合物包含8重量％到12重量％的乙酸盐含量。在另一个实施例中，所述冻干医药组合物包含10重量％到11重量％的乙酸盐含量。
[0025]在冻干医药组合物的另一个实施例中，所述医药组合物的含水量小于5%。在冻干医药组合物的另一个实施例中，含水量小于4.0%。在冻干医药组合物的另一个实施例中，含水量小于3.5%。
[0026]在另一个实施例中，所述医药组合物提供于包装材料中。在另一个实施例中，所述医药组合物经调配以供长期存储。在另一个实施例中，所述医药组合物包含在无菌玻璃小瓶中且按指示在_70°C下存储。
[0027]在另一个实施例中，所述医药组合物经调配以供皮下投药。在另一个实施例中，所述医药组合物包含在无菌注射器中。
[0028]一个实施例包括一种医药组合物，其包括具有序列Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO: 1，其中 Xaa 为 Met 或 Nle)的 ShK 多肽的医药上可接受的盐、IOmM磷酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，C端为酸或酰胺并且所述组合物的pH为6.0。
[0029]另一个实施例包括一种医药组合物,其包含具有式Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (SEQ ID NO:1，其中 Xaa 为 Met)的 ShK 多肽的医药上可接受的盐、IOmM磷酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体并且所述组合物的pH为6.0。
[0030]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式对磷酸基-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Ly s-Tyr-Ar g-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 (ShK-186)的 ShK 多妝的医药上可接受的盐、IOmM磷酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH为6.0。
[0031]另一个实施例包括一种医药组合物，其包含具有式Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1Ie-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 (ShK-198)的 ShK 多妝、IOmM 憐酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH为6.0。
[0032]文中揭示的实施例还包括用于医药用途的制造单元。所述制造单元的一个实施例包含至少一个在无菌条件下制备的包含文中所述的医药组合物的玻璃小瓶。在另一个实施例中，所述玻璃小瓶内的医药组合物在-70°C下保持稳定达至少6个月。在另一个实施例中，所述制造单元进一步包含稀释和制备医药组合物以向人类投药的说明书。
[0033]在另一个实施例中，用于医药用途的制造单元包含至少一个含有文中所述医药组合物的无菌注射器。在另一个实施例中，所述制造单元进一步包含将医药组合物向人类投药的说明书。
[0034]文中揭示的实施例还包括制造所述医药组合物的方法。一个此类实施例包括一种制造医药组合物的工艺，包含:(a)以预定浓度制备0.05%聚山梨醇酯20含于水性载剂中的溶液；(b)将预定含量的具有SEQ ID NO:1的多肽或其医药上可接受的盐加入到步骤
(a)的溶液中，其中C端为酸或酰胺，且其中所述多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体；(c)调整步骤(b)的溶液的pH直到多肽溶于所述溶液中；及(d)如果有需要，调整步骤(c)的溶液的pH到5到7的pH，从而制备所述医药组合物。
[0035]文中揭示的实施例还包括预防、治疗或缓解自身免疫或代谢失调的症状的方法。一个实施例包括以有效预防、治疗或缓解症状的量将文中所述医药组合物投向需要此类预防、治疗或缓解自身免疫或代谢失调的人。 [0036]在另一个实施例中，所述失调是选自由以下组成的群组的自身免疫失调:多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠病、接触介导性皮炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、全身性硬化、纤维化、硬皮病、血管球性肾炎、舍格伦综合症(Sjogrensyndrome)、炎性骨吸收、移植排斥反应、移植物抗宿主病以及红斑性狼疮。
[0037]在另一个实施例中，所述失调是选自由以下组成的群组的代谢失调:肥胖、2型糖尿病、高胆固醇血症、冠状动脉病、代谢综合症、代谢综合症X、胰岛素抗性、高脂血症、脂质营养不良、血脂异常、高三酸甘油酯血症、葡萄糖耐受不良、高血压、超重以及能量代谢失调。
[0038]在另一个实施例中，所述医药组合物每天、每周、每月、每两个月、每三个月或每六个月投药一次。
[0039]在另一个实施例中，所述医药组合物经皮下投药。
[0040]在另一个实施例中，所述ShK多肽经放射性标记。
[0041]在一个实施例中，所述ShK多肽以111In标记。
[0042]在另一个实施例中，所述ShK多肽是经111In标记的ShK_221。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1说明经放射性标记的ShK在大鼠及松鼠猴中的生物分布研究。将经111In标记的ShK-221通过到每一只动物的肩胛区的单次皮下注射的形式投与史泊格多利(SpragueDawley)大鼠(100 μ g/kg ;0.7mCi)和松鼠猴(35 μ g/kg ;0.84mCi)。在第 I 个小时期间(4X 15m间隔)以及在给药后第4、8、24、48、72、120及160小时持续收集SPECT和CT扫描。针对猴子(A)在第4、24、72及160小时的时间点以及针对大鼠(C)在第1、8及24小时的时间点显示3D重构的平面化2D图。两种动物均显示药物从注射部位的缓慢吸收以及到肾脏和较小程度的到肝脏的明显早期且持续分布。大鼠图像显示在第I小时在膀胱中、在第4和8小时在十二指肠和小肠中以及在第8和24小时在肾上腺中具有明显的放射性。两种动物中与肾脏相关的放射性主要在皮质中识别(B及D)。在猴子(顶部)和大鼠(底部)中注射部位处mIn-ShK-221的定量显示双相性衰退，其中初始半衰期为约I到1.5小时且最终半衰期> 48小时(E)。在猴子(顶部)和大鼠(底部)全血中的药物浓度遵循类似的双相性衰退，其中初始半衰期为约1.5小时且最终半衰期> 64小时(F)。在整个研究期间，Kvl.3的血浓度保持超过Kd且在最开始的120小时内超过80%的饱和浓度(233pM)，这与在整个研究期间从注射部位的缓慢、持续分布相一致。
[0044]图2说明经放射性标记的ShK-186类似物的形成。通过经由连接子将DOTA固相偶联到ShK-198的氨基端以形成ShK-221 (A)来进行ShK-186的放射性标记。通过在95°C下、PH 5的乙酸钠中培养来将铟并入到DOTA环中。通过离子交换色谱法，经铟标记的ShK-221产生独特的迁移图，其中所产生的螯合物具有预期的质量(C)。
[0045]图3显示ShK-186和两种经标记的类似物(ShK-221-钆(ShK-221-Gd)和ShK-221-铟(ShK-221-1n))的Kvl.3通道阻断效力的比较:(A)在不存在和存在ShK-221-Gd 下的代表性全细胞 Kvl.3 电流，(B)显示 ShK-186、ShK_221-Gd 以及 ShK_221_In对Kvl.3电流的影响的剂量-反应曲线。所述研究使用稳定的Kvl.3-转染细胞系(比顿(Beeton)等人《分子药理学(Mol Pharmacol)》67:1369-1381 (2005)，以引用的方式将相关传授内容并入本文)。通过如所述的膜片钳技术的全细胞配置进行电生理记录(比顿等人2005和伍尔夫H等人，《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.))) 97:8151-6(2000)，以引用的方式将相关传授内容并入本文)。外部溶液为林格钠(sodiumRinger),吸管溶液为KF (300m0sm)。通过从_80mV到40mV的钳制电位的200_ms去极化脉冲，引发Kvl.3电流。ShK-186、ShK-221-Gd以及ShK_221_In各自在若干个浓度下进行测试。使用原点(Origin)软件(马萨诸赛州北安普敦的原点软件公司(OriginLab Corp.,Northampton, MA)),使用各个浓度在40mV下峰值电流的减少量来产生剂量-反应曲线。IC50 值为:ShK-186 = 68.99±4.01pM(n = 5)，ShK-221-Gd = 58.23± 1.38pM(n = 5)，ShK-221-1n = 63.80 ±2.25pM(n = 3)。
【具体实施方式】
[0046]本发明提供了以ShK`为主的医药组合物以及其制备和使用方法。文中所用的术语“ShK多肽”是指所有天然和合成ShK多肽以及如文中所涵盖的其衍生物、类似物以及修饰。此类修饰和类似物包括SEQ ID NO:1的多肽，带阴离子电荷的有机或无机化学实体经由氨基乙氧基乙氧基-乙酰基连接子连接到所述多肽。文中所用的“医药组合物”包含至少一种文中所揭示的ShK多肽以及适合于所选投药模式的一种或一种以上医药上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。“至少一种ShK多肽”可以包括天然和合成ShK多肽。
[0047]如所述，许多与免疫相关的人类疾病和代谢失调是由记忆T细胞的作用所引起的。已知两类记忆T细胞:中枢记忆T细胞(Tcm)和效应记忆T细胞(Tem)。一经活化，Tem细胞向上调节Kvl.3K+离子通道。抗原驱动的Tem细胞增殖对Kvl.3K+离子通道阻断剂敏感(伍尔夫等人，《临床研究杂志》111 =1703-1713，2003)，且最初从加勒比海海葵分离的多肽ShK可以充当此类阻断剂。通过阻断Kvl.3通道，ShK在皮莫耳浓度下抑制Tem细胞的增殖。
[0048]MS患者中的髓鞘质特异性自身反应性T细胞为主要被活化的TEM细胞(伍尔夫等人，《临床研究杂志》111:1703-1713，2003)，因此尽管文中所揭示的组合物不受具体机制的限制，但是存在合理的依据将Kvl.3阻断剂制备作为医药组合物，以便在治疗、预防或缓解多发性硬化患者的症状时减少或消除TEM细胞的活化。
[0049]天然ShK多肽描述于例如彭宁顿M.ff.(Pennington, M.ff.)等人，《国际肽蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Protein Res.)》46:354-358 (1995)中，所述参考文献以引用的方式将相关传授内容并入本文中。在本发明范围内的示范性ShK结构还在比顿C.等人，“用Kvl.3通道的选择性多肽抑制剂靶向效应记忆T细胞以进行自身免疫疾病治疗(TargetingEffector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor of Kvl.3 Channelsfor Therapy of Autoimmune Diseases) ”，《分子药理学》，第 67 卷:1369 (2005)以及美国专利第8，080，523号(美国专利公开案20080221024)中公开，所有文献均以引用的方式将相关传授内容并入本文中。
[0050]SEQ ID NO:1展示形成文中所用组合物中的多肽的基础的示范性多肽。在特定实施例中，C端为酸(例如C00H)或酰胺(例如CONH2),且所述多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体。“酰胺”表示酸的C端羟基(OH)被NH2取代。所述取代在文中使用术语“酰胺”来指示或指示为C端氨基酸-NH2，如在“-Cys-NH2”中。
[0051]已经研究ShK的安全性、效用以及特异性且已经显示将多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体可以改善ShK在医药组合物中使用的适用性。
[0052]所属领域的技术人员了解设计具有增强性质的ShK多肽的技术，例如丙氨酸扫描，利用已知ShK多肽序列和/或分子建模进行的基于比对介导的突变诱发的合理设计。举例来说，可以设计ShK多肽以去除含ShK多肽组合物中的蛋白酶裂解位点(例如，在K或R残基处的胰蛋白酶裂解位点和/或在F、Y或W残基处的胰凝乳蛋白酶裂解位点)。
[0053]SEQ ID NO:1多肽的各种修饰为适合的。一种多肽可以具有文中揭示的修饰的任何组合。为了改善ShK结构的药物动力学和药效动力学(PK/PD)特性，可以置换或取代对降解性敏感的残基。举例来说，可以取代21位的Met残基以赋予抵抗氧化的稳定化作用。在一个实施例中，21位的Met被Nle取代。用酰胺取代C端酸官能团也可以赋予稳定性。所述对ShK的一级结构的两种取代可以与N端阴离子部分结合以产生稳定且具选择性的Kvl.3阻断剂。因此，文中揭示的一个实施例包括SEQ ID NO:1，其中21位的甲硫氨酸被Nle取代，酰胺存在于C端和/或阴离子部分存在于N端。
[0054]不可水解的磷酸根取代也对磷酸根赋予稳定化作用以及抵抗磷酸酶的稳定性。
[0055]如所述，某些实施例包括有机或无机化学实体的连接。连接位点可以位于N端(SEQ ID NO:1中的第一个Arg),但修饰不限于在所述位点连接。示范性化学实体可以通过连接子(例如氨基乙氧基乙氧基-乙酰基连接子(在文中可互换地称为Aeea或AEEAc))或通过任何其它适当方式连接。
[0056]适当化学实体的非限制性实例包括L-Pmp (OH2) ；D-Pmp (OH2) ；D-Pmp (OHEt)；Pmp (Et2) ；D-Pmp (Et2) ； L-Tyr ； L-Tyr (PO3H2)(对磷酸基酪氨酸)；L-Phe (p-NH2)；L-Phe (P-CO2H) ;L-天冬氨酸盐；D_天冬氨酸盐；L_谷氨酸盐以及D-谷氨酸盐。所用缩写的定义如下:Pmp (对膦酰基甲基-苯基丙氨酸)和Ppa (对磷脂酰基-苯基丙氨酸)。PmP和Ppa的替代项包括但不限于Pfp (对膦酰基(二氟-甲基)-苯基丙氨酸)(Pfp)和Pkp (对膦酰基-甲基酮基-苯基丙氨酸)。
[0057]化学实体/连接子组合的非限制性实例包括AEEAc-L-Pmp (OH2)；AEEAc-D-Pmp (OH2) ;AEEAc-D_Pmp (OHEt) ;AEEAc-L_Pmp (Et2) ;AEEAc-D_Pmp (Et2)；AEEAc-L-Tyr ；AEEAc-L-Tyr (PO3H2) ；AEEAc-L-Phe (p-NH2) ；AEEAc-L-Phe (p-C02H)；AEEAc-L-天冬氨酸盐；AEEAc-D-天冬氨酸盐；AEEAc_L-谷氨酸盐以及AEEAc-D-谷氨酸盐。一般在氨基酸残基具有手性中心的化学实体中，可以使用氨基酸残基的D和/或L对映异构体。
[0058]为了在所揭示的医药组合物中使用，ShK多肽可以是天然的或合成的或可以作为天然和合成ShK的混合物提供。
[0059]可以盐形式制备ShK多肽。在文中的示范性盐中，从RP-HPLC步骤(实例I)获得的再折叠多肽可返回到管柱中并洗提。在干燥前，可以添加50mM的乙酸钠或乙酸钾到蛋白质溶液中。此步骤产生所述蛋白质的盐形式，其在从干燥形式复水时容易溶解。在实例中所用的示范性调配物(ShK-186)中，添加乙酸钠，且通过化学分析，所述调配物中的乙酸盐含量为10.4重量％。ShK-186为海葵毒素的含37个氨基酸的合成肽衍生物。在文献中，ShK-186还被称为SL5且由CAS登记号1081110-69-1标识。
[0060]为了使含多肽组合物用作医药组合物，其必须在稳定性、溶解度以及pH方面满足若干标准，且优选地仅含有与投与动物(包含但不限于哺乳动物且特定为人)相符的物质。组成可以依据投药模式(例如皮下、静脉内等)而变化。
[0061]尽管所属领域中已知治疗性ShK多肽的一些调配物(例如以上引用的比顿，C.等人，以及美国专利第7，833，979号)，但它们均不具有文中所揭示的基于ShK的医药组合物的稳定性和溶解度。文中揭示的稳定且可溶解的基于ShK的医药组合物经由改变许多因素(包括表面活性剂浓度、pH、去除先前调配物中所用的组分以及下文实例中更充分描述的其它参数)来实现。
[0062]具有最佳稳定性和溶解度的一种特定调配物包括:
[0063]表1.P6N调配物的医药组合物
[0064]
【权利要求】
1.一种适用于活体内诊断用途的医药组合物，其包含具有序列Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1Ie-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO:1)的 ShK 多妝的医药上可接受的盐，其中所述ShK多肽连接到可检测的标记和带阴离子电荷的有机或无机化学实体，且其中C端为酸或酰胺。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记为铟-111(In111)的螯合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述可检测的标记为铟-1ll(Inm)的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-螯合物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记为钆(Gd)的螯合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述可检测的标记为钆(Gd)的DOTA-螯合物。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述ShK多肽具有序列Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1Ie-Asp-Thr-1Ie-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Ar g-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 (ShK-198)且所述可检测的标记位于氨基端。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述可检测的标记为铟-1ll(Inm)的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-螯合物。
8.一种医药组合物，其包含具有序列 Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO:1)的ShK多肽的医药上可接受的盐，其中所述ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，且其中C端为酸或酰胺。
9.根据权利要求8所述的医药组合物，其含于水性载剂中。
10.根据权利要求9所述的医药组合物，其具有介于5与7之间的pH。
11.根据权利要求9所述的医药组合物，其进一步包含在水性载剂中有效溶解所述ShK多肽的量的表面活性剂。
12.根据权利要求9所述的医药组合物，其中所述ShK多肽是以0.01mg/ml到500mg/ml的量存在。
13.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。
14.根据权利要求13所述的医药组合物，其中所述表面活性剂为0.05w/V%的聚山梨醇酯20。
15.根据权利要求10所述的医药组合物，其中所述pH为6.0。
16.根据权利要求12所述的医药组合物，其包含0.01、0.1,0.5,0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 或 500mg/ml 的所述 ShK 多肽。
17.根据权利要求8所述的医药组合物，其中所述ShK多肽是从天然来源获得的。
18.根据权利要求8所述的医药组合物，其中所述ShK多肽是合成的。
19.根据权利要求8所述的医药组合物，其中所述化学实体连接到所述ShK多肽的N端。
20.根据权利要求19所述的医药组合物，其中所述化学实体是通过连接分子或连接基团连接到所述ShK多肽的所述N端。
21.根据权利要求20所述的医药组合物，其中所述化学实体是通过氨基乙氧基乙氧基-乙酰基连接子连接到所述ShK多肽的所述N端。
22.根据权利要求11所述的医药组合物，其中所述化学实体是选自由以下组成的群组:AEEAc-L-Pmp (OH2) ；AEEAc-D-Pmp (OH2) ；AEEAc-D-Pmp (OH, Et) ；AEEAc-L-Pmp (Et2)；AEEAc-D-Pmp (Et2) ;AEEAc-L-Tyr ;AEEAc-L-Tyr (PO3H2) ;AEEAc-L_Phe (p_NH2)；AEEAc-L-Phe (p-C02H) ；AEEAc-L-天冬氨酸盐；AEEAc_D-天冬氨酸盐；AEEAc_L-谷氨酸盐；以及AEEAc-D-谷氨酸盐。
23.一种医药组合物，其包含具有式对磷酸基-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1Ie-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 的 ShK 多肽的医药上可接受的盐。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，其含于水性载剂中且进一步包含0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述组合物具有介于5与7之间的pH。
25.根据权利要求24所述的医药组合物，其进一步包含IOmM磷酸钠、150mMNaCl以及0.5mg/ml到50mg/ml的ShK-186,其中所述组合物的pH为6.0。
26.一种医药组合物，其包含具有式 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 的 ShK 多肽的医药上可接受的盐。
27.根据权利要求26所述的医药组合物，其含于水性载剂中且进一步包含0.05w/v%的聚山梨醇酯20，以及0.5mg/ml到50mg/ml范围内的ShK-198，其中所述组合物具有介于5与7之间的pH。
28.根据权利要求27所述的医药组合物，其进一步包含IOmM磷酸钠、150mMNaCl以及0.5mg/ml到50mg/ml的ShK-198,其中所述组合物的pH为6.0。
29.一种医药组合物，其包含IOmM磷酸钠、150mM NaCU0.5mg/ml到50mg/ml的连接到对憐酸基-Tyr-ΑΕΕΑ 的具有式 Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2(SEQ ID NO:1，其中Xaa为Met)的多肽的医药上可接受的盐以及0.05w/V%的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH为6.0。
30.根据权利要求8所述的医药组合物，其中所述医药上可接受的盐为乙酸钾或乙酸钠。
31.一种制备医药组合物的方法，其包含:(a)以预定浓度制备0.05%聚山梨醇酯20于水性载剂中的溶液；(b)将预定量的具有SEQ ID NO:1的多肽的医药上可接受的盐添加到步骤(a)的溶液中，其中C端为酸或酰胺，且其中所述多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体；(c)调整步骤(b)的溶液的pH直到所述多肽溶于所述溶液中；以及(d)如果需要，调整步骤(c)的溶液的PH到5到7的pH，从而制备所述医药组合物。
32.—种医药组合物，其通过根据权利要求31所述的方法制备。
33.一种冻干医药组合物，其包含SEQ ID NO:1的多肽的医药上可接受的盐，其中C端为酸或酰胺，且其中所述多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体。
34.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其中所述医药上可接受的盐为乙酸钾或乙酸钠。
35.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其中所述医药上可接受的盐为乙酸钠。
36.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其包含8重量％到12重量％的乙酸盐含量。
37.根据权利要求36所述的冻干医药组合物，其包含10重量％到11重量％的乙酸盐含量。
38.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其提供于包装材料中。
39.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其中所述医药组合物的含水量小于5%。
40.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其中所述医药组合物的含水量小于4.0%。
41.根据权利要求33所述的冻干医药组合物，其中所述医药组合物的含水量小于3.5%。
42.根据权利要求1所述的医药组合物，其经调配以供长期存储。
43.根据权利要求42所述的医药组合物，其中所述组合物包含在无菌玻璃小瓶中且按指示在-70°C下存储。
44.根据权利要求8所述的医药组合物，其经调配以供皮下投药。`
45.根据权利要求44所述的医药组合物，其中所述组合物包含在无菌注射器中。
46.一种用于医药用途的制造单元，其包含至少一个在无菌条件下制备并且含有根据权利要求1、16、19或22中任一权利要求所述的医药组合物的玻璃小瓶，其中所述玻璃小瓶内的所述医药组合物在-70°C下保持稳定达至少6个月，且进一步包含稀释和制备所述医药组合物以向人类投药的说明书。
47.一种用于医药用途的制造单元，其包含至少一个含有根据权利要求1、16、19或22中任一权利要求所述的医药组合物的无菌注射器，其中所述制造单元进一步包含将所述医药组合物向人类投药的说明书。
48.一种预防、治疗或缓解需要此治疗或症状缓解的人类的自身免疫失调的症状的方法，所述方法包含向所述人类投与有效预防或治疗疾病或缓解所述症状的量的根据权利要求8、23、26或29中任一权利要求所述的医药组合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述失调是选自由以下组成的群组:多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠病、接触介导性皮炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、全身性硬化、纤维化、硬皮病、血管球性肾炎、舍格伦综合症(Sjogrensyndrome)、炎性骨吸收、移植排斥反应、移植物抗宿主病以及红斑性狼疮。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述失调为多发性硬化，且所述方法包含投与根据权利要求16所述的组合物。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述医药组合物是每天、每周、每月、每两个月、每三个月或每六个月投药一次。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述医药组合物是皮下投药。
53.一种预防、治疗或缓解人类个体的代谢失调的方法，其中所述方法包含向所述人类个体投与有效预防、治疗或缓解所述人类个体的所述代谢失调的一种或一种以上症状的量的根据权利要求8、23、36或29中任一权利要求所述的医药组合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述代谢失调为肥胖、2型糖尿病、高胆固醇血症、冠状动脉病、代谢综合症、代谢综合症X、胰岛素抗性、高脂血症、脂质营养不良、血脂异常、高三酸甘油酯血症、葡萄糖耐受不良、高血压、超重以及能量代谢失调中的一种或一种以上。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述医药组合物是每天、每周、每月、每两个月、每三个月或每六个月投药一次。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述医药组合物是皮下或静脉内投药。
57.一种医药组合物，其包含具有序列 Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (SEQ ID NO:1，其中 Xaa 为 Met 或 lie)的 ShK 多肽的医药上可接受的盐、IOmM磷酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，C端为酸或酰胺，且所述组合物的pH为6.0。
58.一种医药组合物，其包含具有式 Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (SEQ ID NO:1，其中 Xaa 为 Met)的 ShK 多肽的医药上可接受的盐、IOmM磷酸钠、150mMNaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，其中所述ShK多肽连接到带阴离子电荷的有机或无机化学实体，C端为酸或酰胺，且所述组合物的pH为6.0。
59.一种医药组合物，其包含具有式对磷酸基-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1Ie-Asp-Thr-1Ie-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cy s-Arg-Ly s-Thr-Cy s-Gly-Thr-Cy S-NH2 的 ShK 多妝的医药上可接受的盐、IOmM 憐酸钠、150mM NaCl以及0.05w/v%的聚山梨醇酯20，且其中所述组合物的pH为6.0。
60.一种医药组合物，其包含具有式 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-1le-Asp-Thr-1le-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 的 ShK 多妝、IOmM 憐酸钠、150mM NaCl 以及 0.05w/`V%的聚山梨醇酯20，其中所述组合物的pH为6.0。
【文档编号】A61P17/00GK103687608SQ201280035051
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年6月5日 优先权日:2011年6月6日
【发明者】肖恩·P·艾度纳托, 埃里克·J·塔查 申请人:奇尼塔一有限责任公司