用于经导管修复的组织工程心脏瓣膜的制作方法

用于经导管修复的组织工程心脏瓣膜的制作方法
【专利摘要】本文公开了击穿强度为2kgf至6kgf的单层组织薄片。由一个或多个瓣叶构成的瓣膜例如心脏瓣膜由单层组织薄片形成。本文公开了制备击穿强度为2kgf至5kgf的组织薄片的方法。本文描述的超强组织薄片具有非常长的培养时间，例如超过20周。瓣膜包含一个或多个由本文描述的超强组织薄片制成的瓣叶，其可经由导管主动脉瓣膜植入术进行传递。
【专利说明】用于经导管修复的组织工程心脏瓣膜
[0001]优先权声明
[0002]本申请基于35U.S.C.§ 119(e)要求美国临时申请61/615，111的优先权，该临时申请的申请日为2012年3月23日，其全文以引用的方式并入本文中。

【技术领域】
[0003]本文描述的技术通常应用于组织工程领域，修复心血管疾病损坏的组织，以及这些修复的血管内方法。更具体地，该技术涉及由组织工程材料制得的瓣膜，其可通过开放或透皮途径传递，以及涉及瓣膜的制备方法。组织工程瓣膜可取代心脏瓣膜例如主动脉瓣、肺动脉瓣、三尖瓣和二尖瓣，以及静脉瓣膜或胃瓣膜。

【背景技术】
[0004]人体包含大量不同类型的瓣膜，任一种瓣膜都可能在患者一生中由于疾病或某些遗传异常而衰坏。人们特别关注的是心脏瓣膜，其衰坏可导致患者快速死亡。
[0005]治疗心脏疾病的一个方面是手术置换心脏中四个瓣膜(任一个都可能受损或病变)的一个或多个。人的心脏有四个腔，每个腔都有单向瓣膜。四个瓣膜是不同的:主动脉瓣、肺动脉瓣、二尖瓣(或双尖瓣)和三尖瓣。前两种(也称为半月瓣)调节通过动脉离开心脏的血流，而后两种(也称为房室瓣)控制流入心脏的血流。每种瓣膜的结构包括位于血管颈部与心脏肌肉连接的环形部分以及调节穿过环形物的血流的两个或三个瓣，(在天然组织中)称为尖瓣。
[0006]心脏瓣膜的置换通常经由瓣膜植入物进行。目前制造的大多数心脏植入物都是用以置换衰坏的心脏瓣膜，但也开发出一些瓣膜植入物以置换静脉中的瓣膜。瓣膜植入物可完全由合成材料制造，其中它们常被称为“机械瓣膜”。合成瓣膜具有局限性，它们随时间使材料合生，还可形成血栓。瓣膜植入物的生命周期通常仅为15年左右，意味着较年轻的患者在他们的一生中可能需要两次或以上的手术来置换瓣膜。因此，手术往往昂贵而复杂，需要寿命更长的瓣膜植入物。
[0007]瓣膜植入物还可完全由生物组织制造，或由合成成分和生物成分两者制造。由生物组织制造的瓣膜常称为“组织瓣膜”，其使用获自尸体或动物来源的组织制造。组织瓣膜可以是获自动物尸体的真实瓣膜，或由原来不存在于瓣膜中的组织产生的瓣膜。这样产生的组织瓣膜结合了管状或环状结构(在本文其它地方称为“管状结构”)和两个或多个瓣叶(leaflets)(该术语用来描述这些瓣膜的尖瓣)。在大多数这些瓣膜中，管状结构通常由合成材料制造，但也可由组织或组织与合成材料的结合制造。管状结构的作用是支承所述瓣叶，并将瓣膜连接至主动脉和/或心脏的壁。所述瓣叶经常由附着到管状结构的生物材料制造，并形成瓣膜的尖瓣或瓣叶，打开时能使血液往一个方向流动，关闭时能够防止血以相反的方向倒流。在许多情况下，管状结构通过可折叠的支架提供，支架上连接有瓣叶。
[0008]用来制造组织瓣膜或结合了生物组分和合成组分的瓣膜的瓣叶的生物材料通常来源于尸体或动物(例如牛、马或猪来源)的心包。这些异种材料最常经化学或物理变性(常称为“固定”的过程)以最小化受者抵抗身体认为是异物的免疫反应，从而限制一旦植入后这种免疫反应对瓣膜的降解作用。固定也可用以加强或改变生物组织的机械性质。然而，固定的组织仍然被身体识别为异物。例如，固定的心包可触发免疫反应或钙化，导致瓣膜降解和衰坏。
[0009]有些瓣膜植入物由整个动物瓣膜制造(例如来自动物的心脏或静脉)。动物瓣膜也经固定以减少免疫反应。但是，固定可促进钙化，导致瓣膜衰坏，因此这仍然是不完善的解决方案。有时，瓣膜来自人组织捐献者(即，异体或同种瓣膜)，但这些是有限的来源。
[0010]因此有多种不同类型的瓣膜植入物在使用。瓣叶所附着的管状结构的形式和材料会带来变化。在一些情况下，可以将织物“裙”与其它材料结合起来以充当管状部分。有许多不同的设计在使用。在一种“漏斗”型结构中，仅有附着到支架的瓣叶。在另一种常见的组合中，三个瓣叶和合成(PTFE)管包含在支架内。在第三种实施方案中，已清洁并固定的动物(例如牛)瓣膜附着在支架内侧；支架内侧还可具有一管。在另一变形中，线框为缝合瓣叶和管提供了支撑。
[0011]给患者装上心脏瓣膜通常是通过开心手术，或通过微创手术的，微创手术称为经导管主动脉瓣植入术(TAVI)，其使用围绕传递导管的折叠的瓣膜。微创血管修复技术具有许多明显的优点，包括住院时间较短、手术创伤降低以及在某些患者群体中可观察到较低死亡率和/或较少并发症。这些优点快速推动了临床采用经导管的方法。在心脏瓣膜修复中，与之前通过开心手术进行标准治疗相比，TAVI显著降低了某些患者群体的死亡率(参见，例如M.B.等人的“Transcatheter aortic-valve implantat1n for aortic stenosisin patients who cannot undergo surgery (不能手术的患者经导管主动脉植入用于治疗主动脉狭窄)”，N.Engl.J.Med.，(2010) Oct 21 ;363 (17): 1597_607Epub 2010S 印 22)。在TAVI中，植入术包括进入中型动脉，其通常包括实施球囊瓣膜成形术(以破坏现有的瓣膜)，然后，需要将新的瓣膜通过进入血管路径引入，布置在瓣膜位置处或附近，例如在心脏/主动脉交界处。TAVI是一个微创方法的例子，但根据患者的情况，已开发出依赖可折叠瓣膜的其它微创方法(经心尖、经皮等)。TAVI可用以置换主动脉瓣、肺动脉瓣、三尖瓣、二尖瓣，或静脉瓣膜。
[0012]然而，与TAVI传递的瓣膜相关的并发症仍然存在。目前的传递组件(折叠的瓣膜和布置导管)体积大，难以推动通过导向心脏较大血管的较小血管。同时还发现，即使与开心手术相比，这些手术受中风发病率较高以及大血管并发症的困扰，这主要是由于瓣膜组件体积太大。因此，对于设计用于TAVI的装置来说，最紧迫的挑战是降低传递组件的截面积。然而，即使(合成)管状结构可设计成尽可能薄，收获的而非制造的生物组分(例如动物心包)仅能在一定的厚度范围内可用。可以使用多种处理技术来制造较薄的组织，但是这些处理是具有挑战性的，并且可能产生不了可接受的材料。固定的心包还可触发免疫反应或钙化，导致瓣膜随时间降解和衰坏。已固定的心包还可能是坚硬的，弯曲性质差，可能难以压入导管内。其在瓣膜中的使用寿命过程中也很容易剥离。
[0013]除了基于动物的组织外，近年来也已设计了来自基于人的组织的多种结构。据观察，在抗坏血酸化合物存在下进行培养过程中，贴壁细胞如成纤维细胞，能够在细胞之间和培养表面上沉积大量的细胞外基质蛋白。结果，可从培养支撑物剥离活组织的粘性块并用在手术中，所述活组织的粘性块由活细胞和这些细胞产生的细胞外基质蛋白组成(参见，例如，美国专利6，503，273)。
[0014]通常，细胞培养物持续数天至数周后会被微生物污染，细胞死亡，从培养表面剥离，或缩成小聚集体，任一聚集体会防止有活力结构的有效产生。然而，粘性组织薄片可使用成纤维细胞培养物持续4-5周以及长达7周产生(参见，例如，Lj Heureux, FASEBJ.，(1998), 12:47-56以及美国专利7，112，218)。这种方法与当时组织工程的一般想法相反，一般的想法是最小化培养时间，以降低污染的风险，减少总生产时间，从而降低成本。
[0015]由这些培养方法形成的活结构可用于产生活的且完全生物的结构例如具有高机械强度的血管，而不需要人工或其它外源性骨架(参见，例如，Lj Heureux, N.等人，“A completely b1logical tissue-engineered human blood vessel (完全生物的组织工程人血管)”，FASEB J.(《美国实验生物学会联合会会志》)，(1998), 12:47-56 ；Lf Heureux, N.等人，“Human tissue-engineered blood vessels for adult arterialrevascularizat1n (用于成人动脉血管重建术的人组织工程血管)”，Nature Med.(《天然药物》)，(2006) Mar ；12(3):361-5.Epub 2006Feb.19 ;以及 McAllister 等人的美国专利7，166，464和7，112，218，全部文献通过引用并入本文中)。制造和使用这样的组织结构的方法有时被称为自组装组织工程(“TESA”)(参见，例如，Peck, Μ.等人的“Tissue engineering by self-assembly (自组装组织工程)，，，Materials Today (《今日材料》)，14，218-224 (2011) ；Peck, Μ.等人，“The evolut1n of vascular tissueengineering and current state of the art (血管组织工程演变和本领域当前状态)”，Cells Tissues Organs (《细胞组织器官》)，195，144-158，(2012)，两份文献均通过引用并入本文中)，或仅仅“组织工程”。
[0016]这种方法的一个主要优势是，组织由天然的(即，未经修饰、未固定、未变性)细胞外基质制成，所述天然细胞外基质比合成材料或已固定的动物组织更相容。这种天然细胞外基质也是有利的，因为其可被身体重塑，并潜在地与患者一起生长。同样，该基质不会引起显著的降解性免疫反应，因其为人来源。另外，组织还可培养至包含活细胞(自体和/或异源)以改善重塑、免疫可接受性和/或其生理功能。
[0017]所得组织依靠培养支持物可具有不同的形状和大小(薄片、条带、线和颗粒，如美国专利6，503，273和7，166，464、美国专利申请公布2010-0189792以及国际专利申请公布W02012/145756中描述的，所有文献通过引用结合到本文中)。以这种方式制造组织薄片的方法被称为基于薄片的组织工程(SBTE)，其形成的基本构造块是组织的平面薄片。使用SBTE从八周龄的组织薄片培养物产生完全生物的、活的自体人血管(参见，例如，V Heureux, N.等人，Nature Med.(《天然药物》)，(2006)，12 (3): 361-5)。使用这种方法，机械性质类似于天然血管的组织工程血管可在体外构建，而不需要加入外源材料或合成骨架。长达三年的观察点表明，这些完全生物的人移植物在人中是安全的(参见，例如，McAllister, T.N.等人,“Effectiveness of haemodialysisaccess with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentrecohort study (自体组织工程血管移植物的血液透析通路的有效性:多中心群组研究)”，Lancet (《柳叶刀》)，(2009), 373:1440-6 ；Garrido, S.等人，“Haemodialysisaccess via tissue-engineered vascular graft(经由组织工程血管移植物的血液透析通路)，，，Lancet, (2009), 374:201 ;L，Heureux, N.等人，“Tissue-engineered blood vesselfor adult arterial revascularizat1n (用于成人动脉血管重建的组织工程血管)”，N.Eng.J.Med.(《新英格兰医学杂志》)，(2007)，357:1451-3)。
[0018]在本文描述的技术之前，已构建了组织工程制备的存活瓣膜。包含组织工程部分的瓣膜仅为研究主题，并未用于人体。目前制备组织工程瓣膜的方法按照已在其它结构中尝试和测试的方法进行，并涉及将合成骨架(其提供了必备的机械强度)与活细胞结合在一起。最有前景的工作已获得植入同种动物的动物瓣膜，即用动物细胞产生的瓣膜。(参见，例如，Sutherland, F.W.等人，“From stem cells to viable autologoussemi lunar heart valve (从干细胞到活自体半月形心脏瓣膜)”，Circulat1n (《循环》)，111，2783-2791 (2005);以及 Sodian, R.等人，“Early in vivo experience withtissue-engineered trileaflet heart valves (组织工程三尖心脏瓣膜的早期体内经历)”Circulat1n, 102, 11122-29，(2000)，两篇文献均通过引用结合到本文中。)这些瓣膜作为肺动脉瓣置换物植入，很可能是因为肺动脉的低压是比其它地方更宽松的环境。
[0019]之前使用组织薄片产生心脏瓣膜的尝试依靠将多层薄片堆叠在一起(参见，例如，美国专利申请10/198，628和10/495，748，两篇专利均通过引用结合到本文中)。堆叠薄片主要是获得比另一结构例如血管一般所需的更大的机械强度。堆叠前，每一薄片的培养时间据称是少至三周(LaFrance，H.等人，美国专利申请10/198，628)，与以前组织工程使用的一般组织培养时间一致。但是，多层的使用涉及复杂的产生过程，并往往产生易于分层的瓣叶，因为堆叠的薄层缺乏粘附性。
[0020]因此，需要一种通过组织工程产生瓣膜例如心脏瓣膜的方法，其在使用过程中具有足够的机械强度并且不会分层。
[0021]本文背景的讨论用于解释技术的情况。在此并不承认所有涉及的材料在所附权利要求的 优先权日:是已经公开的，已知的或者是公知常识的一部分。
[0022]在整个申请的说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”及其变形，例如“包括(comprising) ”和“包括(comprises) ”并不意图排除其它添加剂、成分、整体或步骤。


【发明内容】

[0023]本公开内容解决了患者瓣膜例如心脏瓣膜的修复问题。特别是，本公开内容包括单层组织薄片，其具有2kgf-6kgf的击穿强度，可用在瓣膜植入物的构建中。本公开内容进一步包括制造这种组织薄片的方法，以及制造包含这种组织薄片的瓣膜植入物的方法。
[0024]在本文描述的技术中，与之前产生的薄片相比，组织薄片的培养时间延长3倍或以上。培养薄片超过24周的可行性已被证实，并且薄片的强度在这么长的培养时间内达到前所未有的强度。
[0025]本文描述的这种技术不限于通过微创技术引入的瓣膜。应理解，本文描述的任何瓣膜植入物可经由开放性手术方法弓丨入患者中。
[0026]本公开内容提供了击穿强度为2kgf-6kgf的单层组织薄片。该单层组织薄片包括贴壁细胞和由这些细胞产生的细胞外基质。该单层组织薄片可通过培养25-52周的时间形成。
[0027]击穿强度为2kgf_6kgf的单层组织薄片内可具有一条或多条细胞合成的线。
[0028]瓣膜植入物包括管状结构及连接至管状结构的两个或多个瓣叶，其中两个或多个的瓣叶每个都包含击穿强度为2kgf-6kgf的单层组织工程薄片。
[0029]单层组织薄片可自身折叠一次或多次。
[0030]本公开内容包括制备组织工程瓣膜植入物的方法，该方法包括:培养击穿强度超过2kgf的组织薄片；从该组织薄片切割两个或多个的瓣叶；将两个或以上的瓣叶附着到支架上，从而制成瓣膜植入物。
[0031]本公开内容进一步包括修复心脏瓣膜的方法，该方法包括:将组织工程心脏瓣膜折叠到导管上；以及将组织工程心脏瓣膜通过导管传递到位，其中，所述组织工程心脏瓣膜包括由组织工程薄片制成的两个或多个瓣叶。
[0032]本公开内容还进一步包括制造单层组织薄片的方法，该方法包括:用一个或多个组织控制棒(tissue control rod)在培养皿中培养一细胞群超过20周，以制得包含细胞和由该细胞产生的细胞外基质的薄片；以及在此期间和两周后，用与该细胞群相同的细胞系的细胞悬液接种薄片，其中所述接种进行2-6次。

【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1:显示了正常人皮肤成纤维细胞的两种细胞系的结果；每种情况下，右边的柱是USTS。在左边的图中，如前所述，对于两种细胞系中的每种，培养8周的薄片与25周龄的USTS进行击穿强度比较。USTS显示4.4-和5.8-倍的强度增加。在右边的图中，如前所述，培养8周的薄片与25周龄的USTS进行强度/厚度比的比较。USTS显示2.7-和3.7-倍的强度/厚度比增加。
[0034]图2:根据切割标记(顶部)将很大程度上干燥的USTS (底部)切割，以形成心脏瓣膜的三个瓣叶。每个半月瓣叶是单层的组织薄片。干燥过程令薄片看起来透明。切割标记包括组织分配以形成阿朗希乌斯小结(三瓣叶相遇的地方)。半月瓣叶通过一段组织连接在一起，所述一段组织将折叠以形成较厚的区域，用于安全缝合瓣叶的上面区域以形成接合处。这是许多可能的瓣叶设计中的一个例子，可根据本文方法和说明书构建。
[0035]图3:来自图2的相同切割USTS缝到PTFE制成的合成管状结构上，以形成三尖瓣用于证明的目的(非植入物)。USTS是含水的，并且每一尖瓣由单层组织薄片制成。瓣叶彼此相邻地缝合在一起以形成瓣叶的接合处，与管状结构并列。尖瓣的自由边缘相接触以在接合区域处封住血管。
[0036]图4:是反压(backpressure)下从顶部看图3的瓣膜(在体内，这是从主动脉观察的图)。反压充斥尖瓣窦(cusps’ sinuses)并迫使它们闭合。瓣叶的接合处清晰可见。其它组织可以形成阿朗希乌斯小结或能够在体外或在体内重塑过程中使组织收缩。
[0037]图5:由USTS制成的组织工程瓣叶(底部)折叠以形成直边，而细胞合成的线置于两层之间以沿最大应力的轴提供额外的强度。显示了两种设计:在自然的设计中，纤维的组织与工程化的设计相比没有那么对称。USTS并不融合在一起。天然的牛心脏瓣叶显示在顶部用于对比。
[0038]图6:在缝合线牵拉测试过程中获得的力与应变图，该测试首先让USTS收缩至其原始长度60%，然后用0.5%戊二醛交联(三角形)，以及USTS在固定前不收缩(“X”)来进行。
[0039]图7:在相同的线加强USTS样品上进行的测试的缝合线牵拉结果。从不同的位置和从不同的方向牵拉进行缝合线。垂直于线，在材料内侧相同的距离处向外牵拉缝合线I和2。缝合线I仅从组织牵拉，不穿过线。缝合线2比缝合线I需要多46%的力来拉出。缝合线3和4对比了将缝合线从组织薄片拉出和将缝合线纵向穿过线拉出。显示的数据是每一缝合结构η个样品的数据。每一根柱显示为原始数字和百分比(例如，对于缝合1，±llgf 以及 15% )。
[0040]不同附图中的相同标记符号表不相同的兀素。

【具体实施方式】
[0041]本文的技术涉及用于静脉位置内的瓣膜，或置换心脏瓣膜，其中瓣膜的一个或多个部分通过组织工程制造。
[0042]应用基于薄片的组织工程进行瓣膜置换和修复具有许多优点。厚度受控的坚固生物组织薄片尤其适合产生用于导管传递的瓣膜，因为包含这种组织工程材料的瓣膜的截面积(通常称为“截面”)比用外源或尸体组织例如心包制造的瓣膜的截面积要小。因为大体积物体例如瓣膜的传递总是在放置时对动脉或静脉造成一些损伤，所以，小型物体可提供显著的临床优势。因为组织工程材料是通过受控方法制造，所以，与收获的组织相比，它们也具有提供的薄片厚度平均和结构均匀的优点(例如，它们不包含血管、脂肪沉积、钙化点或其它缺陷)。这降低了对连续的质量控制(QC)监控和测试工程化组织的需要，提供了显著的经济优势。此外，制造方法还保证了起始材料的无菌性，这是用例如来自屠宰场的材料不能完成的。由于组织在体外制造，其还可制备以满足瓣膜生产的特定需求(例如，特定形状、不同厚度和在需要的地方包含加强结构)，并以多种方式进行区域性调节(加强)。此外，组织工程还具有使用人组织代替外源组织的优点，这可具有免疫学、重塑和商业的优势。且不论瓣膜设计或应用如何，由人组织制造的瓣叶不会被免疫系统大力排斥，并且能被积极地重塑和整合到接受者的周围组织中。这通过避免钙化和结构性降解改进了瓣膜的长期作用。因为组织是人的，所以不需要化学固定来抵抗生物降解机制。未经固定的人组织相比于固定的生物移植物较不容易钙化，具有较好的机械性质(包括柔韧性)，较不容易形成血栓，将具有生长潜能并可整合到周围组织中以获得长期稳定性。在管状结构也由完全的生物组织工程材料制成的设计中，免疫反应的缺少和积极的重塑会增加出现较好结果的可能性。最后，人制品比动物组织对患者更具吸引力。
[0043]生产适用于制造血管的组织薄片的方法已在其它地方描述，参见，例如美国专利7，166，464和6，503, 273，其通过引用结合到本文中。通过使用贴壁细胞例如成纤维细胞，将其接种到细胞培养基上，并在抗坏血酸化合物存在下在体外培养数周，可获得坚固的薄片。已发现，培养4-8周的薄片已足以产生组织工程血管(参见，例如，L’ Heureux等人，FASEB J., 12:47 - 56 (1998)；以及 L’ Heureux 等人，Nature Med.(2006) 12 (3):361 -5)。一旦薄片获得所需应用足够的强度，其可被合适地操作。
[0044]在使用人组织薄片的初始工作中，它们通常培养4-5周(参见，例如，L’ Heureux等人，FASEB J.，12:47 - 56(1998))。在后期的研究和随后的临床试验中，通常使用培养8周的薄片(参见，例如，L’Heureux 等人，Nature Med.(2006) 12 (3): 361 - 5，McAllister 等人,Lancet, (2009), 373:1440-6 ；Garrido 等人,Lancet, (2009), 374:201 ;以及 L’Heureux等人，N.Eng.J.Med.，(2007)，357:1451-3)。
[0045]超强组织薄片
[0046]采用本文的技术开展组织工程来制造瓣膜，已由以下事实实现:细胞事实上可在无菌条件下培养非常长的时间，大大长于之前预期的，以形成组织薄片，本文所称的超强组织薄片(USTS)。因此培养时间可从4个月延长至12个月。生产组织工程材料用于制造瓣膜的其它培养时间包括:20周、24周、25周以及时间范围25-30周、30-40周以及40-52周。时间还可用天来表示，例如:120-150天；135-145天；160-170天；170-180天；200-220天；210-280天；280-350天；以及300-365天。可以假定，每一范围的上下端点可用任何其它引用的端点互换，以提供本文完全描述的其它培养时间范围(例如210-300天)。通过本发明方法产生的组织薄片在本文中被称为USTS。这是具有高强度特征并包含单层组织的组织薄片。
[0047]USTS的强度还可通过在培养周期内连续接种细胞改进。通常，与薄片生长来源相同的细胞系的细胞悬液可接种在拓展中的薄片上。可以与开始培养的密度相同的细胞密度来接种，或以高得多的细胞密度，例如起始浓度的5倍、10倍或20倍进行接种。这种额外的接种可在培养的任何时间进行，但通常在开始培养后2周以及培养结束前4周进行。这种额外的接种可在培养时间内进行许多次，例如2-6次，但优选2-3次。
[0048]培养可发生在生物反应器内，例如美国专利7，744，526中描述的。培养还可辅以使用一种或多种物体，被不同地称为组织控制棒或组织操作设备或其它类似的机械设备，所述机械设备可辅助薄片在生物反应器中形成，锚定薄片以防止意外的薄片剥离或收缩，或从生物反应器中移除后帮助操作薄片。合适的机械设备包括金属夹钳，例如L型(包括直角)构造的，以及连续的金属环例如圈。当组织薄片收缩时，在使用两个或多个夹钳来限制生长组织薄片的地方，优选防止夹钳相互重叠。例如，可采用一些形式的机械限制来防止多两个夹钳显著地从它们的初始构造移动，从而保持组织薄片绷紧。由于培养时间长，以及为了避免该时间内污染的风险，生物反应器通常是可封闭的培养瓶，或顶部具有狭窄开口的培养瓶。
[0049]可通过采用本文描述的延长的培养时间在体外产生的组织薄片，其具有超过之前描述的任何其它体外产生的组织薄片的机械强度。之前不理解的是，这样长的培养时间会导致所得组织的机械强度增加。例如，由多薄片或薄片的多层形成的卷状或层状结构的机械强度在7周的培养时间后并不增加(参见，例如，L’Heureux等人，FASEB J., 12:47-56 (1998)和美国专利申请10/198，628)。
[0050]为成功生产这种机械性强的组织工程结构，如本领域技术人员理解的，需要对组织培养装置进行高度的监督和管理，主要是避免在培养时间内发生污染的可能性。由这些条件可产生由均匀的组织单层组成的非常坚固的组织，而不用依靠堆叠或融合方法，其使用短时间培养的组织的多个薄片来产生复合组织。
[0051]迄今为止，涉及堆叠和融合的组合的方法是用组织薄片制造强机械性结构的标准方法。(参见，例如，L’Heureux 等人，FASEB J., 12:47 - 56 (1998) ;L’Heureux 等人，N.Eng.J.Med.(2007)，357:1451-3 ;Michel, M.等人，“Characterizat1n of a newtissue-engineered human skin equivalent with hair(与头发相当的新组织工程人皮肤的表征)”，In Vitro Cell Dev.B1l.-Anim., (1999)，35:318-26 ;L，Heureux, N.等人，“Ahuman tissue-engineered vascular media:a new model for pharmacological studiesof contractile responses (人组织工程血管媒介:收缩反应的药理研究新模型)”，FASEBJ., (2001) ； 15:515-24.；Haraguchi, Y.等人,“Regenerative therapies using cellsheet-based tissue engineering for cardiac disease (使用基于细胞薄片的组织工程用于心脏疾病的再生疗法)”，Card1l.Res.Pract.，(2011): 845170，全部通过引用纳入本文中。)这些方法具有数个缺点:1)它们形成的组织可能坚固，但是厚，并因此难以在静脉内定位；2)它们依赖于薄片融合在一起(漫长的、不可预见的并且常是不完整的方法，依赖于细胞活性和施加的力)；以及最重要地，3)所得组织薄片堆叠在心脏瓣膜运作的环境那样苛刻的环境中容易分层。
[0052]通常通过用圆头活塞确定击穿薄片所需要的力来评估薄片强度。之前已报到过，采用活塞头8 -1Omm,薄片击穿强度可高达800 -1, OOOgf (参见,例如，V Heureux等人,Nature Med.(2006) 12 (3): 361 - 5 ;美国专利 7，166464 ；7.504，258 和 8，076，137 ;以及Peck, Μ.等人，“Tissue engineering by self-assembly (自组装组织工程)，，MaterialsToday, 14，218-224，(2011))。根据此测量方法，测得的击穿强度根据使用的工具而变化。通过以下获得此处引用的值:用9.6_直径的圆头活塞(球)测量以及通过用夹钳设备固定的组织薄片驱动以提供具有25_直径的薄片暴露圆形部分。当用较小的尖端例如Imm尖端测量时，测定值可能会更低。通过本文描述的延长的细胞培养技术，可证明薄片击穿强度可重复地达到2kgf,并常超过4kgf (图1),并可进一步超过5kgf。这与本文描述的方法一致，当用1mm球测量时，可制得击穿强度在5-6kgf之间的USTS。这表示，强度是本领域其它地方描述的那些培养较短时间的组织的2.5-5倍。事实非常意想不到，纯粹由培养的细胞获得的完全生物薄片而不需任何外源性支架或不需化学或物理改性就可达到这种强度，这在以前从来未显示过，并且与其所属领域中的常规想法相反。正是这意料之外的强度使得能够使用单层USTS创建非常强的组织，而其他人则会假定需要融合的多层组织薄片。
[0053]本文描述的USTS的厚度难以精确地测量，因为该组织是可压缩的，并且当例如试图夹起来以测量其厚度的时候会变薄。但是，厚度范围在200-400微米对于瓣叶是合理的。较厚的薄片，比如说厚达500-600微米的薄片也是可能的,而厚度小至150微米的较薄组织也是可能的。一般来说，所得USTS的厚度通常是通过培养时间的长度来控制。
[0054]此外，由本文描述的方法产生的USTS不仅出人意料地比本领域之前描述的薄片要强，而且还具有比那些薄片的强度/厚度比高大约300% (见图1)。这对于设计适用于TAVI的截面积减少的心脏瓣膜是至关重要。由于本技术的一个目标是为了减少瓣膜的截面面积(截面直径)，因此使用具有更好的强度/厚度比(即，较薄，但具有与之前使用的材料相同的强度)的瓣叶材料是达成这个目标的好方法。
[0055]USTS意想不到的强度允许单层瓣叶设计成足以媲美天然组织。为描述材料的强度，工程师使用一定量，称为极限拉伸强度(UTS，或“应力”)。此定量是“材料性质”或“固有”定量，即，其依赖于尺寸，并描述单轴拉伸试验中破坏材料每单位横截面积需要的力。天然的人主动脉瓣叶据报道最大的UTS为2.6土 L 2MPa。(参见，例如，Balguid，A.，Rubbens，Μ.P., Mol, Α.等人，“The role of collagen cross-links in b1mechanical behav1r ofhuman aortic heart valve leaflets—relevance for tissue engineering(胶原交联在人主动脉心脏瓣叶生物力学性能中的作用-对于组织工程的相关性)”，Tissue Eng.(《组织工程》)，2007 ;13:1501-11。)本文描述的USTS的UTS经测定为4.7±0.6MPa左右，无任何化学或物理修饰。初步数据表明，使用简单的甲醛固定，此强度可再增加30%。同样，USTS由于高含水量而高度可压缩。使用压缩的厚度，其UTS增加了大约3倍。再次，这种非常高的强度“密度”使得USTS独特地适合需要薄和粘合结构的组织工程应用，所述结构也是非常坚固，例如对于瓣膜，且特别是设计用于TAVI的瓣膜。异种牛心包的UTS是压缩的USTS的大约2倍，但考虑到天然组织的UTS，瓣叶生产可能不需要这么高的强度(参见，例如，Vincentelli, A.等人，J.Heart Valve Dis.1998 ;7:24-9)。目前，在选择用于 TAVI应用的正确心包方面需要大量的努力。至今，小牛和猪的心包都有使用。特定的材料可通过辨别整个心包囊中最薄的点进行选择。心包可以是比组织工程薄片每单位厚度更强的材料，但是不能获得任意厚度的心包，因此在选择合适的样品时需要大量的质量控制。
[0056]单薄片设计还具有利于瓣膜形成的优点。形成超强组织薄片的独特能力使组织工程能够解决之前不能成功解决的应用。例如，在美国专利申请10/198,628中，体外产生的用于制造心脏瓣膜的组织薄片依靠每瓣叶至少堆叠和融合五(高达九)薄片，但甚至这是否会产生足够的强度都从来未经证实。形成堆叠的薄片仅培养了3周。没有公开内容描述以这种方式构建的瓣膜的所得特性；应用中也没有提供任何机械或功能数据。因为本文的方法不依靠堆叠和融合策略来达到足够的强度，所以可以构建不容易分层的优良瓣膜。即使在固定的动物组织制得的生物瓣膜中，植入后瓣叶的分层也已成为一个问题，这表明组织薄片的堆叠尤其不适合用于瓣膜中(参见，例如，Mirnajafi, A., Zubiate, B.和Sacks, M.S., “Effects of cyclic flexural fatigue on porcine b1prosthetic heart valveheterograft b1materials,(猪生物假体心脏瓣膜异种移植物生物材料上的周期性弯曲疲劳作用)”J.B1med.Mater.Res.，A 94，205 - 213 (2010))。例如，已发现天然猪瓣膜的瓣叶由3层制成(两较厚较强的层将较弱的层夹在中间)。尽管瓣膜天然地在动物的生命周期中不容易分层，但是在人应用中固定瓣膜会使其变硬，移除一些细胞组件，从而使其弱化。
[0057]一旦形成，具有足够强度的组织工程薄片可切成瓣膜组件例如瓣叶的形状。在优选的实施方案中，单个USTS在体外产生，并用以产生瓣膜的每一瓣叶。组织工程领域的技术人员将获知，在可通过例如USTS形成瓣叶的地方，对于TAVI或其它应用，存在大量瓣膜设计。本文描述的组织薄片可用以产生组件，以将合成瓣膜置换成任何类型的心脏瓣膜，包括:主动脉瓣、肺动脉瓣、三尖瓣、二尖瓣或静脉瓣膜。本文中，使用组织薄片的合成瓣膜可设计成可折叠的并通过导管传递，或设计成通过开放性手术技术进行传递。瓣叶附着到的结构可以是可折叠的支架、自膨胀的支架或由金属线和/或生物兼容性聚合物制成的不可折叠框架。此结构还可由生物可降解聚合物、组织薄片、另一USTS或细胞合成的线制成(例如，如美国专利申请公布2010/0189792)。组织薄片附着到的结构可发挥双重作用，作为传递装置(例如，支架)的一部分，以及作为瓣膜管状部分的一部分。在一些情形中，支架还可提供弹簧似的结构以帮助打开和闭合瓣膜。
[0058]USTS比之前制造的薄片在形成用于TAVI的瓣膜方面适合得多，因为用在TAVI中的瓣膜在折叠和布置时紧紧地合拢，这个过程因此容易使由融合堆叠制成的层状薄片分层。此外，本文描述的单USTS比任何之前报道的体外产生的组织薄片具有更高强度的每单位厚度。结果，与通过堆叠多层较薄薄片形成的瓣叶相比，USTS形成更薄的瓣叶，其具有相同或更大的强度。因此，用于TAVI的瓣膜可产生比堆叠的薄片更小的截面形状(或用动物例如牛的心包)。组织工程领域的技术人员将承认，为瓣膜组件提供较小的截面形状是开发改进的下一代技术中最重要的工作之一(如果不是最重要的话)。
[0059]瓣膜设计
[0060]本领域技术人员将认识到，USTS非常适合用于许多不同的瓣膜设计。USTS可如本文其它地方所描述那样来构建，不需要堆叠和融合步骤，其中可存在使用组织薄片的瓣膜设计，所述组织薄片自身折叠以形成两个，或多达4个组织层。在此情况下，由于USTS的固有强度，组织的这些层不需要例如通过细胞的作用(例如之前LaFrance等人描述的美国专利申请10/198，628)或通过压缩(例如美国专利7，521，431中描述的)彼此融合。在一些设计中，USTS的部分可使用外源粘合剂胶合在一起。在一些设计中，USTS的部分可与缝合材料或其它类型的线、手术钳、激光焊接或其它本领域已知的方法连接在一起。有许多理由需要多层组织，包括但不限于:1)将USTS裹在支架或瓣膜的其它非生物组件上；2)增加瓣叶的机械强度；3)形成较厚或较强的区域以更容易或有效地将USTS缝合到自身或瓣膜的另一组件，以及4)形成瓣膜的管状结构。
[0061]由于多种原因，包括增加机械强度、改进缝合强度或松弛度，改进接合，或改进血液动力学，USTS还可被集中、起皱或打褶，以形成组织密度的区域改变，独立于堆叠薄层。(参见图2-4)。接合是瓣膜操作过程中瓣叶相互闭合过程的名称。当血在一个方向上流动时，瓣膜的叶打开；当血压降低，瓣叶密封以防止血液倒流的线是接合线。
[0062]包括USTS的瓣膜还可包括组织工程的细胞合成线。这种线的例子描述在美国专利申请公布2010-0189792中。可定向和区域性地添加这些线以增强USTS，形成较强的瓣叶、将一个或多个USTS缝合在一起，或将瓣叶缝合到其它不同的组件上，例如血管支架或瓣膜的管状结构(见图5)。
[0063]瓣膜可整个由生物组织形成，所述生物组织在体外由以下两种或多种的任意组合产生:通过其它地方描述的方法产生的组织薄片，例如美国专利6，503，273、本文描述的USTS、细胞合成线和接种到瓣膜材料上以覆盖它们的细胞，或放置于组织材料层间来接种再生细胞群的细胞(例如，通过在层内侧引入骨髓细胞以将其重新填充)。用于此目的的合适再生细胞实例包括但不限于:肌成纤维细胞、肌细胞或其前体、平滑肌细胞或其前体、巨噬细胞、间充质干细胞、脂肪来源的干细胞、诱导的多能细胞、不同类型的未分化细胞或任意前面的细胞类型的组合。以这种方式产生的瓣膜相对于由尸体组织、非人组织，或合成材料，或那些材料的组合制成的植入物具有显著的优势。瓣膜还可包含USTS与任何其它现有的瓣膜假体组合，其中一个或多个瓣叶被USTS置换、加强或修复。瓣膜可利用本领域已知的任何方法用USTS组装，所述方法使用组织薄片例如心包作为起始材料。
[0064]成纤维细胞是生产USTS的优选的细胞类型，这些薄片也可使用其它细胞类型来产生，例如但不限于:肌成纤维细胞、肌肉细胞或其前体、平滑肌细胞或其前体、巨噬细胞、间充质干细胞、脂肪来源的干细胞、诱导的多能细胞、不同类型的未分化细胞或任意前面的细胞类型的组合。使用的细胞系可以是有限细胞系、半连续细胞系或连续细胞系。某些干细胞在免疫原性方面具有关键优势。但是，如本文描述的基于薄片的组织工程方法，是不限于特定细胞类型的。任何细胞类型或细胞类型的组合可用于产生具有足够强度的薄片。此夕卜，自身不产生USTS的细胞还可以与产生USTS的细胞混合，以提供所需的优点，例如但不限于:加速的USTS生产、改进的机械性质、免疫兼容性、提供代谢或分泌活性、增加血液兼容性(例如通过将内皮细胞放在薄片上以避免薄片材料上的血液凝固)，以及限制血栓形成或有利于体内组织整合、重塑或表现。
[0065]制成USTS的细胞可来自患者(自体)、捐献者(同种异体)或动物(异种)。薄片还可使用经遗传修饰的细胞以:分泌特定因子、增殖更快或更久、具有更好的存活率、具有更低的营养需求、促进愈合、处理缺陷、治愈疾病或具有其它优势。特别令人感兴趣的是使用经遗传修饰的细胞产生细胞外基质(ECM)成分的量比未修饰细胞通常产生的量要大。以这种方式产生的ECM成分可包括但不限于:胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、原纤蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和多功能蛋白聚糖。同样，细胞可经修饰以产生该细胞天然不会产生而由其它细胞类型或其它活生物体产生的基质(例如，丝、壳聚糖、纤维素)。最后，细胞可经遗传修饰以产生在自然界找不到的ECM成分，例如，具有修饰的氨基酸序列的ECM分子或长度在自然界通常找不到的ECM分子。
[0066]此外，薄片可在外源性元素存在下培养，所述外源性元素变成薄片的一部分，并最终变成所得瓣叶或瓣膜的一部分。这些元素可在薄片生长期间的任意时间添加。所述元素包括结构例如蛋白聚集体、天然或合成纤维如合成缝合线或肠线和矿物质，以及塑料或金属装置。它们可包括的物品例如:针、吻合器、药物传递装置和磁性或电子装置，例如射频识别标签。除了提供识别的方法，这些设备还可用来方便或增强基于USTS的进一步操作、机械强度、储存、手术用途或结构的愈合。特别关注的是通过生长到薄片内，将细胞合成线(或条带)纳入，如申请PCT/US07/85148所描述的。
[0067]通常，薄片通过在5%:95%的CO2:空气混合体中，于37°C下在培养基的许可基质上培养贴壁细胞来获得，所述培养基包含盐、糖、脂肪、蛋白质、生长因子和抗坏血酸化合物。大量培养条件可导致USTS形成，包括但不限于:使用动物或人血清或血清提取物作为蛋白质、脂肪、生长因子或其它生物大分子的来源，其可促进细胞生长和/或ECM生产；使用合成的、纯化的或重组的生长因子、脂肪、蛋白质、糖或其它生物大分子，其也可促进细胞生长；使用所谓“无血清”培养基，其具有重要的调节优势；使用较低或较高浓度的氧气、CO2或其它气体；使用25°C _45°C之间的温度；使用pH范围为4.0-10.0之间的培养基；使用带表面图案的培养基质以改善细胞附着、细胞生长、细胞定向、细胞表型、细胞外基质沉积，或在薄片内产生区域性差异；使用经覆盖的培养基质以改善细胞附着、细胞剥离、细胞生长、细胞定向、细胞表型、细胞外基质沉积，在薄片内产生区域性差异或特定细胞的筛选；使用带有特定几何形状的培养表面以促进瓣膜形成或在薄片厚度、强度、组织构成方面产生区域性差异。
[0068]薄片和瓣膜处理:
[0069]由于本文描述的技术不依靠堆叠和融合策略，USTS在其纳入到瓣膜组件阶段不需要是活的。因此，USTS可在组装过程的任意步骤之前、之后或中间灭活。灭活可以是完全或部分灭活，并且其可通过本领已知的一种或多种方法达到，包括但不限于:干燥；加热；冷却；冷冻；添加化合物例如酸、酶、抗体、洗涤剂、盐、毒素或溶剂；或施加各种形式的能量，包括但不限于超声、基于电磁或颗粒的辐照、机械力例如离心、流体流动或渗透压。灭活可具有其它作用，或为除了灭活本身外的目的实施，例如但不限于:增加机械强度；降低免疫原性；或改善移植结果。
[0070]此外或作为替代，USTS还可去细胞化(即，移除细胞碎片)。其可在组装过程任意步骤之前、之后或中间去细胞化。去细胞化可以是完全的或部分的。去细胞化可通过本领域已知的任何方法达到，例如但不限于:使用溶剂、酸、化合物、酶、洗涤剂、渗透压或它们的任意组合，包括使用相同的方法进行重复处理。此过程可用不同的机械处理、流体灌注或暴露到不同能量来源或它们的任意组合来改进。
[0071]除此以外或作为替代，在组装过程的任意步骤之前、之后或中间，USTS或所得瓣膜可用生物试剂进行覆盖，例如但不限于:外源性细胞外基质蛋白、抗血小板或抗血栓形成试齐U、天然或重组DNA或RNA、转染试剂、抗体、生长因子、抗生素、抗增殖剂或它们的片段，或它们的任意组合。在组装过程的任意步骤之前、之后或中间，还可用新的细胞接种USTS或所得瓣膜。该细胞可以是与用于USTS生产的那些相同或不同的类型，或细胞群的组合。这些细胞还可以是通常自身不会形成USTS的细胞，例如内皮细胞、间皮细胞、角化细胞、神经元、胶质细胞、胰岛细胞、肝细胞或其它可提供所需优点的细胞。这些细胞可来自患者(自体)、非自体人细胞(同种异体)、动物细胞(异种)、经遗传修饰的细胞(人或动物)或它们的任意组合。
[0072]本领域技术人员将进一步理解，固定可用一系列广泛的化学试剂在不同的静态或动态条件下(例如压力、温度、灌注、拉伸、压缩)处理不同的时间段。
[0073]此外或作为替代，USTS或所得瓣膜可用差不多强大的交联试剂处理包括醛，其可用以实现完全或部分的灭活、降低免疫原性作用、减缓生物降解、改善机械性质或附着化学或生物化合物。在组装过程的任意步骤之前、之后或中间可使USTS交联。其可在机械应力下交联以获得所需机械性质、获得所需物理尺寸、改进移植、愈合、功能性或其它所需性质。
[0074]可以使活的USTS在培养过程中收缩，以改善其一个或多个机械性质。一种这样的性质是柔软度(与刚度相对)或弹性，其对于促进瓣膜组装以及改善瓣膜功能性是重要的。此外，缝合的固定强度(材料抵抗缝合线牵拉，即缝合针迹划开的能力)也可通过收缩得到改善。可通过将USTS切离任何组织操作设备例如L钳来使其在培养时收缩，例如通过解开相互锁定的L型钳或通过将L型钳切离(L型钳的使用在下文实施例1中描述)。可在USTS生产过程中的任何时间开始收缩，并可在培养物中进行数天至数周的时间。收缩还可通过将薄片的边缘固定在一定尺寸进行限制。收缩还可限制在薄片特定的轴或方向。可使用在薄片培养过程中以受控方式改变尺寸的任何钳夹设计。模式复杂的收缩能够区域性地调节薄片的机械性质和纤维方向。这种区域性调节对改进缝合固定强度是有利的。此外，可有意地产生各向异性的机械性质以改善瓣叶的性能或模拟天然组织生物力学。培养过程可在收缩发生后继续。收缩可用多个步骤实现，在多个时间间隔后，钳夹更加地靠近。一些步骤可包括增加钳夹的距离，从而有效地拉伸薄片。收缩后或收缩过程中交联的薄片特别受到关注，其提供了具有有利机械性质例如弹性和强度的弹性组织。
[0075]活USTS还可在培养过程中通过动态施加力到薄片上进行机械调节。本领域技术人员将理解，有许多方法施加动态力，这些力可用不同强度和频率施加，并且这些力可在不同方向上施加。对于那个目的，可使用许多不同类型的生物反应器。
[0076]USTS的其它用途
[0077]USTS的独特强度在其它应用中也有用的，例如静脉瓣、经覆盖的血管支架、血管内移植物、血管移植物、血管补片、心脏补片、裂孔疝补片、骨科补片、软组织修复或置换、隔膜修复设备、韧带或肌腱修复或置换、皮肤创伤修复或置换，或许多其它的健康相关应用中的任一种(这些地方现在使用的是(生物的或合成的)材料薄片)。
[0078]实施例
[0079]实施例1:由活组织USTS形成的瓣膜
[0080]此实施例描述了使用USTS形成瓣膜的一种方法。在此实施例中，所得瓣膜是活组织，其排除了使用终端灭菌或固定步骤。因此，所有组装步骤都用无菌液体和仪器在无菌环境下进行。对于USTS、细胞类型、细胞来源、细胞年龄、细胞系、培养条件、瓣叶形状、瓣叶数量、缝合材料、缝合方法、瓣膜框架类型或瓣膜的意图用途，此描述并不意图限制此发明的范围。本领域技术人员可容易地认识到，该方法可进行不同的修饰而不会背离本发明的范围和精神。
[0081]通常，薄片通过在T-225cm2烧瓶中培养正常人皮肤成纤维细胞而获得。细胞以10，000个细胞/cm2的密度接种在DMEM中，其补充有Ham F12(20% )、胚胎克隆牛血清(20% )、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U)、链霉素(100mg/ml)和抗坏血酸钠(500mM)，并于37°C培养在5%:95%的CO2:空气混合物中。每周3次将用过的培养基换成新鲜的培养基。大约一周后，在烧瓶中引入由0.D.线(304不锈钢)制成的两个L型互锁钳。这两个L型钳有效地在烧瓶周围形成框架，在培养过程中，框架将埋入USTS中并有效地将其锚定。在烧瓶外并置于其下的框架可用以放置磁铁以将L型钳固定到位。这些钳是如美国专利7，504，258中描述的组织操作装置，该专利通过引用并入本文中。在25周的培养周期后，用热丝将烧瓶切开，在埋入的L型钳帮助下移出薄片。将湿薄片放在切割表面，并用模具切割成3个瓣叶。整个过程均通过培养基保持瓣叶润湿。用6-0PTFE缝合线将瓣叶缝到管状支架上(大约28mm的0.D.)。如果瓣膜将于同一天植入的话，活瓣膜于4°C储存在培养基中。如果植入稍后进行，将活瓣膜于37°C置于5%:95%的CO2:空气混合物中。瓣膜曲附(crimped)在传递球囊周围，成薄片并无菌包装(packaged)。按照介入性心脏病的标准医疗操作瓣膜传递至目标解剖位置。
[0082]实施例2:冷冻保藏的瓣膜
[0083]在此实施例中，瓣膜不是活的。如实施例1所描述的生产USTS，但在25周培养时期结束时移除培养基，用无菌蒸馏水(WFI “注射用水”，Hyclone)清洗薄片，并将烧瓶储存在-80°C冰箱中。此储存时期可以是短期(例如，数小时)至长期(例如，数年)。需要时，将烧瓶解冻，如实施例1所描述的将薄片用于瓣膜组装。因为在冷冻保存过程中没有特别注意保持细胞活力(例如，没有使用冷冻介质，没有控制冷冻速度)，因此，仅有少数(如果有的话)细胞存活。瓣膜可用简单的磷酸盐缓冲盐水于4°C下长时间储存，直至植入。这种储存条件将导致所有细胞死亡。当准备用于植入患者体内时，瓣膜曲附在传递球囊周围，成薄片，并无菌包装。按照介入性心脏病标准医疗惯例将瓣膜传递至目标解剖位置。
[0084]实施例3:脱水瓣膜
[0085]此实施例描述了制备无活性瓣膜的另一种方法。如实施例1所描述的生产USTS，但在25周培养时期结束时移除培养基，用无菌蒸馏水(WFI “注射用水”，Hyclone)清洗薄片，并使薄片脱水。将脱水薄片长时间(数小时至数年)储存于室温、4°C或-80°C。需要时，将WFI吸到烧瓶中，并使薄片复水(通常I小时至24小时)。然后，如实施例1所描述的将薄片用于瓣膜组装。正常的人细胞经脱水不会存活。瓣膜可用简单的磷酸盐缓冲盐水于4°C下长时间储存，直至植入。将瓣膜曲附在传递球囊周围，成薄片，并无菌包装。按照介入性心脏病标准医疗操作将瓣膜传递至目标解剖位置。
[0086]实施例4:无菌瓣膜
[0087]在此实施方式中，无活性瓣膜在非无菌条件下组装，而经最终灭菌。使用无菌技术产生USTS并如实施例2或3中描述的进行无菌储存，然后非无菌操作组织，但仍然处于与生产用于人体移植的医疗器械相当的清洁度水平下。这极大地简化了组装过程，部分是因为组装可在具有受控的空气的洁净室内进行，而非无菌操作台中。一旦组装好瓣膜，将瓣膜曲附到传递球囊周围，成薄片，并包装。最后的组装是使用25kGy剂量的Y辐照进行灭菌。
[0088]实施例5:折叠USTS形成的瓣叶
[0089]在此实施方式中，以单片形式从USTS中切出瓣叶及其镜像的形状。将此单片沿对称线(虚构的镜子)折叠以形成最终的瓣叶。由两层USTS有效地制成此瓣叶。瓣叶的自由边缘是USTS折叠的地方。这是此方法的重要特性，因为自由边缘是最容易分层的瓣叶边缘，因其它边缘将缝合在一起并缝合到瓣膜支架。此瓣叶设计不需要瓣叶的两层融合来形成功能性瓣膜。此瓣叶设计可按照实施例1-4描述的任一方法用来建立瓣膜。
[0090]实施例6:三层瓣叶
[0091]在此实施例中，产生三层瓣叶。首先，如实施例5中描述的，以单片的瓣叶及其镜像的形状切出一块USTS。然后，从USTS切出瓣叶的形状并放在第一片上面，以第一片的对称线对齐瓣叶的自由边缘。瓣叶准确地覆盖第一片的一半。然后，如实施例5描述的折叠第一片。此瓣叶设计不需要瓣叶的三层融合来形成功能性瓣膜。此瓣叶设计可按照实施例1-4描述的任一方法用来建立瓣膜。
[0092]实施例7:收缩的USTS
[0093]在此实施例中，USTS能够在培养时收缩，可通过将其切离L型钳并通过固定距离将两相对的边缘重新附着，从而能够在一个方向上收缩一定水平。例如，28周龄的USTS可从其L型钳释放，并能够在培养时收缩7天，然后在0.5%戊二醛溶液中固定24小时(以提供交联)。在图6中，显示了在戊二醛固定前缝合线牵拉试验的结果，该试验将收缩的USTS的行为与未收缩的USTS的行为进行对比。可观察到两种结果。首先，收缩的组织更兼容，因为对于给定的力，其比未收缩的组织拉伸更多(在此情形中高达20% )。第二，收缩的组织更能抵抗缝合线牵拉(更高的缝合线固定强度)，因为拉出缝合线需要的极限力比未收缩薄片高许多(70% )。
[0094]实施例8:结合USTS的细胞合成线
[0095]此实施例展示了细胞合成线如何通过与USTS结合用以改进瓣叶生产。细胞合成线是纺织品状的产品，由培养的人成纤维细胞产生的细胞外基质构建(如美国专利申请12/515，397所描述的)。这些线可以以各种尺寸和强度产生，并可纳入到瓣叶设计中，所述瓣叶设计用于模拟宏观上在天然心脏瓣尖中可见的厚胶原纤维(见图5)。这些线的策略性放置可将一些机械负载直接转移到瓣膜框架(即，用于可折叠瓣膜的支架，或用于不可折叠瓣膜的由各种聚合物/金属/织物/组织制成的环状或管状结构)。在一个实验中，在15周将细胞合成的线接近置于薄片上，将该结构进一步培养10周。此时，线埋入了 USTS中，并在戊二醛(?1%)中固定组织。图7显示了缝合线牵拉实验的结果，表明在USTS中，力口入细胞合成线可改进缝合线固定强度46%至117%，取决于线的取向。或者，线可缝在USTS内以提供支撑而不需要嵌入。线还可用作缝合线材料，以将瓣叶组装到瓣膜框架或支架，或将瓣叶缝合在一起。
[0096]实施例9:
[0097]在此实施例中，细胞合成的线与实施例5中产生的两层瓣叶结合。细胞合成线可放在USTS的两层之间，并大致平行于自由边缘，以提供周边支撑。不同的布置是可以的(图5)。将细胞合成线的末端固定在瓣膜框架或支架上。这可通过将线绑到框架或支架上，或将线缝合而达到。在此实施方式中，不将线埋入USTS中。
[0098]本文引用的所有文献均通过弓I用以其整体结合到本文中。
[0099]前面的描述是为了说明本技术的不同方面。而不旨在以本文记载的实施例来限制所附的权利要求的范围。本发明现已完整公开了，本领域技术人员应当明白，在不背离所附权利要求的精神或范围下，可以做出多种改变和修改。
【权利要求】
1.一种单层组织薄片,其具有2kgf至6kgf的击穿强度。
2.根据权利要求1所述的单层组织薄片，其包括贴壁细胞和由贴壁细胞产生的细胞外基质。
3.根据权利要求1所述的单层组织薄片，其通过培养25-52周的时间形成。
4.根据权利要求1所述的单层组织薄片，其通过培养25-30周的时间形成。
5.根据权利要求1所述的单层组织薄片，其进一步包含一条或多条组织工程线。
6.一种瓣膜植入物，其包括: 管状结构；以及 与管状结构连接的两个或多个瓣叶， 其中，所述两个或多个瓣叶中的每个瓣叶包含击穿强度2kgf至6kgf的单层组织工程薄片。
7.根据权利要求6所述的瓣膜植入物，其中，所述单层组织薄片自身折叠，使得每个瓣叶由两层组织构成。
8.根据权利要求6所述的瓣膜植入物，其进一步包含一条或多条细胞合成线。
9.制备组织工程瓣膜植入物的方法，所述方法包括: 培养击穿强度超过2kgf的组织薄片； 从组织薄片切割出两个或多个瓣叶；以及 将所述两个或多个瓣叶附着到支架上，从而形成瓣膜植入物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养包括培养组织薄片20-52周的时间。
11.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括在切割前使组织薄片脱水。
12.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括在瓣膜形成后对其灭菌。
13.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括在培养过程中使薄片收缩。
14.由权利要求9所述的方法产生的瓣膜植入物。
15.—种修复心脏瓣膜的方法,所述方法包括: 将组织工程心脏瓣膜折叠到导管上；以及 将组织工程心脏瓣膜通过导管传递到位， 其中所述组织工程心脏瓣膜包含由组织工程薄片制成的两个或多个瓣叶。
16.制备单层组织薄片的方法，所述方法包括: 在培养皿内放置一个或多个组织控制棒，培养细胞群超过20周，制得包含细胞和由这些细胞产生的细胞外基质的薄片；以及 在培养期间以及培养两周后，使用与所述细胞群相同的细胞系的细胞悬液接种薄片， 其中，所述接种进行2-6次。
【文档编号】A61F2/24GK104302245SQ201380025715
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月25日 优先权日:2012年3月23日
【发明者】N·勒赫, T·麦卡利斯特, N·迪塞尔 申请人:细胞移植组织工程有限公司