梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法。该梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗是将鹿源BVDV(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)接种培养至3～6代、稳定的、单层铺满的MDBK细胞的细胞瓶进行培养，挑选在培养72～144小时之间发生细胞病变(CPE)的细胞瓶，病变后反复冻融，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛灭活，之后将灭活之后的病毒液与白油、司本组成的油剂相混合，并加入硬脂酸铝，得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗。
【专利说明】梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]梅花鹿粘膜病由牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)引起的一种以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母鹿流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病，严重影响养鹿业健康发展。当前制约梅花鹿产业快速发展的瓶颈问题一是针对梅花鹿粘膜病专用疫苗在我国尚属空白，大多数养鹿场处于无免疫状况。
[0003]灭活疫苗是指将病原生物及其代谢产物用物理或化学的方法使其失去毒力，但仍保留其免疫原性而制成。接种后能产生特异性免疫力。在机体内不能生长繁殖，相对安全稳定。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗及其制备方法。
[0005]本发明所提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗，是将胎牛肾细胞(MDBK)接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒(BVDV)毒株得到的病毒液灭活得到的。
[0006]本发明提供一种梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂，由终浓度为0.01克/毫升的硬脂酸铝和下述体积份数的组分组成:
[0007]油相:注射用白油94体积份司本6体积份
[0008]水相:梅花鹿粘膜病病毒液96体积份吐温-80 4体积份
[0009]所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗为上述的疫苗。
[0010]本发明所提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗的制备方法，是将接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒株的胎牛肾细胞培养增殖，进行电镜观察，挑选在培养72?144小时之间产生明显病变的细胞，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛灭活，之后将灭火后的病毒液与油剂相混合，得到梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗。
[0011]所述方法中，所述加入甲醛的终浓度为0.15% (体积百分比浓度)。
[0012]所述方法中，所述接种牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒株为CC-CRB01。
[0013]所述方法中，所述胎牛肾细胞为第3?6代，所述培养增殖方法为细胞增殖病毒，所述培养的温度为37摄氏度。
[0014]本发明提供的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂的制备方法，包括下述步骤:
[0015]I)油相制备:取注射用白油94体积份，加司本-80 6体积份，混合后，加硬脂酸铝至浓度为0.02克/毫升，混匀灭菌；
[0016]2)水相制备:取吐温-804体积份，灭菌，加入权利要求5-8所述的方法获得的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗96体积份，振摇使吐温-80完全溶解；
[0017]3)乳化:取步骤I)获得的油相I与步骤2)获得的水相按照1:1的体积份数比搅拌混匀，得到梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗油乳剂。
[0018]本发明的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗可以直接对种鹿进行免疫，预防仔鹿的粘膜病。经过鹿场安全试验证实，此疫苗对种鹿是安全的，对产仔率、仔鹿成活率影响很小。该疫苗能使免疫鹿产生抵抗牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的抗体效价水平。免疫母鹿产仔后代的成活率为78%?82% (用户观察统计)，其中的未成活数大都系自然淘汰数和非特异死亡数。本发明梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂制备工艺获得的油包水型油乳剂灭活苗乳化程序简单、粘稠度适宜[用I毫升吸管(下口内径1.2毫米，上口内径2.7毫米)，吸取25摄氏度左右的疫苗I毫升，令其垂直自然流出，流出0.4毫升所需时间为6秒]。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0020]实施例1、梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗及其制备方法
[0021]为了安全地特异性地预防梅花鹿粘膜病这种病毒性传染病，研制了同源灭活疫苗。其制备方法如下所述:
[0022]一、梅花鹿粘膜病病毒液的制备
[0023]1、材料
[0024]梅花鹿源牛病毒性腹泻毒株CC-CRBOl (吉林大学动物医学学院传染病实验室分离鉴定)2代基础毒种，病毒毒力为105_ 5TCID5tlA).1mL
[0025]CC-CRBOl株病毒含量测定
[0026]将病毒样品作10倍倍比稀释，分别接种到已长满单层的MDBK细胞上，每稀释度重复4孔，同时将直接加入维持液的孔作为空白对照，37°C ,5% CO2培养Ih后，加入维持液，100μ I/孔；然后37°C，5% CO2条件下培养。逐日观察记录细胞病变情况，144h后判定最终结果。按Reed-Muench法计算TCID5tlt5 MDBK细胞:胎胎牛肾细胞，本实验室保存。
[0027]2、生产用毒种的制备和鉴定
[0028]I)细胞培养
[0029]细胞冻存管从液氮中迅速取出，立即放入42°C水浴中，边浸边摇动，使细胞冻存液尽快融化，75%酒精消毒后，打开冻存管盖，吸出细胞悬液，100rpmX 5min，吸弃冻存液，力口入细胞培养液悬浮细胞，接入10ml培养瓶内，37°C，5% CO2的CO2培养箱中培养。当细胞基本长满单层后进行传代，方法是倾弃细胞旧液，用PBS液洗涤2 - 3次，加入0.25%的胰酶(以浸没细胞单层为佳)进行消化，待细胞将要分离而呈圆粒时，加入新鲜细胞培养液终止消化，用吸管反复吹打细胞，直至细胞完全分散，100rpmX 5min离心后吸弃上清，再加新鲜培养液，重新悬浮细胞，按一传二接入新的培养瓶中，置37°C，5% CO2的CO2培养箱中培养。
[0030]2)病毒增殖
[0031]取长满单层的细胞，倾弃旧液，用PBS液洗涤2 - 3次，接种病毒液(用维持液4倍稀释)，37°C，5% CO2培养Ih后，再加维持液，置37°C，5% CO2继续培养。当有75%以上细胞出现致细胞病变(CPE)现象时，收获病毒。
[0032]3)毒种鉴定按基础毒种鉴定项目(《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版:243~245页)进行，合格即为生产用毒种。
[0033]生产用毒种制备及检验结果见表1，从表1可见,制备的生产用毒种符合基础毒种的标准。
[0034]表1.生产用毒种制备及检验结果
[0035]
【权利要求】
1.梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗，所述的梅花鹿粘膜病同源灭活疫苗的其中的病毒液，是将MDBK (牛肾)细胞接种鹿源BVDV (牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)，收获病毒液灭活得到的。
2.根据I所述，梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂，是由终浓度为0.01克/毫升的硬脂酸铝和下述体积份数比的组分组成:
所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗为权利I要求中所述的疫苗。
3.梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗的制备方法，是将接种鹿源BVDV(牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)，挑选在培养72~144小时之间发生细胞病变(CPE)的细胞，收集细胞液，在病毒液中加入甲醛灭活得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述加入甲醛的终浓度为0.15% (体积百分比浓度)。
5.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于:所述胎牛肾细胞为第3~6代，所述培养增殖方法为细胞增殖病毒，所述培养的温度为37摄氏度。
6.权利要求2所述梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂的制备方法，包括下述步骤: 1)油相制备:取注射用白油94体积份，加司本-806体积份，混合后，加硬脂酸铝至浓度为0.02克/毫升，混匀灭菌； 2)水相制备:取吐温-804体积份，灭菌，加入权利要求5~8所述的方法获得的梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗96体积份，振摇使吐温-80完全溶解； 3)乳化:取步骤I)获得的油相与步骤2)获得的水相按照1:1的体积份数比搅拌混匀，得到梅花鹿粘膜病病同源灭活疫苗油乳剂。
【文档编号】A61K9/107GK104174017SQ201410401027
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】丁壮, 董航, 丛彦龙, 尹仁福, 母连志, 张晓东, 周玉龙, 穆昱 申请人:吉林大学